cứu phôi
2.2.2.1. Kiểm tra chất lượng hạt phấn các dòng làm bố
Hạt phấn của các dòng được lựa chọn (có màu sắc đẹp, khả năng sinh trưởng tốt ở điều kiện Việt Nam hay/và được đánh giá có khả năng chịu nóng) được kiểm tra chất lượng thông qua xác định chỉ tiêu tỷ lệ hạt phấn hữu dục – là tỷ lệ giữa số lượng hạt phấn có hình dạng đặc trưng, có màu đậm trên tổng số hạt phấn được nhuộm với Iotdua kali (1%) quan sát được trên kính hiển vi (Stanley & Linskens, 1974; Heslop-Harrison, 1992). Bên cạnh đó, để quyết đinh một dòng có nhiều đặc điểm ưu việt làm dòng đực được hay không, chúng ta cũng cần khảo sát khả năng nảy mầm của hạt phấn trên môi trường nuôi cấy nhân tạo có một số thành phần giống thành phần các chất trên bề mặt vòi nhụy (Soares et al., 2008). Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng môi trường tối ưu cho nảy mầm hạt phấn lily là 30 g/l saccarozo + 8 g/l agar + 20 mg/l acid boric (là kết quả thí nghiệm khảo sát, không trình bày ở đây).
2.2.2.2. Kỹ thuật thụ phấn cắt ngắn vời nhụy và xác định tỷ lệ đậu quả
Các giống có hạt phấn đạt chất lượng cao được sử dụng làm dòng bố và tiến hành lai với một trong các giống còn lại bằng việc sử dụng phương pháp thụ phấn với kỹ thuật cắt ngắn vòi nhụy (còn 1 mm - 3 mm) ở cây làm mẹ (Lim & VanTuyl, 2006). Các dòng bố mẹ được bố trí (trồng) theo khối ngẫu nhiên, số lượng mẫu mỗi dòng làm bố mẹ từ 60 cây - 80 cây. Mỗi cây ra hoa trung bình có 3 đến 5 bông/cây/giống. Tiến hành thụ phấn, đánh dấu tổ hợp lai và xác định tỷ lệ
đậu quả sau 7 ngày, 15 ngày, 30 ngày và 45 ngày thụ phấn là tỷ lệ số quả còn tươi trên cây trên tổng số hoa được thụ phấn của mỗi tổ hợp lai.
2.2.2.3. Cứu phôi
Tùy vào tuổi thọ của quả lai mà tiến hành cứu phôi theo phương pháp khác nhau:
a. Kỹ thuật nuôi cấy lát cắt bầu nhụy sau thụ tinh:
Phương pháp này được áp dụng với tổ hợp có tỷ lệ quả lai teo chết sớm (sau thụ phấn 15 ngày - 30 ngày) thì ở thời điểm sau thụ phấn từ 7 ngày - 15 ngày, quả của chúng được thu về, khử trùng bề mặt và nuôi cấy bằng kỹ thuật cắt lát quả (phương pháp cứu phôi bằng nuôi cấy lát cắt bầu nhụy). Những quả này được cắt thành lát mỏng (0,5 cm) và nuôi trên môi trường MS + 90 g/l saccharose có bổ sung 1,0 mg/l α-NAA (α-NAA là một chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm auxin để kích thích sự phát triển của lát cắt quả lai non, tạo điều kiện nuôi lớn hạt lai bên trong lát cắt) (Chi, 1999). Hạt trong lát cắt quả non (lát cắt bầu nhụy sau thụ tinh) sau một thời gian (khoảng 45 ngày) sinh trưởng lớn lên về kích thước được đưa sang môi trường nuôi cấy có BA nhằm tăng khả năng nảy mầm của chúng (VanTuyl et al., 1991). Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành tách lấy hạt in vitro và nuôi chúng trong môi trường MS có bổ sung BA ở các nồng độ 0 mg/l; 0,1 mg/l; 0,5 mg/l và 1 mg/l. Sau khoảng 30 ngày nuôi cấy, xác định tỷ lệ hạt nảy mầm và tỷ lệ tạo củ từ hạt nảy mầm (theo phương pháp của Lim & VanTuyl, 2006).
b. Kỹ thuật nuôi cấy phôi:
Phương pháp này được áp dụng với các tổ hợp có tuổi thọ cao hơn (khoảng 60 ngày tuổi). Sau thụ phấn khoảng 45 ngày tiến hành thu quả, tách phôi (quan sát được trong kính hiển vi quang học) (Lim & VanTuyl, 2006) và nuôi cấy phôi trong môi trường MS + 30 g/l saccharose + 0,01 mg/l NAA + 0,1 mg/l BA để tạo củ in vitro (VanTuyl et al., 1991).
2.2.2.4. PCR- RAPD, ISSR và phương pháp phân tích số liệu trong xác định con lai
Sau khi có kết quả điện di trên gel agarose 0,8%, chúng tôi tiến hành so sánh các băng vạch ADN của con lai so với bố và mẹ có mặt hay vắng mặt ở bản điện di. Theo Beata (2007), có thể tiến hành so sánh hình ảnh điện di các băng vạch ADN của sản phẩm PCR dòng làm bố, mẹ và dòng con lai để chứng tỏ bước đầu việc tạo con lai thành công. Cụ thể là, nếu có băng ADN có kích thước nhất định xuất hiện bất kì dòng ở con lai hay dòng làm bố (hoặc mẹ) thì ký hiệu “+”; các giếng còn lại không xuất hiện thì ký hiệu là “-”. Dựa vào mức độ xuất hiện của các băng này, chúng ta có thể đánh giá được con lai được xem xét có phải là con lai thực sự không và con lai đó có quan hệ với bố hoặc mẹ chúng. Nếu cá thể con có băng vạch của cả bố lẫn mẹ thì đó là con lai của tổ hợp lai đó. Nếu con lai nào hoàn toàn giống bố hoặc mẹ ở tất cả các chỉ thị nghiên cứu thì con lai đó là tự thụ của dòng bố hoặc mẹ tương ứng.
Tiến hành xử lý số liệu và lập biểu đồ phân loại: Các số liệu các vạch băng xuất hiện thu được từ bảng điện di được đưa vào xử lý theo chương trình NTYSYS 2.2 (Rohlf, 2000) để lập biểu đồ phân nhóm 2 chiều dựa trên phân tích PCA (Principal Coordinate Analysis) qua đó sẽ lập biểu đồ phân nhóm dựa trên khoảng cách di truyền 2 chiều giữa con lai và dòng bố mẹ.
2.2.2.5. Chọn dòng con lai có khả năng chịu nóng
Để chọn dòng lily lai in vitro có khả năng chịu nóng, mô vảy củ (lát cắt vảy củ 3 mm- 5 mm) được nuôi cấy trong môi trường MS + 60 g/l sucrose + 7,5 g agar và nuôi ở điều kiện cận ngưỡng gây chết, tiếp đó chuyển sang môi trường nuôi cấy bình thường (để phục hồi). Tiến hành xác định khả năng sống sót của các mẫu thí nghiệm tại các thời gian 10 ngày và 30 ngày phục hồi.
Xác định tỷ lệ sống sót sau sốc nhiệt (10 ngày và 30 ngày) (%) =
Số mẫu sống sót sau phục hồi
x 100 Tổng số mẫu đem sốc nhiệt