KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TRÊN NEM CHUA

Nem chua là một sản phẩm lên men truyền thống rất phổ biến của Việt Nam, được ưa thích bởi vị chua tự nhiên và cấu trúc giòn, dai đặc trưng. Tuy nhiên, bên cạnh đó, vấn đề chất lượng vệ sinh đang là mối quan tâm hàng đầu của người tiêu dùng lẫn người sản xuất.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TRÊN NEM CHUA

Họ và tên sinh viên: TRẦN THỊ THANH THẢO

Ngành: BẢO QUẢN CHẾ BIẾN NÔNG SẢN VÀ VI SINH THỰC PHẨM Niên khóa: 2006 - 2010

Tháng 08/2010

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN

LACTIC PHÂN LẬP TRÊN NEM CHUA

Tác giả

TRẦN THỊ THANH THẢO

Khóa luận được đệ trình đề để đáp ứng yêu cầu

cấp bằng Kỹ sư ngànhBảo quản chế biến nông sản và vi sinh thực phẩm

Giáo viên hướng dẫn:

Tiến sĩ Hồ Thị Nguyệt Thu

Tháng 08/2010

LỜI CẢM TẠ

Với tấm lòng tôn sư trọng đạo, em xin chân thành cảm ơn Qúy Thầy Cô Trường Đại học Nông Lâm, đặc biệt là các Thầy Cô Khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình dạy bảo trong những năm vừa qua, truyền đạt những kiến thức quý báu để làm hành trang cho em bước vào đời

Xin chân thành cảm ơn Cô Hồ Thị Nguyệt Thu đã tận tình hướng dẫn, truyền thụ kinh nghiệm, cũng như tạo những điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Xin ghi nhớ công ơn của Cha Mẹ đã không quản mọi gian lao khó nhọc và sự

hy sinh cao cả để cho con có được ngày hôm nay

Xin gửi đến những người thân yêu, các anh chị và các bạn lớp DH06VT lời cảm

ơn sâu sắc

Sinh viênTrần Thị Thanh Thảo

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên các mẫu nem ở 5 cơ sở khác nhau Trong

đó, 3 cơ sở (Bà Chín, Ninh Hòa và Năm Thu) sử dụng lên men tự nhiên trong khi 2 cơ

sở còn lại (Vissan và Giáo Thơ) thực hiện lên men có định hướng pH bột thịt được đo lường vào ngày lên men thứ tư của nem chua Vi khuẩn lactic trong bột thịt nem ngày này cũng được đếm tổng lượng, phân lập, khảo sát các đặc tính sinh hóa và tìm hiểu khả năng sinh bacteriocin của chúng

Kết quả đo lường cho thấy, pH bột thịt ngày thứ 4 ở ba cơ sở lên men tự nhiên khác nhau không có ý nghĩa (p > 0,05); trong đó, nem ở cơ sở Năm Thu có giá trị pH thấp nhất (4,34  0,03) Đối với hai cơ sở lên men có định hướng, phân tích thống kê cho thấy pH bột thịt ngày 4 của chúng khác nhau một cách có ý nghĩa (p ≤ 0,05); trong

đó, Vissan có giá trị pH thấp hơn (4,15  0,03)

Tổng lượng vi khuẩn lactic ngày 4 của các mẫu nem ở 3 cơ sở lên men tự nhiên khác nhau một cách có ý nghĩa (p ≤ 0,05) Nem ngày 4 của cơ sở Năm Thu (1,62.108 CFU/g) cao hơn hai cơ sở còn lại (lần lượt là 1,43.108 và 1,29.108 CFU/g) Đối với 2

cơ sở lên men có định hướng, Vissan và Giáo Thơ, tổng lượng vi khuẩn lactic (lần lượt

là 1,15.109và 3,08.108CFU/g) cao hơn rất nhiều so với 3 cơ sở lên men tự nhiên Giữa hai cơ sở lên men định hướng, sự khác biệt về tổng lượng vi khuẩn lactic nem ngày 4

là rất có ý nghĩa (p ≤ 0,001)

Chúng tôi ghi nhận được 7 dạng vi khuẩn lactic tại 5 cơ sở khảo sát; trong đó,

đa phần có dạng que (chiếm 81,82% các chủng vi khuẩn kiểm tra)

Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic, chúng tôi nhận thấy có 01 chủng vi khuẩn thuộc dạng VII ở nem Ninh Hòa có khả năng kháng lại

Staphylococcus aureus ssp aureus CIP 20256 và 01 chủng dạng I của nem Ninh Hòa

kháng lại Salmonella indiana LMBA.

