khảo sát khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic phân lập trên nem chua

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TRÊN NEM CHUA Họ tên sinh viên: TRẦN THỊ THANH THẢO Ngành: BẢO QUẢN CHẾ BIẾN NÔNG SẢN VÀ VI SINH THỰC PHẨM Niên khóa: 2006 - 2010 Tháng 08/2010 i Ket-noi.com kho tai lieu mien phi KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP TRÊN NEM CHUA Tác giả TRẦN THỊ THANH THẢO Khóa luận đệ trình đề để đáp ứng yêu cầu cấp Kỹ sư ngành Bảo quản chế biến nông sản vi sinh thực phẩm Giáo viên hướng dẫn: Tiến sĩ Hồ Thị Nguyệt Thu Tháng 08/2010 ii LỜI CẢM TẠ Với lịng tơn sư trọng đạo, em xin chân thành cảm ơn Qúy Thầy Cô Trường Đại học Nông Lâm, đặc biệt Thầy Cơ Khoa Cơng nghệ Thực phẩm tận tình dạy bảo năm vừa qua, truyền đạt kiến thức quý báu để làm hành trang cho em bước vào đời Xin chân thành cảm ơn Cô Hồ Thị Nguyệt Thu tận tình hướng dẫn, truyền thụ kinh nghiệm, tạo điều kiện tốt cho em suốt trình học tập thực đề tài Xin ghi nhớ công ơn Cha Mẹ khơng quản gian lao khó nhọc hy sinh cao có ngày hôm Xin gửi đến người thân yêu, anh chị bạn lớp DH06VT lời cảm ơn sâu sắc Sinh viên Trần Thị Thanh Thảo -1- Ket-noi.com kho tai lieu mien phi TÓM TẮT Nem chua sản phẩm lên men truyền thống phổ biến Việt Nam, ưa thích vị chua tự nhiên cấu trúc giòn, dai đặc trưng Tuy nhiên, bên cạnh đó, vấn đề chất lượng vệ sinh mối quan tâm hàng đầu người tiêu dùng lẫn người sản xuất Với nguyện vọng cải thiện chất lượng sản phẩm mặt vệ sinh định hướng phát triển nem chua thành thực phẩm chức năng, thực đề tài “Khảo sát khả sinh bacteriocin vi khuẩn lactic phân lập nem chua” nhằm tìm chủng vi khuẩn lactic có khả tạo hợp chất kháng lại vi khuẩn gây bệnh, ổn định chất lượng sản phẩm Chúng tiến hành nghiên cứu mẫu nem sở khác Trong đó, sở (Bà Chín, Ninh Hịa Năm Thu) sử dụng lên men tự nhiên sở lại (Vissan Giáo Thơ) thực lên men có định hướng pH bột thịt đo lường vào ngày lên men thứ tư nem chua Vi khuẩn lactic bột thịt nem ngày đếm tổng lượng, phân lập, khảo sát đặc tính sinh hóa tìm hiểu khả sinh bacteriocin chúng Kết đo lường cho thấy, pH bột thịt ngày thứ ba sở lên men tự nhiên khác khơng có ý nghĩa (p > 0,05); đó, nem sở Năm Thu có giá trị pH thấp (4,34  0,03) Đối với hai sở lên men có định hướng, phân tích thống kê cho thấy pH bột thịt ngày chúng khác cách có ý nghĩa (p ≤ 0,05); đó, Vissan có giá trị pH thấp (4,15  0,03) Tổng lượng vi khuẩn lactic ngày mẫu nem sở lên men tự nhiên khác cách có ý nghĩa (p ≤ 0,05) Nem ngày sở Năm Thu (1,62.108 CFU/g) cao hai sở lại (lần lượt 1,43.108 1,29.108 CFU/g) Đối với sở lên men có định hướng, Vissan Giáo Thơ, tổng lượng vi khuẩn lactic (lần lượt 1,15.109 3,08.108 CFU/g) cao nhiều so với sở lên men tự nhiên Giữa hai sở lên