Sau khi tiến hành các phản ứng sinh hóa, chúng tôi chọn lọc ra những chủng vi
khuẩn được cho là vi khuẩn lactic để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc cho vào trong ống ly tâm vô trùng chứa
10 mL MRS bổ sung 2% cao nấm men(Elmoualdi và ctv, 2008). Ủ các ống ly tâm này
ở 37oC trong 16 - 18 giờ (Cheikhyoussef và ctv, 2008).
Sau đó, các ống ly tâm này sẽ được đem ly tâm ở 6000 vòng trong 15 phút để
tách cặn khuẩn. Nhằm tránh ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm bởi sự ức chế gây ra từ
các acid hữu cơ có mặt trong môi trường, sau khi ly tâm xong chúng tôi điều chỉnh pH
của dịch khuẩn bằng dung dịch NaOH 10N để đạt đến pH = 6,5 (Poncea và ctv, 2007).
Sau đó lọc lấy phần dịch nổi trên bề mặt bằng cách bơm dịch qua màng lọc Minisart (đường kính lỗ lọc là 0,2 µm) để tách cặn khuẩn còn sót lại. Phần dịch lỏng thu được
sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.3.2 Khảo sát sơ bộ khả năng sinh bateriocin của các chủng vi khuẩn phân lập
Tiến hành tăng sinh năm chủng chỉ thị gây bệnh trong 10 mL môi trường NB
(37oC / 24 giờ). Sau đó tiến hành pha loãng năm chủng chỉ thị đến nồng độ 10-4 bằng
dung dịch MRD.
Dùng micropipet hút 0,5 mL dịch ly tâm cho vào ống eppendorf vô trùng, sau
đó cho tiếp 0,5 mL dịch khuẩn chỉ thị ở nồng độ 10-4. Mỗi dịch ly tâm đều được khảo
sát với năm chủng gây bệnh nghiên cứu.
Ủ các ống eppendorf ở 37oC trong 24 giờ. Sau đó so sánh bằng mắt thường độ trong, đục của chúng với ống đối chứng (không cho dịch khuẩn). Nếu ống trong và không có sinh khối điều này chứng tỏ dịch ly tâm trong ống có khả năng kháng lại
chủng chỉ thị gây bệnh và ức chế sự phát triển của chúng. Ngược lại, nếu ống đục và có sinh khối, điều này đồng nghĩa với việc vi khuẩn gây bệnh vẫn tiếp tục phát triển
trong dịch ly tâm và như vậy, dịch ly tâm không có chứa chất kháng khuẩn.
Việc khảo sát sơ bộ này cho phép chúng tôi tuyển lược các chủng vi khuẩn
lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn cho khảo sát với phương pháp khuếch tán
trên thạch tiếp theo.
3.4.3.3 Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các chủng lactic phân lập bằng phương pháp khuếch tán trên thạch phương pháp khuếch tán trên thạch
Trong khảo sát này, chúng tôi cấy vi khuẩn theo hai cách: trên bề mặt thạch và cấy sâu trong thạch: 0,1 mL dịch canh khuẩn chỉ thị ở nồng độ 10-4 được trang đều lên
bề mặt thạch TSA hoặc được trộn đều với 30 mL môi trường TSA và sau đó đổ ra đĩa
petri. Sau khi thạch khô, đục 6 - 7 lỗ, với đường kính lỗ khoảng 8mm trên bề mặt đĩa
thạch (Hata và ctv, 2009). Các lỗ được đục cách thành đĩa petri khoảng 1cm để có thể quan sát được vòng kháng khuẩn sau này. Kế đến, nhỏ khoảng một giọt môi trường
TSA vào lỗ để bịt kín đáy lỗ. Dùng micropipet hút 150 µL dịch kháng khuẩn cho vào mỗi lỗ. Bên cạnh đó cũng tiến hành thí nghiệm với dịch kháng sinh pha loãng ở 10-4để
làm mẫu đối chứng. Tiếp theo, bảo quản các đĩa ở nhiệt độ 2 - 4oC trong 2 giờ với mục đích ngăn cản sự phát triển của chủng chỉ thị và tạo điều kiện cho bacteriocin có thời (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
gian thẩm thấu vào bên trong thạch. Sau đó, các đĩa petri được ủ ở 37oC.
