Tiến hành lai tạo 9 tổ hợp lai (7 tổ hợp lai xa và 2 tổ hợp lai gần làm đối chứng) bằng phương pháp thụ phấn cắt ngắn vòi nhụy với mục đích giảm rào cản trước thụ tinh (do hạt phấn không nảy mầm trên bầu nhụy hoặc vòi nhụy quá dài làm cho mầm của hạt phấn không tiếp cận được với noãn (Lim & VanTuyl, 2006). Kết quả là sau 7 ngày thụ phấn, tỷ lệ đậu quả ở các tổ hợp khá cao (từ 80% đến 100%, riêng tổ hợp LS là 45,5%). Tuy nhiên, các quả lai bắt đầu teo dần rồi chết sau thụ phấn 15 ngày đến 30 ngày; đặc biệt là ở thời điểm 30 ngày sau thụ phấn, ở các tổ hợp lai LS, LB, không còn quả nào được duy trì. Sau thụ phấn 45 ngày, tất cả các quả lai của các tổ hợp đều bị teo và chết, trừ tổ hợp FS, SF, SB, FL và LF. Điều này được giải thích bởi cơ chế bất hợp sau thụ tinh, đó là quá trình thụ tinh
vẫn diễn ra bình thường nhưng phôi không phát triển được biểu hiện là quả non bị héo và chết sớm (Van Tuyl et al., 1991).
Bảng 3.4. Tỷ lệ tạo quả sau thụ phấn của các tổ hợp lai
STT Tổ hợp lai
(*)
Tỷ lệ tạo quả sau thụ phấn (%)
7 ngày 15 ngày 30 ngày 45 ngày
1 LS 45,5 30,0 0,0 0,0 2 LB 80,0 55,0 0,0 0,0 3 FS 100 84,0 68,0 4,0 4 FB 100 53,0 13,0 0,0 5 SL 100 87,5 44,0 0,0 6 SF 100 89,0 44,0 5,5 7 SB 100 81,0 65,5 45,5 8 FL 100 84,0 84,0 72,0 9 LF 100 92,0 88,0 76,0
(*): chữ cái đứng đầu chỉ dòng làm bố, chữ cái đứng sau chỉ dòng làm mẹ.
Theo tác giả Trịnh Khắc Quang (2012), phương pháp thụ phấn có xử lý vòi nhụy chỉ làm tăng tỷ lệ đậu quả mà không có tác dụng giữ quả; nên chúng tôi thu quả lai non ở trước thời điểm có nguy cơ chết hàng loạt để tiến hành cứu phôi. Chính vì vậy, các quả lai dễ bị chết sớm (ở 6 tổ hợp đầu tiên là LS, LB, FS, FB, SL, SF) thì 7 ngày sau thụ phấn, được cắt lát (dày khoảng 1cm) và nuôi cấy trên môi trường MS+90 g/l saccharose có bổ sung 1,0 mg/l α-NAA. Khi hạt lai trong lát cắt sinh trưởng (khoảng 45 ngày) (hình 3.3.A.a,b,c), chúng được chuyển sang môi trường MS có bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau. Sau khoảng 30 ngày nuôi cấy, số liệu thu được thể hiện ở bảng 3.5.
Ở tổ hợp lai FB, LB, LS, hạt lai không nảy mầm (một số hình thành mô xốp) rồi chết dần. Nguyên nhân là do sự không tương thích giữa các nhóm lily lai với nhau nên phôi hạt không hình thành hoặc hình thành rồi sớm chết (Lim & VanTuyl, 2006). Mô xốp ở hạt lai không phát triển được vì chỉ có tế bào phôi mới có khả năng tái sinh cây còn các tế bào mô xốp không có khả năng tái sinh, sau này sẽ chết dần.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA tới tỷ lệ nảy mầm và tạo củ in vitro từ hạt lai được tách ra từ lát cắt quả non Tổ hợp lai FS SL SF FB LB LS BA (mg/l) (1) (2) (1) (2) (1) (2) (1) (2) (1) (2) (1) (2) 0.0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 4,4 4,4 6,7 6,7 3,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,5 11,1 8,9 8,9 6,7 5,0 1,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 4,4 2,2 4,4 2,2 3,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Ghi chú: (1): Tỷ lệ hạt nảy mầm (%); (2): Tỷ lệ tạo củ từ hạt lai nảy mầm (%) Môi trường nền MS+90g/l saccharose
A B
Hình 3.7. Sự cứu phôi bằng phương pháp nuôi cấy lát cắt bầu nhụy (A); nuôi cấy phôi (B)
A - a: lát cắt bầu nhụy sau thụ tinh;
b,c: hạt non tách ra từ lát cắt bầu nhụy sau 45 ngày nuôi cấy d,e : hạt nảy mầm; f: củ (cây lai còn non) in vitro.
B - a: phôi non; b,c: các kiểu nảy mầm của phôi; d,e,f,g: các kiểu củ (cây lai còn non) in vitro.
Các tổ hợp FS, SL và SF thu được một lượng nhỏ hạt lai nảy mầm (hình 3.7.A.d,e) và tạo củ (hình 3.7.A.f) trên cả 3 môi trường MS có bổ sung BA. Môi trường chứa 0,5 mg/l BA cho tỷ lệ hạt nảy mầm và tỷ lệ hạt nảy mầm thành củ cao nhất (từ 5,0% và 1,7% đối với tổ hợp SF; 8,9% và 6,7% với tổ hợp SL và 11,1% và 8,9% với tổ hợp FS).
Bên cạnh đó, quả lai thu được của các tổ hợp SB, LF và FL sau 45 ngày thụ phấn tách được phôi (hình 3.7.B.a) và tiến hành nuôi cấy cứu phôi. Sau 3 tuần đến 4 tuần nuôi cấy, phôi sinh trưởng và nảy mầm (hình 3.7.B.b,c) hình thành cây hoàn chỉnh (dạng thân củ) (hình 3.7.B.d,e,f,g). Môi trường nuôi cấy có chất kích thích sinh trưởng thực vật thích hợp đã giúp cho phôi nảy mầm thành cây in vitro
hoàn chỉnh (Chi, 2002).