men định hướng, khác biệt tổng lượng vi khuẩn lactic nem ngày có ý nghĩa (p ≤ 0,001) Chúng ghi nhận dạng vi khuẩn lactic sở khảo sát; đó, đa phần có dạng que (chiếm 81,82% chủng vi khuẩn kiểm tra) -2- Khảo sát khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn lactic, chúng tơi nhận thấy có 01 chủng vi khuẩn thuộc dạng VII nem Ninh Hịa có khả kháng lại Staphylococcus aureus ssp aureus CIP 20256 01 chủng dạng I nem Ninh Hòa kháng lại Salmonella indiana LMBA -3- Ket-noi.com kho tai lieu mien phi MỤC LỤC Trang Trang tựa i Lời cảm tạ ii Tóm tắt iii Mục lục v Danh sách chữ viết tắt viii Danh sác hình ix Danh sách bảng ix CHƯƠNG MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1 Thực phẩm lên men triển vọng phát triển 2.2 Nem chua – Sản phẩm thịt lên men Việt Nam 2.3 Quá trình lên men lactic 2.4 Khái quát vi khuẩn lactic 2.5 Một số vi khuẩn lactic thường dùng thực phẩm 2.5.1 Lactobacillus 2.5.2 Lactococcus 2.5.3 Leuconostoc 2.5.4 Streptococcus 2.5.5 Pediococcus 2.6 Bacteriocin .8 2.6.1 Khái niệm chung .8 2.6.2 Phân loại 2.6.2.1 Lớp I 2.6.2.2 Lớp II .10 2.6.2.3 Lớp III 11 2.6.3 Cơ chế hoạt động 11 2.6.4 Lợi ích hạn chế bacteriocin 12 -4- 2.6.4.1 Lợi ích bacteriocin 12 2.6.4.2 Hạn chế bacteriocin .13 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 14 3.2 Vật liệu phương pháp nghiên cứu .14 3.2.1 Mơi trường thiết bị phân tích .14 3.2.2 Nguyên vật liệu thí nghiệm 14 3.3 Nội dung nghiên cứu .15 3.4 Phương pháp nghiên cứu 15 3.4.1 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic nem ngày bốn năm sở khảo sát .17 3.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu 17 3.4.1.2 Đồng mẫu 17 3.4.1.3 Kỹ thuật đo pH 17 3.4.1.4 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic 17 3.4.1.5 Đếm khuẩn lạc cấy chuyền .18 3.4.2 Định danh sơ vi khuẩn lactic phân lập 19 3.4.2.1 Nhuộm Gram 19 3.4.2.2 Phản ứng catalase 19 3.4.2.3 Khảo sát khả di động 19 3.4.2.4 Kiểm tra kiểu lên men 19 3.4.2.5 Khảo sát khả sinh acid lactic 20 3.4.3 Khảo sát khả sinh bacteriocin chủng vi khuẩn lactic phân lập 20 3.4.3.1 Thu hoạch dịch ly tâm 20 3.4.3.2 Khảo sát sơ khả sinh bateriocin chủng vi khuẩn phân lập 20 3.4.3.3 Khảo sát khả sinh bacteriocin chủng lactic phân lập phương pháp khuếch tán thạch 21 3.5 Xử lý thống kê số liệu thu thập .22 -5- Ket-noi.com kho tai lieu mien phi CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Khảo sát hệ vi khuẩn lactic nem chua sau ngày lên men năm sở khảo sát .23 4.1.1 Giá trị pH tổng lượng vi khuẩn lactic nem chua lên men ngày sở khảo sát 23 4.1.2 Phần trăm dạng khuẩn lạc nem chua lên men ngày sơ sở khảo sát .25 4.2 Tính chất sinh hóa dạng khuẩn lạc phân lập 31 4.3 Khảo sát khả sinh bacteriocin chủng vi khuẩn lactic phân lập 33 