Việc đọc kết quả được thực hiện sau 16 giờ ủ. Khả năng kháng khuẩn của vi
khuẩn được xác định bằng sự hiện diện của vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ. Nếu đường kính vùng kháng khuẩn lớn hơn hoặc bằng 6 mm (Cheikhyoussef và ctv, 2008) thì được xem là có khả năng ức chế tích cực.
Đường kính vùng kháng khuẩn được tính như sau:
dkk= d – dlỗ
Trong đó: dkk: đường kính vùng kháng khuẩn xung quanh lỗ d: đường kính vùng ức chế (bao gồm đường kính lỗ)
dlỗ: đường kính lỗ.
3.5 XỬ LÝ THỐNG KÊ SỐ LIỆU THU THẬP
Việc tính các giá trị trung bình (pH ,N), tổng lượng khuẩn lạc và phần trăm
các dạng khuẩn lạc được thực hiện với phần mềm Excel 2003.
Việc tính toán SD, sự khác biệt giữa các lô thí nghiệm được tính với trắc
Chương 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN LACTIC CỦA NEM CHUA SAU 4 NGÀY LÊN MEN Ở NĂM CƠ SỞ KHẢO SÁT MEN Ở NĂM CƠ SỞ KHẢO SÁT
4.1.1 Giá trị pH và tổng lượng vi khuẩn lactic của nem chua lên men ngày 4 ở 5 cơ sở khảo sát cơ sở khảo sát
Kết quả theo dõi về giá trị pH và tổng lượng vi khuẩn lactic của nem chua sau 4
ngày lên men ở 5 cơ sở khảo sát được trình bày ở Bảng 4.1
Bảng 4.1: Giá trị pH và tổng lượng vi khuẩn lactic của nem chua ngày 4 ở 5 cơ sở
khảo sát
Kiểu lên men Cơ sở Tham số thống kê(n=3)
pH SD NSD (CFU/g)
Lên men tự nhiên
Bà Chín 4,39 0,03 1,43.108 7.106 Ninh Hòa 4,41 0,03 1,29.108 1,2.107 Năm Thu 4,34 0,03 1,62.108 1,5.107 Lên men có định hướng Vissan 4,15 0,03 1,15.109 8,5.107 Giáo Thơ 4,23 0,03 3,08.108 7.106 (n: tổng số mẫu khảo sát, pH : giá trị pH trung bình của mẫu, N : số lượng vi khuẩn
trung bình của mẫu, SD: độ lệch chuẩn)
Theo nghiên cứu trên nem chua lên men ngày 4 ở các cơ sở sản xuất theo kiểu
lên men tự nhiên, kết quả phân tích thống kê chỉ ra rằng không có sự khác biệt có ý
nghĩa giữa pH của các mẫu nem ở 3 cơ sở khảo sát với độ tin cậy 95% (phụ lục 3).