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i

Lời cảm tạ ii

Tóm tắt iii

Mục lục v

Danh sách chữ viết tắt viii

Danh sác các hình ix

Danh sách các bảng ix

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Thực phẩm lên men và triển vọng phát triển 3

2.2 Nem chua – Sản phẩm thịt lên men của Việt Nam 4

2.3 Quá trình lên men lactic 5

2.4 Khái quát về vi khuẩn lactic 5

2.5 Một số vi khuẩn lactic thường dùng trong thực phẩm 6

2.5.1 Lactobacillus 6

2.5.2 Lactococcus 7

2.5.3 Leuconostoc 7

2.5.4 Streptococcus 7

2.5.5 Pediococcus 8

2.6 Bacteriocin 8

2.6.1 Khái niệm chung 8

2.6.2 Phân loại 9

2.6.2.1 Lớp I 9

2.6.2.2 Lớp II 10

2.6.2.3 Lớp III 11

2.6.3 Cơ chế hoạt động 11

2.6.4 Lợi ích và hạn chế của bacteriocin 12

2.6.4.1 Lợi ích của bacteriocin 12

2.6.4.2 Hạn chế của bacteriocin 13

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 14

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 14

3.2.1 Môi trường và thiết bị phân tích 14

3.2.2 Nguyên vật liệu thí nghiệm 14

3.3 Nội dung nghiên cứu 15

3.4 Phương pháp nghiên cứu 15

3.4.1 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic trên nem ngày bốn của năm cơ sở khảo sát 17

3.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu 17

3.4.1.2 Đồng nhất mẫu 17

3.4.1.3 Kỹ thuật đo pH 17

3.4.1.4 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic 17

3.4.1.5 Đếm khuẩn lạc và cấy chuyền 18

3.4.2 Định danh sơ bộ vi khuẩn lactic phân lập 19

3.4.2.1 Nhuộm Gram 19

3.4.2.2 Phản ứng catalase 19

3.4.2.3 Khảo sát khả năng di động 19

3.4.2.4 Kiểm tra kiểu lên men 19

3.4.2.5 Khảo sát khả năng sinh acid lactic 20

3.4.3 Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic phân lập 20

3.4.3.1 Thu hoạch dịch ly tâm 20

3.4.3.2 Khảo sát sơ bộ khả năng sinh bateriocin của các chủng vi khuẩn phân lập 20

3.4.3.3 Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng lactic phân lập bằng phương pháp khuếch tán trên thạch 21

3.5 Xử lý thống kê số liệu thu thập 22

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic của nem chua sau 4 ngày lên men ở năm cơ sở khảo sát 23

4.1.1 Giá trị pH và tổng lượng vi khuẩn lactic của nem chua lên men ngày 4 ở 5 cơ sở khảo sát 23

4.1.2 Phần trăm các dạng khuẩn lạc của nem chua lên men ngày 4 ở 5 sơ sở khảo sát 25

4.2 Tính chất sinh hóa của những dạng khuẩn lạc phân lập 31

4.3 Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng vi khuẩn lactic phân lập 33

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Đề nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

PHỤ LỤC 41

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

CFU: Colony Forming Unit

LAB: Lactic Acid Bacteria

EMP: Embden - Meyerhof - Parnas pathway

MRS

NB

MRD

TSA

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Cấu trúc của nisin 10

Hình 3.1: Tiến trình thực hiện các khảo sát 16

Hình 3.2: Trình tự pha loãng cho việc đếm vi khuẩn lactic 18

Hình 3.3: Vùng kháng khuẩn của dịch bacteriocin trên đĩa petri 22

Hình 4.1: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng I 26

Hình 4.2: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng II 26

Hình 4.3: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng III 27

Hình 4.4: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng IV 27

Hình 4.5: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng V 28

Hình 4.6: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng VI 28

Hình 4.7: Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng VII 28

Hình 4.8: Sự chuyển màu của dung dịch trong khảo sát khả năng sinh acid lactic của vi khuẩn 33

Hình 4.9: Vùng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn dạng VII đối với Staphylococcus aureus ssp aureus CIP 34

Hình 4.10: Vùng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn dạng I đối với Salmonella indiana LMBA 35

DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1: Giá trị pH và tổng lượng vi khuẩn lactic của nem chua ngày 4 ở năm cơ sở khảo sát 23

Bảng 4.2: Phần trăm các dạng khuẩn lạc của nem chua ngày 4 ở năm sơ sở khảo sát 29