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1 Kết luận 36 5.2 Đề nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC .41 -6- DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT CFU: Colony Forming Unit LAB: Lactic Acid Bacteria EMP: Embden - Meyerhof - Parnas pathway MRS NB MRD TSA -7- Ket-noi.com kho tai lieu mien phi DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Cấu trúc nisin 10 Hình 3.1: Tiến trình thực khảo sát 16 Hình 3.2: Trình tự pha loãng cho việc đếm vi khuẩn lactic 18 Hình 3.3: Vùng kháng khuẩn dịch bacteriocin đĩa petri 22 Hình 4.1: Dạng hình thái tế bào khuẩn lạc dạng I 26 Hình 4.2: Dạng hình thái tế bào khuẩn lạc dạng II 26 Hình 4.3: Dạng hình thái tế bào khuẩn lạc dạng III 27 Hình 4.4: Dạng hình thái tế bào khuẩn lạc dạng IV 27 Hình 4.5: Dạng hình thái tế bào khuẩn lạc dạng V 28 Hình 4.6: Dạng hình thái tế bào khuẩn lạc dạng VI 28 Hình 4.7: Dạng hình thái tế bào khuẩn lạc dạng VII 28 Hình 4.8: Sự chuyển màu dung dịch khảo sát khả sinh acid lactic vi khuẩn 33 Hình 4.9: Vùng kháng khuẩn chủng vi khuẩn dạng VII Staphylococcus aureus ssp aureus CIP 34 Hình 4.10: Vùng kháng khuẩn chủng vi khuẩn dạng I Salmonella indiana LMBA 35 DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1: Giá trị pH tổng lượng vi khuẩn lactic nem chua ngày năm sở khảo sát .23 Bảng 4.2: Phần trăm dạng khuẩn lạc nem chua ngày năm sơ sở khảo sát .29 Bảng 4.3 Tính chất sinh hóa dạng khuẩn lạc phân lập .32 -8- Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN LACTIC CỦA NEM CHUA SAU NGÀY LÊN MEN Ở NĂM CƠ SỞ KHẢO SÁT 4.1.1 Giá trị pH tổng lượng vi khuẩn lactic nem chua lên men ngày sở khảo sát Kết theo dõi giá trị pH tổng lượng vi khuẩn lactic nem chua sau ngày lên men sở khảo sát trình bày Bảng 4.1 Bảng 4.1: Giá trị pH tổng lượng vi khuẩn lactic nem chua ngày sở khảo sát Kiểu lên men Tham số thống kê (n=3) Cơ sở pH  SD N SD (CFU/g) Bà Chín 4,39  0,03 1,43.108  7.106 Ninh Hòa 4,41  0,03 1,29.108  1,2.107 Năm Thu 4,34  0,03 1,62.108  1,5.107 Lên men có Vissan 4,15  0,03 1,15.109  8,5.107 định hướng Giáo Thơ 4,23  0,03 3,08.108  7.106 Lên men tự nhiên (n: tổng số mẫu khảo sát, pH : giá trị pH trung bình mẫu, N : số lượng vi khuẩn trung bình mẫu, SD: độ lệch chuẩn) Theo nghiên cứu nem chua lên men ngày sở sản xuất theo kiểu lên men tự nhiên, kết phân tích thống kê khơng có khác biệt có ý nghĩa pH mẫu nem sở khảo sát với độ tin cậy 95% (phụ lục 3) Qua Bảng 4.1, nem sở Năm Thu có giá trị pH thấp (vào khoảng 4,34  0,03) so với sở lại Bà Chín (pH = 4,39  0,03) Ninh Hòa (pH = 4,41  0,03) Sự khác biệt không đáng kể mặt thống kê (p > 0,05) Theo nghiên cứu Lý Ngọc Quí (2006) sản phẩm nem chua sở Út Thẳng, pH nem chua ngày lên men 6,33 ngày thứ 3,99 Sở dĩ có sụt giảm pH trình - 30 - Ket-noi.com kho tai lieu mien phi chuyển hóa đường nguyên liệu thành acid hữu cơ, đặc biệt acid lactic làm giảm pH nguyên liệu Ở sở sản xuất nem theo kiểu lên men có định hướng, phân tích thống kê pH nem chua hai sở Vissan Giáo Thơ khác biệt có ý nghĩa (p ≤ 0,05) (phụ lục 3) Giá trị pH nem chua Giáo Thơ 4,23  0,03 cao so với nem Vissan (pH = 4,15  0,03) Giá trị pH sở thấp so với sở lên men tự nhiên Điều có lẽ q trình lên men nem có định hướng sở Ở sở Giáo Thơ người ta sử dụng phần thịt lên men ngày hôm trước cho việc sản xuất nem chua ngày hôm sau (80 g bột thịt ngày 10 kg bột thịt ngày hôm trước cho thêm vào 40 kg thịt xay ngày sản xuất) (Lý Ngọc Q, 2006) Khi lên men có định hướng, vi khuẩn lactic chiếm ưu lượng giai đoạn đầu phát triển sản sinh nhiều aicd so với sản phẩm lên men tự nhiên (Nguyễn Thị Minh Un, 2008) Trong lên men xúc xích khơ, việc sử dụng men vi sinh với vi khuẩn phân lập từ sản phẩm (men vi sinh nội tại) dẫn đến hình thành nhanh chóng acid lactic từ ban đầu tiến trình lên men làm giảm nhanh pH q trình lên men (Ammor, 2007; trích dẫn Hồ Thị Nguyệt Thu, 2008) Bên cạnh đó, pH sản phẩm thịt phụ thuộc vào pH ban đầu bột thịt, vào lượng loại gia vị phụ gia sử dụng, vào hệ vi khuẩn ban đầu vào yếu tố có liên quan đến tăng trưởng chúng nhiệt độ, hoạt tính nước, oxy hóa - khử (Hồ Thị Nguyệt Thu, 2008) Trong sản xuất nem chua, acid hữu cơ, đặc biệt acid lactic, sinh trình lên men làm giảm giá trị pH, tạo vị chua tự nhiên cho sản phẩm làm cho cấu trúc thịt săn chắc, tạo nên kết cấu dai đặc trưng cho sản phẩm Bên cạnh đó, pH thấp cịn có tác dụng cản trở phát triển số vi sinh vật không mong muốn sản phẩm, giúp cho việc bảo quản sản phẩm tốt Kết xử lý thống kê tổng lượng vi khuẩn lactic cho thấy khác biệt mẫu nem sở lên men tự nhiên có ý nghĩa (p ≤ 0,05) Tổng lượng vi khuẩn lactic nem Năm Thu 1,62.108 CFU/g cao nhất, nem sở Bà Chín với tổng lượng vi khuẩn lactic 1,43.108 CFU/g (thấp 1,9.107 CFU/g) nem Ninh Hịa có tổng lượng vi khuẩn thấp (1,29.108 CFU/g thấp 3,3.107 CFU/g so với nem Năm Thu) Điều phù hợp với giá trị pH mà đo lường, tổng - 31 - lượng vi khuẩn lactic nhiều sản sinh nhiều acid làm giảm pH sản phẩm Sự khác tổng lượng vi khuẩn sở lên men tự nhiên hệ vi sinh vật bột thịt ban đầu, gói, ngun phụ liệu, điều kiện mơi trường nhiệt độ, độ ẩm… sở khảo sát Đối với sở Vissan Giáo Thơ, tổng lượng vi khuẩn cao nhiều so với sở lên men tự nhiên, tổng lượng vi khuẩn lactic nem Giáo Thơ 3,08.108 CFU/g Vissan 1,15.109 CFU/g (lần lượt cao 1,46.108 CFU/g 9,88.108 CFU/g so với Năm Thu) Sự khác biệt có lẽ sở Giáo Thơ Vissan sử dụng phương pháp lên men định hướng, bổ sung vi sinh vật chủ động, cách sử dụng men khô (Vissan) bột thịt lên men ngày trước (Giáo Thơ), khiến chúng