Qua Bảng 4.1, nem ở cơ sở Năm Thu có giá trị pH thấp nhất (vào khoảng 4,34 0,03) so với 2 cơ sở còn lại là Bà Chín (pH = 4,39 0,03) và Ninh Hòa (pH = 4,41 0,03). Sự khác biệt này là không đáng kể về mặt thống kê (p > 0,05). Theo nghiên cứu của
Lý Ngọc Quí (2006) trên sản phẩm nem chua ở cơ sở Út Thẳng, pH của nem chua trong ngày lên men đầu tiên là 6,33 và ngày thứ 4 là 3,99. Sở dĩ có sự sụt giảm pH là do quá trình
chuyển hóa đường trong nguyên liệu thành các acid hữu cơ, đặc biệt là acid lactic làm giảm pH của nguyên liệu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ở các cơ sở sản xuất nem theo kiểu lên men có định hướng, phân tích thống kê chỉ ra rằng pH của nem chua ở hai cơ sở Vissan và Giáo Thơ khác biệt nhau có ý nghĩa
(p ≤ 0,05) (phụ lục 3). Giá trị pH của nem chua Giáo Thơ là 4,23 0,03 cao hơn so với
nem Vissan (pH = 4,15 0,03). Giá trị pH ở 2 cơ sở này thấp hơn so với 3 cơ sở lên men tự nhiên. Điều này có lẽ là do quá trình lên men nem có định hướng tại các cơ sở
này. Ở cơ sở Giáo Thơ người ta sử dụng một phần thịt đã lên men ngày hôm trước cho
việc sản xuất nem chua ngày hôm sau (80 g bột thịt ngày 2 và 10 kg bột thịt ngày hôm
trước được cho thêm vào 40 kg thịt xay của ngày sản xuất) (Lý Ngọc Quí, 2006). Khi lên men có định hướng, vi khuẩn lactic chiếm ưu thế về lượng ngay ở giai đoạn đầu
phát triển và sản sinh nhiều aicd hơn so với sản phẩm lên men tự nhiên (Nguyễn Thị
Minh Uyên, 2008). Trong lên men xúc xích khô, việc sử dụng men vi sinh với những
vi khuẩn phân lập từ chính sản phẩm (men vi sinh nội tại) dẫn đến sự hình thành nhanh chóng acid lactic ngay từ ban đầu của tiến trình lên men làm giảm nhanh pH của quá
trình lên men (Ammor, 2007; trích dẫn bởi Hồ Thị Nguyệt Thu, 2008). Bên cạnh đó,
pH của sản phẩm thịt phụ thuộc vào pH ban đầu của bột thịt, vào lượng và loại gia vị
và phụ gia sử dụng, vào hệ vi khuẩn ban đầu và vào những yếu tố có liên quan đến sự tăng trưởng của chúng như nhiệt độ, hoạt tính nước, thế năng oxy hóa - khử... (Hồ Thị
Nguyệt Thu, 2008).
Trong sản xuất nem chua, các acid hữu cơ, đặc biệt là acid lactic, sinh ra trong quá trình lên men đã làm giảm giá trị pH, tạo vị chua tự nhiên cho sản phẩm và làm cho cấu trúc thịt săn chắc, tạo nên kết cấu dai chắc đặc trưng cho sản phẩm. Bên cạnh đó, pH thấp còn có tác dụng cản trở sự phát triển của một số vi sinh vật không mong
muốn trong sản phẩm, giúp cho việc bảo quản sản phẩm tốt hơn.
Kết quả xử lý thống kê về tổng lượng vi khuẩn lactic cho thấy sự khác biệt giữa
các mẫu nem ở 3 cơ sở lên men tự nhiên là có ý nghĩa (p ≤ 0,05). Tổng lượng vi khuẩn
lactic của nem Năm Thu 1,62.108 CFU/g là cao nhất, kế đến là nem cơ sở Bà Chín với
tổng lượng vi khuẩn lactic là 1,43.108 CFU/g (thấp hơn 1,9.107 CFU/g) và nem Ninh Hòa có tổng lượng vi khuẩn thấp nhất (1,29.108 CFU/g thấp hơn 3,3.107CFU/g so với nem Năm Thu). Điều này phù hợp với các giá trị pH mà chúng tôi đã đo lường, tổng
lượng vi khuẩn lactic càng nhiều sẽ sản sinh ra nhiều acid hơn và làm giảm pH sản
phẩm. Sự khác nhau về tổng lượng vi khuẩn giữa 3 cơ sở lên men tự nhiên có thể là do hệ vi sinh vật trong bột thịt ban đầu, lá gói, các nguyên phụ liệu, điều kiện môi trường như nhiệt độ, độ ẩm… của các cơ sở khảo sát.