Bảng 4.3 Tính chất sinh hóa của những dạng khuẩn lạc phân lập .32

hộ gia đình theo phương thức lên men tự nhiên nên chất lượng sản phẩm thường không ổn định Mặt khác, nem chua là sản phẩm thường được tiêu thụ sống sau 3 - 4 ngày lên men mà không qua chế biến Do đó, vấn đề về vệ sinh hiện là mối quan tâm cấp bách của người tiêu dùng lẫn nhà sản xuất Ngày nay, việc sử dụng những chất kháng khuẩn hóa học trong thực phẩm bị người tiêu dùng từ chối vì những lí do sức khỏe Do đó, liệu có thể tìm ra các chủng vi sinh vật khởi động vừa có khả năng định hướng quá trình lên men, đảm bảo tính ổn định và cải thiện chất lượng sản phẩm vừa

có khả năng sinh ra những chất có khả năng kháng lại các vi khuẩn gây bệnh?

Trước những yêu cầu trên, vi khuẩn lactic (LAB) là nhóm vi khuẩn được chú ý nhiều nhất Những vi khuẩn này được sử dụng lâu đời với mục đích acid hóa nguyên liệu thông qua việc sản sinh các acid hữu cơ, đặc biệt là acid lactic; mặt khác, chúng còn có khả năng sinh ra các hợp chất có khả năng kháng khuẩn quan trọng trong việc bảo quản thực phẩm như: hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl, bacteriocin, reuterin và reutericyclin (Ouwehand và Vesterlund, 2004) Trong đó, bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn được quan tâm nhiều nhất Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh một vài giống vi khuẩn lactic có khả năng sản sinh bacteriocin kháng lại

các vi sinh vật gây hư hỏng trong thực phẩm như: Listeria monocytogenes,

Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella…

Đề tài “Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập trên nem chua” được thực hiện nhằm tìm ra các chủng vi khuẩn lactic có khả năng đề

kháng với các vi sinh vật gây bệnh, tạo tiền đề cho chế biến nem chua có chất lượng

ổn định cũng như an toàn về mặt vi sinh

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU

Đề tài này được thực hiện nhằm mục đích khảo sát khả năng tạo bacteriocin của một số vi khuẩn lactic hiện diện trong nem chua Qua đó hi vọng sẽ cải thiện nem chua thành một thực phẩm chức năng có lợi cho sức khỏe

Yêu cầu thực hiện:

 Phân lập vi khuẩn lactic trên 5 loại nem lên men ngày 4

 Thực hiện các phản ứng sinh hóa tiền định danh vi khuẩn lactic

 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các vi khuẩn lactic phân lập được

Chương 2

TỔNG QUAN

2.1 THỰC PHẨM LÊN MEN VÀ TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN

Lên men là một trong những công nghệ lâu đời nhất được sử dụng để bảo quản thực phẩm Trong lịch sử, việc lên men thực phẩm đã được khởi xướng cách đây ít nhất 6000 năm (Holzapfef, 2000) Bắt nguồn từ các nước đang phát triển, quá trình lên men không chỉ nhằm mục đích bảo quản mà còn góp phần đa dạng hóa thực phẩm với chi phí phải chăng đáp ứng cho người tiêu dùng có thu nhập thấp (Kalui và ctv, 2010)

Hiện nay, nhiều loại thực phẩm lên men được sản xuất trên toàn thế giới ở qui

mô hộ gia đình cũng như ở qui mô công nghiệp Sự phổ biến rộng rãi của thực phẩm lên men cho thấy tầm quan trọng cũng như sự ưa chuộng ngày càng tăng của các sản phẩm này trên thế giới Trong một số vùng, đặc biệt ở châu Phi, những thực phẩm này còn được sử dụng làm thực phẩm cai sữa cho trẻ nhỏ (Lei và Jakobsen, 2004; trích dẫn bởi Kalui và ctv, 2010)

Các nghiên cứu được thực hiện đã cho thấy những thuộc tính vô giá của sản phẩm lên men Quá trình lên men tạo ra các hợp chất chuyển hóa góp phần cải thiện mùi vị và chất lượng dinh dưỡng của sản phẩm Bên cạnh đó, một số sản phẩm của quá trình sinh tổng hợp như acid lactic, ethanol, acetaldehyd, acid pyruvic,… làm thay đổi pH và giúp ức chế hiệu quả các vi sinh vật gây bệnh Điều này tăng cường tính an toàn và kéo dài tuổi thọ cho sản phẩm một cách đáng kể (Motarjemi, 2002) Thêm vào

đó, các enzyme ngoại sinh trong nguyên liệu lên men cũng góp phần cải thiện những đặc tính trên (Holzapfel, 2000)

Việc sử dụng giống khởi động vào việc sản xuất các sản phẩm lên men ngày càng được áp dụng rộng rãi như một phương pháp để rút ngắn thời gian sản xuất, nâng cấp sản phẩm lên men về mặt chất lượng, tính ổn định cũng như tuổi thọ cho sản phẩm (Rolle và Satin, 2002) Một số vi sinh vật có lợi trong quá trình lên men được nghiên cứu như vi khuẩn lactic cho thấy rằng chúng có khả năng sản sinh ra các chất kháng

sinh có lợi cho sức khỏe, tạo tính an toàn và bảo quản lâu dài cho sản phẩm (Kalui và ctv, 2010).

