2.2.1.1. Phương pháp phân tử trong đánh giá mối quan hệ di truyền a. Tách chiết ADN tổng số
Tách chiết và tinh sạch ADN các mẫu lily theo phương pháp CTAB của Doyle, (1987)có cải tiến. Sau đó, các mẫu ADN được đo nồng độ và độ tinh sạch bằng máy NanoDrop Lite (Thermo Scientific).
b. Phản ứng PCR
Phương pháp PCR với các mồi RAPD, ISSR (bảng 2.3 và 2.4)được thực hiện trên máy VeritiTM 96 well thermal Cycler (Applied Biosystems, USA). Hỗn hợp với tổng thể tích là 15 l/mẫu gồm những thành phần là 1,8 µl ADN (100 ng/ul); 1,2 µl mồi RAPD hoặc ISSR (10 pmol), 7,5 µl Master Mix2X; 4,5 µl H2O được trộn đều rồi chuyển vào máy PCR và chạy theo chương trình đã cài đặt gồm các bước: bước1: 94ºC trong 4 phút; bước 2: 92ºC trong 1 phút; bước 3: TaºC với mỗi mồi trong 1 phút (trong đó Ta là nhiệt độ bắt cặp từng mồi); bước 4: 72ºC trong 1 phút; bước 5: Lặp lại 40 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4; bước 6: 72ºC trong 10 phút; bước 7: Giữ nhiệt độ 10ºC.
c. Phương pháp phân tích số liệu PCR- RAPD, ISSR
+ Nhị phân hóa sự xuất hiện băng ADN trên bản điện di sản phẩm PCR: Các đoạn ADN xuất hiện hay không trên bảng điện di được mã hóa bằng số tự nhiên 1
và 0, cụ thể, mẫu nào xuất hiện đoạn ADN thì ký hiệu là 1, còn không xuất hiện thì ký hiệu là 0 (Rohlf, 1989).
+ Phân nhóm các mẫu nghiên cứu dựa trên hệ số tương đồng Jaccard: số liệu nhị phân các mẫu được xử lý với phần mềm NTSYS 2.0 để tính hệ số tương đồng di truyền và lập biểu đồ quan hệ di truyền hình cây giữa các đối tượng nghiên cứu (Rohlf, 1989).
+Phân nhóm các mẫu nghiên cứu dựa trên phân tích PCA: sử dụng phần mềm NTYSYS 2.2 để lập biểu đồ phân nhóm 2 chiều dựa trên phân tích PCA (Principal Coordinate Analysis) và qua đó sẽ lập biểu đồ phân nhóm dựa trên khoảng cách di truyền 2 chiều giữa các dòng, giống nghiên cứu (Rohlf, 2000).
2.2.1.2. Phương pháp nuôi cấy mô đánh giá khả năng tái sinh in vitro
Củ lily sau thu hoạch được tách ra thành từng vảy củ riêng rẽ, rửa qua bằng nước xà phòng rồi được rửa sạch dưới vòi nước chảy. Sau đó, chúng được xử lý 20 giây trong cồn 70% và được tráng lại bằng nước cất khử trùng. Tiếp đó, vảy củ được xử lý theo các bước tiếp như sau: (i) lắc trong peroxide hydrogen10% (H2O2) (10 phút), (ii) rửa mẫu lại bằng nước cất khử trùng (10 phút), (iii) lắc trong H2O2 30% (10 phút), (iv) mẫu được rửa lại 3 đến 5 lần bằng nước cất đã khử trùng. Mẫu vảy củ (lát cắt vảy củ) sau khi khử trùng hay lát cắt vảy củ in vitro được cấy vào đĩa petri có môi trường MS đặc (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung đường sacaroza để cảm ứng tạo củ in vitro của các mẫu giống. Mẫu in vitro được đặt ở phòng tối có nhiệt độ từ 25oC - 27oC, độ ẩm là 70%.
2.2.1.3. Phương pháp xác định khả năng chịu nóng in vitro
Để xác định ngưỡng gây chết của lily in vitro ở nhiệt độ cao, củ in vitro được hình thành từ lát cắt vảy củ lily trong đĩa peptri có môi trường MS + 60 g/l sucrose + 7,5 g agar được đặt ở các nhiệt độ khác nhau 37oC ± 1oC và 42oC ± 1oC (theo Yin
et al., 2007). Quan sát sự thay đổi màu sắc của củ lily (theo ngày đối với thí nghiệm ở 37oC ± 1oC và 0,5 ngày đối với thí nghiệm ở 42oC ± 1oC) để xác định tỷ lệ mẫu chết. Ngưỡng gây chết được xác định dựa vào thời gian gây chết hoàn toàn của các mẫu giống. Từ đó xác định chỉ tiêu theo ngày (hoặc 0,5 ngày) tùy thí nghiệm:
Tỷ lệ mẫu sống sót (%) =
Số mẫu sống sót
× 100% Tổng số mẫu nuôi cấy
(Tỷ lệ mẫu chết (%) = 100% - tỷ lệ sống sót (%))
Mẫu chết được xác định khi các mẫu củ nhỏ chuyển hoàn toàn sang màu nâu đen, không còn dấu hiệu của sự sống.