Tổng quan về ứng dụng sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH 1 Trình tự mồi SCAR dùng cho phản ứng khuếch đại PCR 29 2 So sánh một số kĩ thuật khác nhau sử dụng công cụ sinh học phân tử để nhận diện thảo dược 55 Hình 1 N

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HẢI YẾN

TỔNG QUAN VỀ ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NHẬN DIỆN

THẢO DƯỢC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HẢI YẾN

TỔNG QUAN VỀ ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NHẬN DIỆN

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và hướng dẫn quý báu của các thầy cô, gia đình và bạn bè Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới:

- Ban giám hiệu, các thầy, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ và tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa học này

- Các thầy, cô trong bộ môn Hóa sinh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Tiến sĩ Phùng Thanh Hương – người thầy kính mến đã hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình đã luôn bên cạnh động viên

và ủng hộ tôi trong suốt khóa học

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian qua

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 7 tháng 5 năm 2013 Tác giả

Nguyễn Thị Hải Yến

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH

ĐẶT VẤN ĐỀ….……… 1 Chương 1 Tổng quan về hiện trạng nghiên cứu và thực hành

nhận diện thảo dược……… … 3 1.1 Sự cần thiết của việc nhận diện thảo dược……… ……3 1.2 Các phương pháp thường được sử dụng trong nhận diện thảo dược…… …….4 1.2.1 Phương pháp hình thái……… 4 1.2.2 Phương pháp vi học……… ……5 1.2.3 Phương pháp phân tích hóa học……….6 Chương 2 Các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong

nhận diện thảo dược……… ……… 9 2.1 Các marker dựa trên phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR)……….….……9 2.1.1 Kĩ thuật PCR sử dụng các mồi ngẫu nhiên (RP-PCR)……… ……… ….10 2.1.2 Kĩ thuật sự đa hình chiều dài của các đoạn ADN

có thể khuếch đại trực tiếp (DALP)… ……… 13 2.1.3 Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại (AFLP)…… …14 2.1.4 Kĩ thuật sự đa hình các trình tự khuếch đại được phân cắt (CAPS)………18 2.1.5 Kĩ thuật phân tích các trình tự lặp đơn giản (SSR)……… …20 2.1.6 Kĩ thuật sự đa hình trình tự giữa các vùng lặp (ISSR)……….22 2.1.7 Kĩ thuật khuếch đại trực tiếp vùng ADN tiểu vệ tinh (DAMD)………… 25 2.1.8 Kĩ thuật khuếch đại vùng đặc trưng (SCAR)……… …27 2.1.9 Kĩ thuật sự đa hình hình dạng sợi đơn (SSCP)……… 31 2.1.10 Kĩ thuật khuếch đại hệ thống đột biến bền vững (ARMS)

và multiplex-ARMS (MARMS)……….33

2.2 Các marker thu được bằng phương pháp giải trình tự ADN……… 38

2.2.1 Vùng phiên mã nội (ITS)……….………40

2.2.2 Vùng trnH – psbA………42

2.2.3 Maturase K (matK)……… ………43

2.2.4 Tiểu đơn vị lớn của ribulose-biphosphat carboxylase (vùng rbcL)……….44

2.2.5 Các trình tự ADN khác dùng trong nhận diện thảo dược………45

2.3 Phương pháp ADN microarray……… ……… … 47

2.3.1 Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là các oligonucleotid………… …47

2.3.2 Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là gen……… ……… …49

Chương 3 Bàn luận……… ……51

3.1 Đánh giá về các phương pháp nhận diện thảo dược sử dụng công cụ sinh học phân tử……… ….51