Thực phẩm lên men ngày nay rất đa dạng, chế biến từ các dạng nguyên liệu khác nhau như thịt, trái cây, rau quả, ngũ cốc,… Với những tiến bộ hiện nay về khoa học kĩ thuật, quá trình lên men không còn sản xuất ở qui mô thủ công và tiến hành tự nhiên như trước đây nữa mà đã phát triển ở qui mô công nghiệp với sự lên men chủ động nhờ việc sử dụng các giống khởi động để đáp ứng không chỉ về chất lượng mà còn về số lượng cho người tiêu dùng (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

2.2 NEM CHUA - SẢN PHẨM THỊT LÊN MEN CỦA VIỆT NAM

Nem chua là một sản phẩm thịt lên men truyền thống ở Việt Nam Tùy theo từng vùng miền sản xuất mà nem chua gắn với những tên gọi nổi tiếng như nem Thủ Đức, nem Lai Vung, nem Bình Dương… Phần lớn sản phẩm được sản xuất thủ công, tùy theo kinh nghiệm của từng hộ gia đình mà chất lượng và khả năng bảo quản nem chua rất khác nhau Bản chất của quá trình lên men là một quá trình chuyển hóa đường

thành acid lactic nhờ hoạt động của vi khuẩn Lactobacillus, Pediococcus và

Micrococcus Trong đó, đóng vai trò quan trọng là các Lactobacillus (Nguyễn Đức

Lượng, 2006; Hồ Thị Nguyệt Thu và ctv, 2008)

Theo kinh nghiệm của các nhà chế biến, thịt dùng trong sản xuất nem chua phải

là thịt “nóng”, thịt có từ thú mới vừa giết mổ Thịt được làm nhuyễn bằng cách xay hoặc giã; sau đó, trộn với da heo đã được luộc chín và cắt thành sợi nhuyễn, cùng các chất phụ gia và gia vị Hỗn hợp thịt sẽ được tạo thành viên có trọng lượng khoảng 15 -

20 g, kế tiếp được gói bằng lá vông, lá chùm ruột hay lá ổi, và được bao phủ bên ngoài bằng nhiều lớp chuối dày (Nguyễn Thị Minh Uyên, 2008) Nhìn chung, quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ phòng (khoảng 28 - 30oC) trong thời gian từ 3 - 4 ngày Trong thời gian này, các vi khuẩn lactic hoạt động mạnh và chuyển hóa đường thành acid lactic Acid lactic được tạo thành sẽ làm giảm pH của bột thịt, làm thay đổi cấu trúc của bột thịt, bột thịt trở nên chặc hơn, tạo vị chua cần thiết cho sản phẩm và làm

ức chế sự phát triển của những vi sinh vật gây thối Nem chua được ăn tươi mà không cần nấu hay làm nóng Với kiểu sử dụng này, người tiêu dùng tận hưởng được những

lợi ích cho sức khỏe do các vi khuẩn lactic còn sống trong sản phẩm mang lại (Nguyen

và ctv, 2010)

Sản phẩm nem được đánh giá là đạt chất lượng khi bề mặt sản phẩm không bị nhớt hoặc nấm mốc, bột thịt dai, không nhão, có vị chua ngọt vừa phải Nem chua có thời hạn sử dụng ngắn, tối đa là 3 ngày khi bảo quản ở nhiệt độ môi trường Nếu muốn kéo dài thời hạn sử dụng, sản phẩm cần được bảo quản ở nhiệt độ lạnh (khoảng 1 tháng ở nhiệt độ từ 4 - 10oC)

2.3 QUÁ TRÌNH LÊN MEN LACTIC

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường trong điều kiện kị khí (bắt buộc hay tùy nghi) thành acid lactic Người ta tìm thấy các vi khuẩn (vi khuẩn lactic,

Bacillus), các tảo (Chlorella), một vài loại nấm mốc thủy sinh, các protozoa, cũng như

các cơ bắp của động vật đều có khả năng lên men lactic (Vương Thị Việt Hoa, 2006)

Dựa vào sản phẩm sinh ra trong quá trình lên men, người ta chia vi khuẩn lactic thành 2 nhóm là lên men đồng hình và lên men dị hình

Các vi khuẩn tham gia như Streptococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Lb

delbruikii, Lb acidophilus,… (Vương Thị Việt Hoa, 2006).