phát triển chiếm ưu thế, ức chế vi khuẩn cạnh tranh khác, tạo điều kiện cho chúng phát triển mạnh Phân tích thống kê cho thấy tổng lượng vi khuẩn lactic sở khác có ý nghĩa (p ≤ 0,001) Sự khác biệt phương pháp định hướng lên men sở Cơ sở Vissan sản xuất nem theo qui mô công nghiệp lớn sử dụng men với giống thuần, chủng vi khuẩn lactic khởi động tốt có khả phát triển mạnh, làm xúc tiến nhanh trình lên men 4.1.2 Phần trăm dạng khuẩn lạc nem chua lên men ngày năm sơ sở khảo sát Kết ghi nhận dạng khuẩn lạc diện nem chua ngày năm sở cho thấy tổng cộng có dạng khuẩn lạc ghi nhận mẫu nem khảo sát Việc phân loại dạng khuẩn lạc dựa vào màu sắc, hình dạng kích thước khuẩn lạc Các dạng khuẩn lạc bao gồm:  Dạng I: khuẩn lạc tròn, vun nhẹ, màu trắng sữa, có viền sáng xung quanh, rìa gọn, kích thước thay đổi từ 1- mm  Dạng II: khuẩn lạc trịn, vun nhẹ, màu trắng sữa, kích thước thay đổi từ 1- mm  Dạng III: khuẩn lạc trịn, vun nhẹ, màu trắng sữa, viền sáng, rìa khơng gọn, kích thước thay đổi từ 1- mm  Dạng IV: khuẩn lạc tròn, vun nhẹ, màu trắng đục, trong, kích thước mm  Dạng V: khuẩn lạc trịn, vun cao, màu trắng sữa, kích thước mm - 32 - Ket-noi.com kho tai lieu mien phi  Dạng VI:: khuẩn khu lạc tròn, vun nhẹ, màu trắng ắng đục, rrìa sáng, kích thước mm  Dạng VII: khuẩn ẩn lạc tròn, tr vun cao, màu trắng vàng, kích thư thước mm a) Khuẩn lạc dạng I b) Nấm ấm men c) Trực ực khuẩn Hình 4.1: Dạng hình thái tế bào khuẩn lạc dạng I a) Khuẩn ẩn lạc dạng II b) Nấm men c) Trực khuẩn Hình 4.2: Dạng hình thái tế bào khuẩn lạc dạng II - 33 - a) Khuẩn lạc dạng III b) Trực ực khuẩn c) Nấm men Hình 4.3: Dạng hình thái tế bào khuẩn lạc dạng III a) Khuẩn ẩn lạc dạng IV b) Trực khuẩn Hình 4.4: Dạng hình thái tế bào khuẩn lạc dạng IV - 34 - Ket-noi.com kho tai lieu mien phi a) Khuẩn ẩn lạc dạng V b) Cầu trực Hình 4.5: Dạng hình thái tế bào khuẩn lạc dạng V a) Khuẩn ẩn lạc dạng VI b) Trực khuẩn Hình 4.6: Dạng hình thái tế bào khuẩn lạc dạng VI a) Khuẩn ẩn lạc dạng VII b) Trực ực khuẩn Hình 4.7: Dạng D hình thái tế bào khuẩn lạc dạng VII Phần ần trăm dạng khuẩn lạc mẫu nem lên lên men ngày sở trình bày Bảng 4.2 - 35 - Bảng 4.2: Phần trăm dạng khuẩn lạc nem chua ngày sơ sở khảo sát Kiểu lên men Cơ sở Dạng khuẩn lạc ( X  SD) (%) Σ (%) I II Bà Chín 100 55,08 ± 6,62 35,99 ± 8,95 Ninh Hịa 100 28,76 ± 9,53 11,14 ± 3,51 Năm Thu 100 32,40 ± 6,49 Vissan 100 25,19 ± 9,51 Giáo Thơ 100 63,8 ± 9,29 III IV V VI VII 8,93 ± 7,79 Lên men tự nhiên (n = 3) Lên men có 2,05 ± 3,56 10,59 ± 9,53 47,46 ± 5,36 16,26 ± 8,87 51,34 ± 6,64 24,08 ± 2,96 50,73 ± 6,66 định hướng (n = 3) 36,16 ± 9,29 (n: tổng số mẫu khảo sát, X : phần trăm khuẩn lạc, SD: độ lệch chuẩn) - 29 - Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Ở sở Bà