CodA là gen mã hóa choline oxidase, một enzyme chìa khóa trong quá trình tổng hợp và tích lũy glycine betaine (GB), duy trì áp suất thẩm thấu trong tế bào. Gen codA đã được chuyển vào một số loài cây trồng và chúng được tăng cường được khả năng chống chịu nhiệt độ cao điều kiện môi trường như cây Arabidopsis thaliana tăng cường khả năng chịu (Alia et al., 1998), cây cà chua (Shufen et al., 2011). Chính vì vậy, nhằm nâng cao khả năng chịu nóng của ba giống lily Bel, Sor và Yel chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm chuyển 3 cấu trúc gen vào chúng, kết quả thu được như sau:
Bảng 3.14. Khả năng nhận các cấu trúc gen ở 3 giống lily nghiên cứu
Cấu trúc
chuyển gen Giống
Hệ số
nhân củ Tỷ lệ mẫu sống sót sau chọn lọc (%) Hiệu suất chuyển gen (GUS) (%)
(*1) Bel 0,6 12,67 ± 0,016a 7,42 ± 0,019a Yel 1 7,59 ± 0,007a 6,70 ± 0,005a Sor 0,7 12,59 ± 0,015a 4,12 ± 0,011a (*2) Bel 0,7 17,13 ± 0,011a 10,57 ± 0,019a Yel 1 8,42 ± 0,009a 6,17 ± 0,010a Sor 0,5 16,65 ± 0,049a 5,71 ± 0,095a (*3) Bel 0,6 13,63 ± 0,016a 7,24 ± 0,008a Yel 1 9,06 ± 0,060a 7,62 ± 0,039a Sor 0,5 9,09 ± 0,099a 4,94 ± 0,049a
(*1): 35S/Hyg/35SpolyA/35S/codA-cmyc/Nos/ 35S-GUS-Nos (*2): 35S/Hyg/35SpolyA/35S/TP-codA-cmyc/Nos/ 35S-GUS-Nos (*3): 35S/Hyg/35SpolyA/HSP/TP-codA-cmyc/Nos/ 35S-GUS-Nos
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê với p <0.05 (phép thử Duncan)
Qua bảng trên, chúng tôi thấy rằng cả 3 giống lily nghiên cứu đều cho khả năng nhận 3 cấu trúc gen chuyển 35S/Hyg/35SpolyA/35S/codA-cmyc/Nos/ 35S-
GUS-Nos (*1), 35S/Hyg/35SpolyA/35S/TP-codA-cmyc/Nos/35S-GUS-Nos (*2) và 35S/Hyg/35SpolyA/ HSP/ TP-codA-cmyc/Nos/ 35S-GUS-Nos (*3), thể hiện một số lượng khá nhiều các mảnh vảy sống sót trong môi trường chọn lọc với tỷ lệ cao từ (khoảng 7,59% - 17,13%); hệ số chuyển gen (được tính theo sự biểu hiện gen chỉ thị GUS) (Bảng 3.14.) cũng cao và tương đương nhau (khoảng 5,71% - 10,57%).
A B C
Hình 3.27. Sự hình thành và phát triển củ lily in vitro của vảy củ được biến nạp tổ hợp gen đích (gồm gen kháng hygromycin, gen GUS và gen codA)
Ghi chú: A - Củ lily nhỏ hình thành từ lát cắt vảy củ sau biến nạp B - Củ lily chuyển gen phát triển trong môi trường chọn lọc
C – Củ lily chuyển gen phát triển ổn định trong môi trường chọn lọc D – Cây lily chuyển gen chuyển gen hoàn chỉnh trong môi trường chọn lọc
Các giống lily Belladonna (Bel), Yelloween (Yel), Sorbonne (Sor) đều có khả năng nhận 3 cấu trúc mang gen codA mã hóa glycine betaine. Giống Belladonna (Bel) và Yelloween (Yel) có khả năng nhận gen gen đích cao hơn cả với hiệu suất chuyển gen từ 6,17% đến 10,57%, trong khi đó, hiệu suất chuyển gen ở Sorbonne (Sor) là khoảng từ 4,12% đến 5,71%.
Hình 3.28. Cây lily in vitro được chuyển tổ hợp gen đích ( gồm gen kháng hygromycine, gen GUS và gen codA) bắt màu với thuốc nhuộm X-gluc
Một số mẫu cây chuyển gen (đã qua kiểm tra bằng nhuộm X-gluc, hình 3.28) được kiểm tra biểu hiện gen đích (codA) mức độ phiên mã (hình 3.29). Kết quả cho thấy 3/5 mẫu kiểm tra xuất hiện băng vạch có kích thước giống gen codA
và 3/5 mẫu mẫu kiểm tra xuất hiện băng vạch có kích thước giống gen TP-codA
1641bp
1 2 3 4 5 M ĐC 1' 2' 3' 4' 5' M ĐC
A B
Hình 3.29. Ảnh điện di sản phẩm RT – PCR mẫu lily với mồi đặc hiệu gen codA (A) và gen TP-codA (B)
Như vậy, các vector chuyển gen chứa gen codA hoặc TP-codA được điều kiển bởi promoter 35SCAMV hoặc HSP được thiết kế thành công, sẵn sàng phục vụ công tác tạo giống cây trồng có khả năng chống chịu nói chung, cây lily nói riêng. Sự chuyển gen chỉ thị (GUS) đồng thời gen đích (codA) vào lát cắt vảy củ lily in vitro nhờ vi khuẩn A. tumefacience bước đầu được cho là thành công.