 Lên men dị hình

Các vi khuẩn lên men lactic dị hình thiếu các enzyme chủ yếu của con đường EMP Chúng phân giải kị khí đường glucose chủ yếu theo con đường pentophosphat (PP)

Ngoài sản phẩm là acid lactic (40%) còn tạo ra một lượng lớn các sản phẩm khác như acid succunic và ethanol (20%), acid acetic (10%), CO2và H2 (20%)

Các vi khuẩn tham gia bao gồm Bacterium pentoaceticum, Lactobacterium

casei, Lb plantarum, Lb bifrementans, Leuconostoc casei, Le cremoris.

2.4 KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN LACTIC

Vi khuẩn lactic (LAB) là nhóm vi khuẩn Gram (+), có dạng trực khuẩn, cầu khuẩn hay cầu trực khuẩn, nhìn chung không di động, không sinh bao tử và các đặc tính sinh hóa âm tính khác như catalase, nitrate reductase và cytorome oxydase (Lý Ngọc Quí, 2006) Chúng có thể hô hấp kỵ khí hoặc kỵ khí tùy ý Khoảng nhiệt độ thích hợp cho các vi khuẩn lactic hoạt động khá rộng Các vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ tối thích từ 25 - 37oC, các loài ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích từ 50 - 65oC, nhóm ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ 5oC hoặc thấp hơn (Nguyễn Thị Minh Uyên, 2008)

Vi khuẩn lactic được ứng dụng lâu đời trong nhiều loại thực phẩm lên men có nguồn gốc động hoặc thực vật vì các tác động có lợi của chúng về dinh dưỡng, cảm quan và cải thiện tuổi thọ sản phẩm

Vi khuẩn lactic có khả năng tạo ra các hợp chất kháng khuẩn Trong đó, việc sản sinh acid lactic và acid acetic là quan trọng nhất Tuy nhiên một số chủng vi khuẩn lactic còn được biết đến bởi việc sản sinh các phân tử có hoạt tính sinh học như ethanol, acid formic, các acid béo, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterin, reutericyclin,… Nhiều giống cũng sản sinh các bacteriocin và những phân tử thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tương tự bacteriocin (De Vuyst và Leroy, 2007)

2.5 MỘT SỐ VI KHUẨN LACTIC THƯỜNG DÙNG TRONG THỰC PHẨM

Một số giống vi khuẩn lactic nồng cốt liên quan đến quá trình lên men thực

phẩm như Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus.

2.5.1 Lactobacillus

Lactobacillus là giống lớn nhất trong LAB với hơn 80 loài và phân loài được

công nhận (Limsowtin và ctv, 2002) Đây cũng là nhóm loài rất hỗn tạp với sự đa dạng

về các đặc tính lý hóa, sinh hóa và kiểu hình nhưng chủ yếu là dạng que (Axelsson,

2004) Các Lactobacillus là những vi khuẩn Gram (+), không sinh bào tử, thỉnh thoảng

cặp đôi hoặc tạo thành chuỗi, không di dộng và catalsae âm tính

Phân bố rất nhiều trong tự nhiên và nhiều loài đã được ứng dụng trong thực phẩm, nhóm vi khuẩn này được ghi nhận là chịu acid cao nhất, có mặt trong cơ thể người (khoang miệng, đường tiêu hóa, ), và trong một số thực phẩm lên men như thịt,

sữa, rau quả, ngũ cốc, (Axelsson, 2004) Một số loài như Lb casei, Lb plantarum,

Lb brevis,… tham gia trong quá trình làm chín phô mai; Lb delbrueckii subsp bulgaricus là một trong hai loài vi khuẩn cho phép sử dụng trong lên men yogurt

(Limsowtin và ctv, 2002)

2.5.2 Lactococcus

Lactococcus có dạng hình cầu hoặc hình trứng, thường bắt cặp hoặc thành

chuỗi Có 5 loài Lactococcus (Lactococcus lactis, Lc garvieae, Lc plantarum, Lc

piscium và Lc raffinolactis) hiện đang được công nhận Tuy nhiên, chỉ có Lc lactis subsp lactis và Lc lactis subsp cremoris mới được sử dụng trong quá trình lên men

thực phẩm (Limsowtin và ctv, 2002)

Lactococcus lactis được phân lập từ sữa và các sản phẩm chế biến từ sữa Có

khả năng vi khuẩn này nhiễm vào sữa trong quá trình vắt sữa và cho ăn Lc

raffinolactis được phân lập từ sữa chưa tiệt trùng, từ đường ruột động vật và từ các

môi trường trang trại nuôi bò Lc garvieae và Lc piscium gây bệnh ở các loài cá, Lc

garvieae cũng liên quan tới bệnh viêm vú bò và nhiễm trùng ở người.