Chín, có dạng khuẩn lạc ghi nhận đó, dạng I II có tần số xuất cao nhiều so với dạng VII Đối với sở nem Ninh Hịa, chúng tơi ghi nhận dạng khuẩn lạc, dạng IV có tần số xuất cao (47,46%) dạng I (28,76%) Cơ sở Năm Thu có dạng khuẩn lạc, tần số xuất dạng V dạng I cao (lần lượt 51,34% 32,40%) Ở sở Vissan, ghi nhận dạng khuẩn lạc, dạng VI có tần số xuất cao (50,73%) Đối với sở Giáo Thơ có dạng khuẩn lạc ghi nhận, dạng I có tần số xuất cao dạng V (lần lượt chiếm tỉ lệ 63,84% 36,16%) Trong dạng khuẩn lạc ghi nhận, chúng tơi quan sát thấy có dạng giống với khuẩn lạc nhận định Lý Ngọc Quí (2006): Khuẩn lạc dạng I dạng II mà ghi nhận giống với mô tả khuẩn lạc dạng VI dạng I.2 nghiên cứu tác giả Theo ghi nhận chúng tôi, dạng I xuất tất mẫu nem sở với tần số cao (25,19% - 63,8%) Còn dạng lại xuất số sở, ví dụ sở Vissan Giáo Thơ khơng có dạng II, III VII; sở Bà Chín Ninh Hịa khơng có dạng V VI Riêng dạng VI xuất sở Vissan Sự khác biệt dạng khuẩn lạc sở hệ vi sinh vật thịt ban đầu, nguyên phụ liệu (đường, gói,…), thao tác q trình sản xuất, điều kiện môi trường chế biến, phương pháp lên men… Theo Hồ Thị Nguyệt Thu (2008), gói tham gia vào trình lên men, khảo sát hệ vi khuẩn lactic chùm ruột tác giả ghi nhận vi khuẩn lactic diện với lượng khơng Ngồi ra, đường mía sử dụng bổ sung khoáng chất, tạo thuận lợi cho phát triển vi khuẩn lactic nem chua (Trương Thanh Long, 2004; trích dẫn Hồ Thị Nguyệt Thu, 2008) Ở sở lên men theo kiểu định hướng, dạng khuẩn lạc có xu hướng so với sở lên men tự nhiên lên men định hướng bổ sung các sinh vật mong muốn làm chúng phát triển chiếm ưu hệ vi sinh vật từ lúc đầu, tạo điều kiện cho chúng phát triển mạnh cạnh tranh với hệ vi sinh vật khác bột thịt - 30 - 4.2 TÍNH CHẤT SINH HĨA CỦA NHỮNG DẠNG KHUẨN LẠC PHÂN LẬP Kết nghiên cứu đặc tính sinh hóa dạng khuẩn lạc phân lập mẫu nem sở trình bày Bảng 4.3 - 31 - Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Bảng 4.3 Tính chất sinh hóa dạng khuẩn lạc phân lập Kiểu lên men Nghiên cứu Cơ sở Dạng khuẩn lạc Vissan Giáo Thơ (%) I II III IV VII I III V I IV VI I V (-) 0 0 0 0 0 0 0 0 (+) 6,82 6,82 4,55 6,82 6,82 2,27 6,82 4,55 6,82 6,82 6,82 6,82 6,82 6,82 6,82 6,82 100 0,76 0,76 0,76 0,76 0 0,76 0,76 0 0 0 4,55 6,06 6,06 4,55 6,06 6,82 1,52 6,82 4,55 6,06 6,06 6,82 6,82 6,82 6,82 81,82 0 0 0 0 0 6,82 0 0 (-) 6,35 6,35 4,76 6,35 7,14 1,59 7,14 4,76 6,35 6,35 7,14 7,14 7,14 7,14 7,14 7,14 100 (+) 0 0 0 0 0 0 0 0 (-) 6,35 6,35 4,76 6,35 7,14 1,59 7,14 4,76 6,35 6,35 7,14 7,14 7,14 7,14 7,14 7,14 100 (+) 0 0 0 0 0 0 0 0 Dạng Đồng hình 6,35 4,76 7,14 1,59 7,14 4,76 6,35 7,14 7,14 0 lên men Dị hình 6,35 0 6,35 0 0 6,35 0 7,14 7,14 7,14 40,48 Sinh (-) 0 0 0 0 0 0 0 0 acid lactic (+) 6,35 6,35 4,76 6,35 7,14 1,59 7,14 4,76 