3.2 Đánh giá thực tế việc nhận diện thảo dược ở Việt Nam……….56

KẾT LUẬN……… ……59

ĐỀ XUẤT……… ……… 59

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH

1 Trình tự mồi SCAR dùng cho phản ứng khuếch đại PCR 29

2 So sánh một số kĩ thuật khác nhau sử dụng công cụ sinh học

phân tử để nhận diện thảo dược

55

Hình

1 Nguyên tắc của kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch

đại ngẫu nhiên – RAPD

11

2 Nghiên cứu RAPD với các loài S angustifolia, S acutifolia,

S sophera, S tora

12

5 Nghiên cứu CAPS trên các sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1,

ITS5 và được cắt bằng enzym giới hạn EaeI

19

6 Nguyên tắc của kĩ thuật phân tích các trình tự lặp lại đơn giản

SSR

21

8 Dấu vân tay ISSR của R palmatum, R officinale và R

tanguticum sử dụng mồi UBC-811

24

10 Nguyên tắc của kĩ thuật SCAR (sử dụng mồi SCAR đặc hiệu 27

từ marker RAPD)

11 Trình tự của đoạn ADN đặc trưng cho loài Panax

notoginseng

28

13 Sơ đồ vùng ITS và vị trí các mồi được sử dụng 34

14 Sản phẩm thu được sau phản ứng khuếch đại đặc trưng allel

của năm loài thuộc chi Citrus

35

15 Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào sự khác nhau về trình tự

gen matK giữa năm loài thuộc chi Panax

36

16 Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào sự khác nhau về trình tự

gen 18S rADN giữa năm loài thuộc chi Panax

37

18 Nguyên tắc của kĩ thuật microarray với mẫu dò là

oligonucleotid hoặc gen để nhận diện thảo dược

48

polymorphisms

Kĩ thuật sự đa hình chiều dài của các đoạn ADN có thể

khuếch đại trực tiếp DAMD Directed amplification of

minisatellite - region DNA

Kĩ thuật khuếch đại trực tiếp vùng ADN tiểu vệ tinh

ITS Internal trancribed spacer Vùng phiên mã nội

MARMS Multiplex amplification refractory

mutation system

matK Maturase K

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi

RAPD Random amplified polymorphic

DNA

Kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch đại ngẫu nhiên

regions trưng SNP Single-nucleotide polymorphism Sự đa hình đơn nucleotid SSCP Single strand conformation

polymorphism

Sự đa hình hình dạng sợi đơn

SSR Simple sequence repeats Các trình tự lặp đơn giản

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

vô tình hoặc do cố ý Việc sử dụng các thảo dược giả mạo có thể dẫn đến làm mất tác dụng điều trị và gây những hậu quả không mong muốn nghiêm trọng, thậm chí

là tử vong Do đó, việc nhận diện chính xác cây thuốc, vị thuốc là một bước quan trọng để đảm bảo hiệu quả điều trị Các thảo dược giả mạo có thể là các loài họ hàng gần của cây thuốc hoặc các loài từ các họ khác Do đó, việc nhận diện thảo dược liên quan đến việc xác định chính xác loài dùng làm thuốc và phân biệt nó với các loài có thể gây nhầm lẫn hoặc giả mạo đồng thời phát hiện nếu có sự có mặt của loài giả mạo

Hiện nay, có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để nhận diện thảo dược Phương pháp nhận diện dựa vào hình thái tuy đơn giản nhưng lại phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm của người nhận diện và không thể nhận diện được thảo dược ở dạng đã sơ chế Phương pháp vi học có thể khắc phục được nhược điểm của phương pháp hình thái nhưng việc nhận diện lại không thể thực hiện được khi thảo dược ở dạng dịch chiết và khi phải tiến hành với số lượng lớn các mẫu Các phương pháp dựa vào thành phần hóa học là một công cụ mạnh trong nhận diện thảo dược

và hoàn toàn có thể thực hiện khi thảo dược ở dạng dịch chiết Tuy nhiên, nhược điểm chung của các phương pháp hóa học là phụ thuộc vào thành phần hóa học của cây mà thành phần này lại thay đổi rất nhiều tùy theo môi trường, điều kiện thu hái

và bảo quản Phương pháp nhận diện thảo dược nhờ sử dụng công cụ sinh học phân

tử ra đời đã khắc phục được nhược điểm của các phương pháp phân tích hóa học Phân tử ADN tương đối bền vững và ít bị ảnh hưởng bởi môi trường do đó phương pháp này đem lại một công cụ tiên tiến, chính xác và hiệu quả trong nhận diện thảo dược