Một số chủng Lc lactis subsp lactis có khả năng chuyển hóa citrate, sản sinh

CO2, diacetyl và các chất trung gian khác tạo hương thơm cho sản phẩm (ví dụ như bơ

và phô mai Gouda) Nisin, một bacteriocin peptide sản sinh bởi các giống Lactococcus

có sẵn trong thương mại được coi như là một phụ gia bền acid, được sử dụng để kéo dài thời gian bảo quản thông qua việc ức chế hệ vi sinh vật Gram dương trong thực phẩm (Limsowtin và ctv, 2002)

2.5.3 Leuconostoc

Leuconostoc có dạng hình cầu xếp chuỗi hoặc bắt cặp, lên men dị hình Chúng

thường được tìm thấy trên lá, ngũ cốc, nho và các cụm hoa Những vi khuẩn này phát triển ở 20 - 30oC và không phát triển ở 45oC Leuconostoc (đặc biệt là Ln lactis và Ln

mesenteroides) có vai trò quan trọng trong việc lên men sữa do chúng có khả năng

sinh CO2và một lượng đáng kể diacetyl từ citrate trong sữa (Axelsson, 2004) Diacetyl

là hợp chất chính tạo hương cho bơ chua, kem chua và phô mai tươi, còn CO2thì đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành mắt phô mai Ngoài ra, nhóm vi khuẩn này còn đóng vai trò chủng khởi động trong việc lên men tự nhiên của rau quả (ví dụ như dưa cải)

2.5.4 Streptococcus

Nhóm vi khuẩn này có dạng hình cầu hoặc hình trứng, kết đôi hay dạng chuỗi,

lên men đồng hình Hiện đã có trên 50 loài Streptococus được nhận biết, những vi

khuẩn này phân bố chủ yếu trong xoang miệng và ở đường hô hấp Một số

Streptococcus như Sp mutans là tác nhân gây bệnh sâu răng và viêm màng tim

chúng có thể dẫn đến việc hình thành diacetyl/acetoin tạo ra vị bơ Pe acidilactici và

Pe pentosaceus được sử dụng như các chủng khởi động cho việc làm xúc xích lên

men Pediococcus cũng tham gia vào quá trình làm chín phô mai góp phần làm tăng

hương vị cho phô mai (Axelsson, 2004)

2.6 BACTERIOCIN

2.6.1 Khái niệm chung

Bacteriocin là các peptide được sản sinh tự nhiên bởi một vài vi khuẩn để ức chế sự phát triển của các vi sinh vật cạnh tranh khác, chúng có phổ kháng khuẩn hẹp, chủ yếu là ức chế các loài gần với các chủng sản sinh bacteriocin (Parada và ctv, 2007) Những hợp chất này được tìm thấy trong hầu hết các loại vi khuẩn nhưng chỉ có một số loài trong chúng được nghiên cứu kĩ Hiện nay các bacteriocin sản sinh bởi LAB được quan tâm nhiều nhất vì LAB được coi là vi khuẩn an toàn cho người tiêu dùng do chúng và các chất chuyển hóa của chúng không tạo nên những tác dụng phụ khi được sử dụng trong các thực phẩm lên men (Ruiz-Larrea và ctv, 2005) Các

bacteriocin sản sinh bởi LAB có những ứng dụng quan trọng trong bảo quản thực phẩm Những vi khuẩn lactic này tạo ra các protein miễn dịch đặc hiệu để tự bảo vệ, chống lại tác động kháng khuẩn của bacteriocin của chúng (Cintas và ctv, 2001).

Có thể nói nghiên cứu đầu tiên và lâu đời nhất về bacteriocin là công trình

nghiên cứu của Gratia và ctv vào năm 1925 về khả năng kháng khuẩn của Escherichia

coli (colicin V) (Desriac và ctv, 2010; Ruiz-Larrea và ctv, 2005) Thuật ngữ

bacteriocin không xuất hiện cho đến những năm 1950 Định nghĩa về bacteriocin đầu tiên đã dựa trên đặc tính của colicin, đó là một chất sinh tổng hợp gây tử vong, phổ hoạt động hẹp bị giới hạn ở những loài tương tự như vi khuẩn sản xuất Ba chủng vi

khuẩn Gram (+) được nghiên cứu cho việc sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là: Bacillus sp.; Listeria sp và Staphylococcus sp Các nghiên cứu trong những năm 1980 đã cho

thấy có sự gia tăng đáng kể về số lượng các công bố trên bacteriocin Từ thời điểm này bắt đầu bùng nổ những nghiên cứu về bacteriocin, định hướng như một chất kháng khuẩn an toàn trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm (Desriac và ctv, 2010)