Đối với 2 cơ sở Vissan và Giáo Thơ, tổng lượng vi khuẩn cao hơn rất nhiều so
với 3 cơ sở lên men tự nhiên, tổng lượng vi khuẩn lactic của nem Giáo Thơ là 3,08.108
CFU/g và Vissan là 1,15.109 CFU/g (lần lượt cao hơn 1,46.108 CFU/g và 9,88.108 CFU/g so với Năm Thu). Sự khác biệt này có lẽ là do các cơ sở Giáo Thơ và Vissan sử
dụng phương pháp lên men định hướng, bổ sung vi sinh vật chủ động, bằng cách sử
dụng men khô (Vissan) hoặc bột thịt đã được lên men của những ngày trước (Giáo Thơ), khiến chúng phát triển chiếm ưu thế, ức chế các vi khuẩn cạnh tranh khác, tạo điều kiện cho chúng phát triển mạnh. Phân tích thống kê cho thấy tổng lượng vi khuẩn
lactic của 2 cơ sở này khác nhau rất có ý nghĩa (p ≤ 0,001). Sự khác biệt này có thể là
do phương pháp định hướng lên men của 2 cơ sở. Cơ sở Vissan sản xuất nem theo qui
mô công nghiệp lớn và sử dụng men với các giống thuần, các chủng vi khuẩn lactic
khởi động tốt và có khả năng phát triển mạnh, làm xúc tiến nhanh quá trình lên men. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.1.2 Phần trăm các dạng khuẩn lạc của nem chua lên men ngày 4 ở năm sơ sở khảo sát khảo sát
Kết quả ghi nhận về các dạng khuẩn lạc hiện diện trên nem chua ngày 4 ở năm cơ sở cho thấy tổng cộng có 7 dạng khuẩn lạc được ghi nhận trong các mẫu nem khảo
sát. Việc phân loại các dạng khuẩn lạc được dựa vào màu sắc, hình dạng và kích thước
của khuẩn lạc. Các dạng khuẩn lạc bao gồm:
Dạng I: khuẩn lạc tròn, vun nhẹ, màu trắng sữa, có viền sáng xung quanh,
rìa gọn, kích thước thay đổi từ 1- 2 mm.
Dạng II: khuẩn lạc tròn, vun nhẹ, màu trắng sữa, kích thước thay đổi từ 1- 2 mm.
Dạng III: khuẩn lạc tròn, vun nhẹ, màu trắng sữa, viền sáng, rìa không gọn, kích thước thay đổi từ 1- 2 mm.
Dạng IV: khuẩn lạc tròn, vun nhẹ, màu trắng đục, trong, kích thước 2 mm.
Dạng VI: khu 2 mm.
Dạng VII: khuẩn lạc tr
b) Nấm men
Hình 4.1:
a) Khuẩn lạc dạng II b) Nấm men c) Trực khuẩn
Hình 4.2:
: khuẩn lạc tròn, vun nhẹ, màu trắng đục, r
ẩn lạc tròn, vun cao, màu trắng hơi vàng, kích thư
a) Khuẩn lạc dạng I
ấm men c) Trực khuẩn
Hình 4.1:Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng I
ẩn lạc dạng II b) Nấm men c) Trực khuẩn
Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng II
ắng đục, rìa sáng, kích thước ơi vàng, kích thước 2 mm. ực khuẩn ủa khuẩn lạc dạng I ẩn lạc dạng II b) Nấm men c) Trực khuẩn ủa khuẩn lạc dạng II
b) Trực khuẩn c) Nấm men Hình 4.3: a) Khuẩn lạc dạng IV b) Trực khuẩn Hình 4.4: a) Khuẩn lạc dạng III ực khuẩn c) Nấm men
Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng III
ẩn lạc dạng IV b) Trực khuẩn
Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng IV ực khuẩn c) Nấm men
ủa khuẩn lạc dạng III
ẩn lạc dạng IV b) Trực khuẩn ủa khuẩn lạc dạng IV
a) Khuẩn lạc dạng V b) Cầu trực Hình 4.5: a) Khuẩn lạc dạng VI b) Trực khuẩn Hình 4.6: a) Khuẩn lạc dạng VII Hình 4.7: D (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phần trăm mỗi dạng khuẩn lạc của các mẫu nem l