Tại Việt Nam, việc ứng dụng công cụ sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược vẫn còn mới mẻ và có rất ít nghiên cứu sử dụng công cụ sinh học phân tử trong nhận diện các thảo dược lưu hành trong nước Do đó, đề tài này được thực hiện với mục đích:

- Tìm hiểu nguyên tắc của các kĩ thuật sinh học phân tử được sử dụng để nhận diện thảo dược

- Bước đầu đánh giá ưu nhược điểm và khả năng áp dụng của từng kĩ thuật sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược

Chương 1 Tổng quan về hiện trạng nghiên cứu và thực hành nhận diện thảo

dược 1.1 Sự cần thiết của việc nhận diện thảo dược

Nhận diện thảo dược là khái niệm liên quan đến việc xác định chính xác loài dùng làm thuốc và phân biệt nó với các loài có thể gây nhầm lẫn hoặc giả mạo đồng thời phát hiện nếu có sự có mặt của loài giả mạo Việc nhận diện thảo dược là một yêu cầu cấp thiết khi mà tình trạng giả mạo vẫn đang là một vấn đề nghiêm trọng tồn tại trên thị trường dược phẩm thế giới Sự giả mạo có thể là do vô tình khi dùng nhầm lẫn các các thảo dược có tên hoặc kiểu hình tương tự nhau hoặc do người kinh doanh cố tình giả mạo nhằm thu được lợi nhuận cao hơn Tuy nhiên, dù là nguyên nhân nào thì đều có thể dẫn đến hậu quả làm mất tác dụng điều trị và gây những tác dụng không mong muốn nghiêm trọng, thậm chí là dẫn đến tử vong Tại Mỹ, Trung tâm chăm sóc sức khỏe California đã báo cáo về một trường hợp bị nhiễm độc do

dùng Clematis chinensis bị lẫn với Podophyllum emodi Trong Podiphyllum emodi

có chứa podophyllotoxin là một hoạt chất có độc tính Hậu quả trên bệnh nhân này

là bệnh lý trên thần kinh ngoại biên theo bệnh nhân đến suốt đời [41] Ở Bỉ, trong

suốt giai đoạn 1990 - 1992, sự nhầm lẫn giữa một thảo dược có độc tính là

Aristolochia fangchi dùng thay thế cho Stephania tetrandra đã làm cho hơn 100 phụ

nữ bị suy thận [13] Năm 2004, ở Hồng Kông có một báo cáo về độc tính do dùng

thảo dược mà nguyên nhân là do sự nhầm lẫn một thảo dược được kê trong đơn

Bệnh nhân đã được kê Aristolochia mollissima thay vì Solanum lytatum Trên thực

tế, hai loại thuốc này có nguồn gốc và tác dụng dược lý khác nhau, điểm chung duy nhất là cùng có tên thông dụng là “Baimaoteng” Sự nhầm lẫn này đã dẫn đến hậu

quả làm suy giảm chức năng thận và ung thư đường tiết niệu trên bệnh nhân [81]

Bên cạnh đó, năm 2004, ở Mỹ và các nước châu Âu như Hà Lan, Pháp, Tây Ban Nha, các báo cáo về tình trạng ngộ độc ở trẻ em sau khi dùng một loại trà có nguồn

gốc từ Illicium verum không ngừng được tăng lên Những trẻ bị ngộ độc thấy xuất

hiện tình trạng co giật, buồn nôn, bồn chồn, nhãn cầu chuyển động nhanh Nguyên

nhân được xác định là do Illicium anisatum đã được dùng thay thế cho Illicium

verum khi sản xuất loại trà này [63] Do những tác dụng không mong muốn nêu trên

nên việc nhận diện chính xác thảo dược đã và đang là một yêu cầu cấp thiết Có nhiều phương pháp đã được sử dụng trong nhận diện thảo dược từ đơn giản đến phức tạp, từ các phương pháp truyền thống đến các phương pháp hiện đại Phương pháp nhận diện dựa vào hình thái là phương pháp đầu tiên được sử dụng, tiếp đó là phương pháp vi học, phương pháp phân tích hóa học và phương pháp dựa vào công