6,35 6,35 7,14 7,14 7,14 7,14 7,14 7,14 100 Nấm men (n = 6) Hình thái Trực khuẩn (n = 108) Cầu trực (n = 18) Catalase (n= 126) Năm Thu VII vi khuẩn sinh hóa Ninh Hịa Tổng II Vi thể Phản ứng Bà Chín Lên men định hướng (%) I Gram (n= 132) Lên men tự nhiên (%) Di động (n: tổng số mẫu khảo sát) - 32 - 6,82 13,63 7,14 59,52 Theo kết trình bày Bảng 4.3, 132 khuẩn lạc khảo sát hình thái vi khuẩn, kết cho thấy đa số khuẩn lạc có dạng trực khuẩn (81,82%), dạng cầu trực (13,63%) tập trung chủ yếu dạng V Chỉ có số nấm men (4,55%), với tần số xuất thấp dạng I, II III Sau kiểm tra loại bỏ chủng vi khuẩn nấm men, thực phản ứng sinh hóa với 126 chủng vi khuẩn phân lập để xác định vi khuẩn lactic Kết phản ứng catalase, khảo sát khả di động sinh acid lactic cho thấy 100% chủng phân lập thỏa mãn u cầu đặc tính sinh hóa vi khuẩn lactic Theo khảo sát dạng lên men, sản xuất nem chua theo kiểu lên men tự nhiên, 70% vi khuẩn kiểm tra có khả lên men đồng hình; sở sản xuất theo phương pháp lên men có định hướng 60% chủng vi khuẩn khảo sát có đặc tính lên men dị hình Hình 4.8: Sự chuyển màu dung dịch khảo sát khả sinh acid lactic vi khuẩn 4.3 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP Khảo sát sơ 126 chủng vi khuẩn, xem vi khuẩn lactic, khả kháng khuẩn chúng chủng gây bệnh (Staphylococcus aureus ssp - 36 - Ket-noi.com kho tai lieu mien phi aureus CIP 20256, E coli ATCC 25922, Bacillus cereus CIP 6624T, Listeria monocytogenes CIP 82110 T Salmonella indiana LMBA) chothấy có 28 chủng có khả kháng chủng gây bệnh nói chiếm 22,22% tổng số chủng vi khuẩn khảo sát Trong đó, có chủng dạng I nem Bà Chín, Ninh Hịa (3,97%); chủng dạng III nem Năm Thu (4,76%); chủng dạng V nem Giáo Thơ (3,97%); chủng dạng VI nem Vissan (3,97%) chủng dạng VII nem Bà Chín Ninh Hịa (5,55%) Kết khảo sát phương pháp khuếch tán thạch 28 chủng cho thấy có 01 chủng dạng VII nem Ninh Hịa có khả kháng lại Staphylococcus aureus ssp aureus CIP 20256 01 chủng dạng I nem Ninh Hòa kháng lại Salmonella indiana LMBA Điều chủng vi khuẩn lại tạo lượng bacteriocin với nồng độ thấp nên khả kháng khuẩn chúng Đường kính kháng khuẩn chủng vi khuẩn dạng VII 15mm dạng I 7mm Như khả kháng Staphylococcus aureus ssp aureus CIP chủng vi khuẩn dạng VII mạnh so với chủng dạng I kháng Salmonella indiana LMBA Có vẻ vi khuẩn lactic, bacteriocin thường có hiệu chống lại vi khuẩn Gram (+) không hiệu ức chế vi khuẩn Gram (-) Điều có lẽ màng ngồi vi khuẩn Gram (-) dày, gây trở ngại cho hoạt động bacteriocin Những màng ngăn cản phân tử chất kháng sinh, chất tẩy rửa thuốc nhuộm xâm nhập tế bào chất (De Martinis ctv, 2001) Theo nghiên cứu Nguyen (2010) 44 chủng vi khuẩn lactic kiểm tra, có vài chủng thể khả kháng khuẩn yếu Staphylococcus aureus 1976 (Sa 