trình bày ở Bảng 4.2
ẩn lạc dạng V b) Cầu trực
Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng V
ẩn lạc dạng VI b) Trực khuẩn
Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng VI
ẩn lạc dạng VII b) Trực khuẩn
Dạng và hình thái tế bào của khuẩn lạc dạng VII ần trăm mỗi dạng khuẩn lạc của các mẫu nem lên men ngày 4
ẩn lạc dạng V b) Cầu trực ủa khuẩn lạc dạng V
ẩn lạc dạng VI b) Trực khuẩn ủa khuẩn lạc dạng VI
ực khuẩn ủa khuẩn lạc dạng VII
Bảng 4.2: Phần trăm các dạng khuẩn lạc của nem chua ngày 4 ở 5 sơ sở khảo sát Kiểu lên men Cơ sở Σ (%) Dạng khuẩn lạc (XSD) (%) I II III IV V VI VII Lên men tự nhiên (n = 3) Bà Chín 100 55,08 ± 6,62 35,99 ± 8,95 8,93 ± 7,79 Ninh Hòa 100 28,76 ± 9,53 ± 3,5111,14 ± 3,562,05 ± 5,3647,46 ± 9,5310,59 Năm Thu 100 32,40 ± 6,49 16,26 ± 8,87 51,34 ± 6,64 Lên men có định hướng (n = 3) Vissan 100 25,19 ± 9,51 24,08 ± 2,96 50,73 ± 6,66 Giáo Thơ 100 63,8 ± 9,29 ± 9,2936,16
Ở cơ sở Bà Chín, có 3 dạng khuẩn lạc được ghi nhận trong đó, dạng I và II có tần sốxuất hiện cao hơn nhiều so với dạng VII.
Đối với cơ sở nem Ninh Hòa, chúng tôi ghi nhận được 5 dạng khuẩn lạc, trong đó dạng IV có tần số xuất hiện cao nhất (47,46%)và kế đến là dạng I (28,76%).
Cơ sở Năm Thu có 3 dạng khuẩn lạc, tần số xuất hiện của dạng V và dạng I là cao nhất (lần lượt là 51,34% và 32,40%).
Ở cơ sở Vissan, chúng tôi ghi nhận được 3 dạng khuẩn lạc, trong đó dạng VI có
tần số xuất hiện cao nhất (50,73%).
Đối với cơ sở Giáo Thơ có 2 dạng khuẩn lạc được ghi nhận, trong đó dạng I có
tần số xuất hiện cao hơn dạng V (lần lượt chiếm tỉ lệ là 63,84% và 36,16%).
Trong 7 dạng khuẩn lạc được ghi nhận, chúng tôi quan sát thấy có 2 dạng giống
với khuẩn lạc được nhận định của Lý Ngọc Quí (2006): Khuẩn lạc dạng I và dạng II
mà chúng tôi ghi nhận được giống với mô tả khuẩn lạc dạng VI và dạng I.2 trong
nghiên cứu của tác giả này. Theo ghi nhận của chúng tôi, dạng I xuất hiện ở tất cả các
mẫu nem ở 5 cơ sở với tần số khá cao (25,19% - 63,8%). Còn các dạng còn lại chỉ xuất
hiện ở một số cơ sở, ví dụ như cơ sở Vissan và Giáo Thơ không có dạng II, III và VII;
cơ sở Bà Chín và Ninh Hòa không có dạng Vvà VI. Riêng dạng VI chỉ xuất hiện ở cơ
sở Vissan.
Sự khác biệt về những dạng khuẩn lạc ở các cơ sở có thể là do hệ vi sinh vật
trong thịt ban đầu, các nguyên phụ liệu (đường, lá gói,…), các thao tác trong quá trình sản xuất, điều kiện môi trường chế biến, phương pháp lên men… Theo Hồ Thị Nguyệt
Thu (2008), lá gói cũng tham gia vào quá trình lên men, do khi khảo sát hệ vi khuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
lactic của lá chùm ruột tác giả đã ghi nhận các vi khuẩn lactic hiện diện với lượng
không ít. Ngoài ra, đường mía sử dụng cũng bổ sung các khoáng chất, tạo thuận lợi
cho sự phát triển vi khuẩn lactic của nem chua (Trương Thanh Long, 2004; trích dẫn