Đối với một cây thuốc, các đặc điểm dùng để định danh bao gồm các đặc điểm như: cây gỗ hay cây thảo, kích thước, hình dạng lá (ví dụ như mép lá có răng cưa hay gợn sóng, lá chia thùy hay không chia thùy), đặc điểm cụm hoa (như dạng chùm, bông, tán), đặc điểm hình thái học thực vật (như dạng bầu trên, bầu dưới hay bầu giữa, hình dạng và số lượng nhị, số lượng lá noãn trong mỗi bầu và số lượng hạt trong mỗi lá noãn) và đặc điểm của rễ bao gồm cấu trúc rễ và dạng rễ (như rễ

chùm, thân rễ hay thân hành) [63]

Đối với một dược liệu từ thực vật, những căn cứ quan trọng để nhận diện là dựa vào hình thái, kích thước, màu sắc và đặc điểm về mùi vị [81] Ví dụ như để

nhận diện được rễ của loài Ligusticum chuanxiong, Dược điển Trung Quốc 10 đã sử

dụng các đặc điểm hình thái, màu sắc, mùi vị để mô tả như sau: rễ có các mấu không đều, đường kính 2 – 7 cm, bên ngoài có màu vàng nâu, thô ráp và khô lại, với

nhiều vòng giống nhau và lớn dần, có các vết lõm, mùi thơm, vị đắng, cay, để lại

cảm giác tê nóng sau đó thì hơi ngọt [69] Bên cạnh cách thức mô tả như trong Dược điển, còn có nhiều cách mô tả trong đời thường như thân rễ Polygonati như đầu gà trống, rễ Codonopsis pilosulae như đầu sư tử, thân rễ Coptidis như cựa gà…

Đây là những cách mô tả rất sinh động giúp dễ dàng nhận diện được vị dược liệu

quan tâm [81]

Phương pháp nhận diện thảo dược dựa vào hình thái là phương pháp đơn giản nhất, nhanh và dễ thực hiện Tuy nhiên, nó phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm của người nhận diện và khó phân biệt các cây thuốc có quan hệ họ hàng gần

như các cây cùng một chi hay họ có hình thái bên ngoài tương tự nhau [81] Bên

cạnh đó, việc nhận biết thảo dược ở dạng bột bằng phương pháp hình thái là không thể thực hiện được Phương pháp vi học ra đời có thể giúp khắc phục được nhược điểm này

1.2.2 Phương pháp vi học

Phương pháp vi học liên quan đến việc sử dụng kính hiển vi để nghiên cứu cấu trúc đặc điểm bên trong cây thuốc và đặc điểm tế bào Khi thảo dược ở dạng chế biến hoặc dạng khô, đặc điểm hình thái bị thay đổi Phương pháp vi học thích hợp cho việc nhận diện thảo dược trong quá trình chế biến như dạng nguyên liệu đã

bị cắt chẻ hoặc ở dạng bột Nó cũng rất có ích trong việc nhận diện các loài có kiểu

hình tương tự nhau [81]

Một ví dụ sử dụng phương pháp vi học để nhận diện thảo dược là trường hợp

ở loài Illicium verum Quả của Illicium verum có tác dụng trừ hàn, kích thích tiêu

hóa, giảm khó tiêu Ở Mỹ và các nước phương Tây, loại thuốc này được sử dụng dành cho trẻ em ở dạng trà gói để chữa đau bụng Tuy nhiên, một số lượng lớn trẻ

sơ sinh sau khi sử dụng loại trà này xuất hiện triệu chứng thần kinh kích thích do