2.6.2 Phân loại

Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên việc phân loại các bacteriocin vẫn chưa được xác định rõ ràng và nó vẫn đang là vấn đề tranh cãi Các bacteriocin thường được phân loại kết hợp với các tiêu chí khác nhau Những tiêu chí chính là họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng và cuối cùng là trình

tự chuỗi amino acid (Desriac và ctv, 2010) Một cách tổng quát, bacteriocin được chia thành 3 lớp: lớp I, lớp II và lớp III

2.6.2.1 Lớp I

Bacteriocin lớp I hay còn được gọi là Lanbiotic là những peptide nhỏ (<5 kDa), bền nhiệt và tác động lên cấu trúc màng Một thành viên nổi tiếng của nhóm này là nisin (Parada và ctv, 2007) Các Lanbiotic được chia thành 2 phân lớp là Ia và Ib dựa trên sự tương đồng cấu trúc

a) Phân lớp Ia

Phân lớp Ia gồm các peptide dạng thuôn dài, linh hoạt và tích điện dương, chúng hoạt động bằng cách hình thành các lỗ trong màng tế bào chất của các loài vi khuẩn nhắm đến (Ouwehand và Vesterlund, 2004)

Nisin thuộc nhóm này Đây là một peptide được hình thành bởi 34 amino acid

Có 2 biến thể của nisin được ghi nhận là nisin A và nisin Z, chúng chỉ khác nhau bởi amino acid thứ 27: histidine trong nisin A được thay thế bởi asparagin trong nisin Z

Cấu trúc của nisin được thể hiện ở Hình 2.1

Hình 2.1: Cấu trúc của nisin (Nguồn: Ruiz-Larrea và ctv, 2005)

Loại bacteriocin này, được sản xuất bởi một vài chủng Lactococcus lactic, được

sử dụng như một chất phụ gia trong thực phẩm Nó có phổ kháng khuẩn Gram (+)

rộng, E coli và các vi khuẩn Gram (-) khác chỉ bị ảnh hưởng bởi nisin khi màng ngoài

của chúng bị phá hỏng Nisin được cho là có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả đối với

Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, các tế bào sinh dưỡng của Bacillus

spp và Clostridium spp (Ouwehand và Vesterlund, 2004) Chúng được sử dụng chủ

yếu trong các thực phẩm đóng hộp và các sản phẩm từ sữa, đặc biệt trong sản xuất phô

mai, nhằm chống lại các vi sinh vật chịu nhiệt như Bacillus và Clostridium (Deegan và

ctv, 2006; trích dẫn bởi Parada và ctv, 2007) Nisin cũng được ghi nhận có hiệu quả chống lại các bệnh viêm vú do vi khuẩn Gram (+) gây ra (Broadbent và ctv, 1989; trích dẫn bởi Parada và ctv, 2007)

b) Phân lớp Ib

Phân lớp Ib gồm các peptide có dạng hình cầu, cấu trúc không linh động, tích điện âm hoặc không tích điện Chúng thể hiện hoạt động bằng cách gây nhiễu với các phân tử enzyme thiết yếu của vi khuẩn nhạy cảm (Parada và ctv, 2007)

a) Lớp IIa

Lớp IIa là lớp lớn nhất, gồm các peptide hoạt động chống Listeria, đại diện đặc

trưng cho nhóm này là pediocin PA-1 và sakacin P Các bacteriocin nhóm này hứa hẹn

cho nhiều ứng dụng công nghiệp nhờ vào hoạt động kháng Listeria mạnh của chúng Thậm chí chúng còn là các tác nhân kháng Listeria được chú ý nhiều hơn là

bacteriocin lớp I (nisin) vì chúng không có phổ ức chế rộng và vì vậy, chúng không tiêu diệt các giống khởi động (Ouwehand và Vesterlund, 2004)

2.6.2.3 Lớp III

Lớp này bao gồm những peptide lớn, có trọng lượng phân tử lớn hơn 30 kDa, không bền nhiệt Nhóm này có thể bao gồm các enzyme ngoại bào kháng lại các vi khuẩn có thể bắt chước các hoạt động sinh lý của bacteriocin Các bacteriocin lớp III

cho đến nay chỉ được phân lập từ các thành viên của giống Lactobacillus (Ouwehand

và Vesterlund, 2004)