1976) khơng có chủng có khả kháng lại Salmonella typhimurium 1826 (St 1826) Vùng kháng khuẩn chủng vi khuẩn lactic dạng VII Staphylococcus aureus ssp aureus CIP dạng I Salmonella indiana LMBA trình bày Hình 4.9 Hình 4.10 - 37 - Hình 4.9: Vùng kháng khuẩn chủng vi khuẩn dạng VII Staphylococcus aureus ssp aureus CIP Hình 4.10: Vùng kháng khuẩn chủng vi khuẩn dạng I Salmonella indiana LMBA - 38 - Ket-noi.com kho tai lieu mien phi Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN  Đối với mẫu nem ngày sở lên men tự nhiên, khác biệt pH sản phẩm có ý nghĩa với độ tin cậy 95% Đối với mẫu nem sở lên men có định hướng, pH chúng khác có ý nghĩa (p ≤ 0,05) thấp so với giá trị pH mẫu nem sở lên men tự nhiên.Tổng lượng vi khuẩn lactic mẫu nem khảo sát sở lên men tự nhiên khác có ý nghĩa (p ≤ 0,05) Tổng lượng vi khuẩn lactic sở Năm Thu (1,62.108 CFU/g) cao tổng lượng vi khuẩn hai sở Bà Chín (1,43.108 CFU/g) Ninh Hòa (1,29.108 CFU/g) Đối với sở lên men có định hướng Vissan Giáo Thơ, tổng lượng vi khuẩn cao nhiều so với sở lên men tự nhiên Tổng lượng vi khuẩn lactic sở Vissan (1,15.109 CFU/g) cao Giáo Thơ (3,08.108 CFU/g) khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p ≤ 0,001)  Có dạng khuẩn lạc ghi nhận mẫu nem sở Kiểm tra vi thể cho thấy 81,82% vi khuẩn có dạng trực khuẩn, 13,63% vi khuẩn có dạng cầu trực khuẩn 4,55% vi khuẩn có dạng nấm men Sau kiểm tra phản ứng sinh hóa, có 126 chủng vi khuẩn xem vi khuẩn lactic (chiếm 95,45 % tổng số chủng vi khuẩn phân lập)  Kiểm tra khả kháng khuẩn cho thấy có 01 chủng dạng VII (chiếm 0,79% vi khuẩn kiểm tra) nem Ninh Hịa có khả kháng lại Staphylococcus aureus ssp aureus CIP 20256 01 chủng dạng I (chiếm 0,79% vi khuẩn kiểm tra) nem Ninh Hòa kháng lại Salmonella indiana LMBA Trong đó, chủng vi khuẩn dạng VII có khả kháng khuẩn mạnh - 39 - 5.2 ĐỀ NGHỊ  Lặp lại nghiên cứu mẫu nem khác với thời điểm lên men khác để tìm chủng vi khuẩn lactic có khả sinh bacteriocin  Định danh vi khuẩn lactic có khả sinh bacteriocin  Chuẩn hóa tìm phương pháp thích hợp nhằm thu bacteriocin tốt  Ứng dụng chủng lactic có khả sinh bacteriocin vào sản phẩm nem chua nhằm phát triển nem chua thành thực phẩm chức - 33 - ... chủng vi khuẩn khảo sát có đặc tính lên men dị hình Hình 4.8: Sự chuyển màu dung dịch khảo sát khả sinh acid lactic vi khuẩn 4.3 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTIC PHÂN... 3.4.2.5 Khảo sát khả sinh acid lactic 20 3.4.3 Khảo sát khả sinh bacteriocin chủng vi khuẩn lactic phân lập 20 3.4.3.1 Thu hoạch dịch ly tâm 20 3.4.3.2 Khảo sát sơ khả sinh. .. trăm dạng khuẩn lạc nem chua lên men ngày sơ sở khảo sát .25 4.2 Tính chất sinh hóa dạng khuẩn lạc phân lập 31 4.3 Khảo sát khả sinh bacteriocin chủng vi khuẩn lactic phân lập