Illicium anisatum đã được dùng thay thế cho Illicium verum Illicium anisatum chứa

các sesquiterpenes có độc tính như anisatin, neoanisatin, và 2-oxyneoanisatin sẽ gây

ngộ độc cho người sử dụng Hai loài này có thể phân biệt với nhau qua hình dạng, màu sắc, vị, mùi, số lượng nang Tuy nhiên, rất khó để phân biệt chúng khi ở dạng bột Phương pháp vi học đã được sử dụng để phân biệt hai loài này Dưới ánh sáng huỳnh quang, hai loài bộc lộ sự khác nhau về đặc điểm tế bào ở vỏ quả ngoài nang

Nang của Illicium verum có các tế bào hình đa giác với lớp màng ngoài có vằn, kích

thước thay đổi chiều dài từ 250 – 300 µm và chiều rộng 100 µm, có màu nâu xanh dưới kính hiển vi huỳnh quang tại vùng UV bước sóng 330 – 380 µm Trái lại, nang

của Illicium anisatum có thành mỏng hơn Tế bào lớp ngoài của nang có chiều dài

từ 15 – 20 µm, có hình trứng hoặc hình thuôn và khác nhau đáng kể về kích thước, chúng có màu xanh vàng nhẹ dưới kính hiển vi huỳnh quang tại vùng UV bước sóng 330 – 380 µm Sự khác nhau này là đặc điểm rất quan trọng để nhận biết được

hai loài Illicium verum và Illicium anisatum [63]

Phương pháp vi học là phương pháp rất thông dụng để nhận diện thảo dược

Nó có mặt trong Dược điển của nhiều nước như Dược điển Anh, Dược điển thảo dược Mỹ, Dược điển Nhật Bản, Dược điển thảo dược Hàn Quốc… Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, khắc phục được nhược điểm của phương pháp hình thái

là có thể xác định thảo dược đã được chế biến hoặc ở dạng bột Tuy nhiên, nó cũng

có nhược điểm là không thể xác định chính xác các loài của một hỗn hợp có quá nhiều thành phần, đồng thời nó không thể giúp phân biệt loài khi ở dạng dịch chiết

[81] Phương pháp phân tích hóa học có thể giúp giải quyết được các khó khăn này

1.2.3 Phương pháp phân tích hóa học

Phương pháp phân tích hóa học là phương pháp căn cứ vào đặc điểm về thành phần hóa học của một dược liệu để xác định dược liệu đó Các phương pháp phân tích hóa học thường được sử dụng là phương pháp sắc ký, phương pháp điện

di và phương pháp quang phổ [81]

Phương pháp sắc ký được sử dụng để thu được dấu vân tay sắc ký của một thảo dược Dấu vân tay sắc ký là sắc ký đồ của các hoạt chất và các thành phần hóa

học đặc trưng có trong dịch chiết của cây đó Dựa vào dữ liệu của dấu vân tay sắc

ký thu được có thể xác định được cây thuốc ngay cả khi lượng mẫu là khác nhau hoặc có thể xác định sự tương đồng hoặc khác biệt giữa các mẫu khác nhau Tuy nhiên, dịch chiết của một cây thuốc chứa hàng trăm hoạt chất khác nhau Một số hoạt chất lại tồn tại với tỉ lệ khác nhau trong các mẫu của cùng một loại thảo dược

Do vậy, điều quan trọng là cần phải chọn phương pháp sắc ký tin cậy để thể hiện thành phần hoạt chất và các thành phần hóa học đặc trưng trong cây thuốc [52]

Phương pháp điện di mao quản cũng được sử dụng trong nghiên cứu thảo

dược do có khả năng tách tốt [31] Dấu vân tay đặc trưng của Flos carthami [16] và