2.6.3 Cơ chế hoạt động

Các bacteriocin thường có hiệu quả chống lại các vi khuẩn Gram (+) như

Bacillus, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium Các bacteriocin của LAB

có thể không hiệu quả khi ức chế vi khuẩn Gram (-) vì màng ngoài của chúng gây trở ngại cho hoạt động của bacteriocin Những màng này ngăn cản các phân tử như chất kháng sinh, chất tẩy rửa và thuốc nhuộm xâm nhập tế bào chất (De Martinis và ctv, 2001) Tuy nhiên, có một vài nghiên cứu đã công bố hoạt động của bacteriocin chống

lại các vi khuẩn nhóm này, ví dụ như plantaricin 35d sản xuất bởi Lactobacillus

plantarum chống lại Aeromonas hydrophila (Messi và ctv, 2001), thermophylin sản

xuất bởi Streptococcus thermophillus hoạt động chống lại E coli và Yersinia

enterocolitica (Ivanova và ctv, 1998).

Các cơ chế hoạt động khác nhau đã được đề ra cho các bacteriocin như thay đổi hoạt động enzyme, ức chế sự nảy mầm của bào tử và ngừng hoạt động của các chất mang anion thông qua sự hình thành của các lỗ (Abee, 1995)

Các bacteriocin từ LAB có thể hoạt động thông qua các cơ chế khác nhau để phát huy tác dụng kháng khuẩn nhưng màng tế bào thường là đích được nhắm đến Sự tương tác tĩnh điện ban đầu giữa màng tế bào và peptide của bacteriocin được cho là động lực cho các chuyển biến tiếp theo (Deegan, 2006)

Các bacteriocin có thể có tính diệt khuẩn hoặc định khuẩn, tác động này chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi một số yếu tố như lượng bacteriocin và độ tinh khiết của nó, tình trạng sinh lý của các tế bào chỉ thị và các điều kiện thí nghiệm (Cintas, 2001)

Có khả năng là lớp I và II sử dụng cùng các cơ chế hoạt động giống nhau Các peptide liên kết màng huyết tương thông qua các tương tác tĩnh điện với các phospholipid tích điện âm Vì vậy, việc thâm nhập của bacteriocin ngang qua màng tế bào phụ thuộc vào điện thế màng, được điều khiển bởi pH và phospholipid Các đơn phân tử của bacteriocin hình thành các khối proteic dẫn đến việc hình thành lỗ kết quả

là dẫn đến sự thất thoát của các ion (chủ yếu là K và Mg), tổn thất lượng proton trong

tế bào chất, thất thoát ATP và acid amin Lượng proton trong tế bào chất có vai trò cơ bản trong sự tổng hợp ATP và trong sự di chuyển của vi khuẩn; vì vậy, việc tổng hợp của các phân tử lớn cũng như sản xuất năng lượng bị ức chế, dẫn đến chết tế bào đích (Bruno và Montville, 1993)

Phương thức hoạt động của các bacteriocin nhóm III không được biết đến Do

đó, đòi hỏi phải nghiên cứu nhiều hơn để làm sáng tỏ nó (Parada và ctv, 2007)

2.6.4 Lợi ích và hạn chế của bacteriocin

2.6.4.1 Lợi ích của bacteriocin

Ngày nay, áp dụng rộng rãi các bacteriocin trong lĩnh vực thực phẩm đã mang đến những lợi ích nhất định so với việc sử dụng những chất bảo quản hóa học truyền thống như:

 Bacteriocin chứng minh tính an toàn của chúng trong chuỗi thực phẩm dành cho người Chúng có ít hạn chế hơn so với những chất bảo quản hóa học vì là các phân tử được sản sinh tự nhiên bởi vi sinh vật lên men trong thực phẩm lên men truyền thống (Ruiz-Larrea, 2005).

 Không gây tác động đến môi trường vì chúng bị thoái biến nhanh chóng

 Các bacteriocin được sử dụng như nguồn thức ăn chủ yếu đối với các tác nhân gây bệnh mà không làm ảnh hưởng đến vi khuẩn có lợi (Ouwehand

 Ít được biết đến hơn so với các chất bảo quản hóa học

 Bị thoái biến nhanh chóng bởi các enzyme phân giải protein

 Chi phí cao trong việc đáp ứng các tính năng kỹ thuật

 Chỉ có hiệu quả chống lại một số loại vi khuẩn nào đó

Trên thực tế, có những rào cản pháp lý yêu cầu sự công nhận và chấp thuận cụ thể đối với việc sử dụng chúng ở dạng tinh khiết và bán tinh khiết (Ruiz-Larrea, 2005)