Gingo biloba [71] đã được xây dựng để nhận diện hai loài này ở dạng thảo dược

thô đồng thời giúp phân biệt với loài giả mạo, thay thế

Ngoài ra phương pháp sắc ký và điện di, phương pháp quang phổ cũng được

sử dụng trong nhận diện thảo dược Nguyên tắc chung của các kĩ thuật là sử dụng phương pháp thăm dò nghiên cứu quang phổ điển hình của toàn bộ các chất hóa học được chiết xuất từ mẫu quan tâm Các phương pháp thường dùng là phổ khối, phổ

cộng hưởng từ hạt nhân proton và phổ hồng ngoại (IR) [63]

Các kĩ thuật dựa trên phân tích thành phần hóa học của cây là những công cụ rất hữu ích trong nhận diện thực vật Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của các kĩ thuật này là phụ thuộc vào thành phần hóa học của cây, nhưng thành phần hóa học của cây chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi môi trường sống, vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển Đồng thời, nó còn phụ thuộc vào quá trình thu hái và điều kiện bảo quản mẫu Trong điều kiện bảo quản không tốt, mẫu có thể bị phân hủy làm biến đổi các

thành phần hóa học trong đó, dẫn đến việc nhận diện là không thể [26]

Với sự phát triển của sinh học phân tử và di truyền học thực vật trong những năm gần đây, công cụ di truyền được xem như là một phương pháp đáng tin cậy trong nhận diện nguyên liệu có nguồn gốc thực vật ở cấp độ ADN Phương pháp này tỏ ra chính xác, thuận tiện, đặc hiệu và ổn định Hơn nữa, một lượng nhỏ mẫu là

đủ cho nghiên cứu ADN Trái ngược với các dấu vân tay hóa học chịu ảnh hưởng

nhiều bởi giai đoạn sinh trưởng, phát triển, điều kiện môi trường, điều kiện thu hái,

làm khô và bảo quản, ADN là một đại phân tử tương đối bền vững, ít chịu ảnh

hưởng của các yếu tố bên ngoài, có thể thu được từ mẫu tươi, mẫu đã làm khô, thậm

chí là cả ở mẫu đã qua chế biến Bên cạnh đó, các ADN không đặc trưng cho mô

nên có thể thăm dò ở bất kì giai đoạn sinh trưởng nào của cây [26] Do đó, công cụ

sinh học phân tử rất hữu ích và thích hợp cho nhận diện thảo dược

Chương 2 Các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nhận diện thảo dược

Trong sinh học phân tử, việc nhận diện thảo dược được thực hiện dựa vào các marker di truyền (hay các marker ADN) Marker ADN có thể được hiểu là đoạn ADN đặc trưng thể hiện sự khác biệt ở cấp độ bộ gen Các marker này có thể thu được nhờ sử dụng các phương pháp như phương pháp PCR, phương pháp giải trình

tự ADN và phương pháp ADN microarray [78]

2.1 Các marker dựa trên phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR)

Phản ứng khuếch đại chuỗi (Polymerase chain reaction-PCR) là một kĩ thuật

cơ bản của sinh học phân tử Đây là một phản ứng khuếch đại ADN ở bên ngoài cơ thể sống Trước đây, để giải quyết những trở ngại về số lượng vật chất di truyền cần

có, các kĩ thuật tạo dòng in vitro thường được sử dụng để tạo số lượng lớn vật chất

di truyền Tuy nhiên, kĩ thuật này đòi hỏi thao tác rất phức tạp và tốn rất nhiều thời gian Kĩ thuật PCR ra đời đã khắc phục những khuyết điểm của phương pháp hiện

có Áp dụng kĩ thuật PCR cho phép làm tăng nhanh lượng vật chất di truyền trong thời gian ngắn [2]

Về nguyên tắc, phản ứng PCR là một phản ứng chuỗi, trong đó một phân tử ADN được sử dụng để từ đó tạo ra hai bản sao, sau đó là bốn, tám…Sự nhân đôi liên tục được thực hiện nhờ enzym ADN polymerase [33] Tất cả các ADN polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và ADN polymerase sẽ kéo dài mồi để hình thành mạch mới [2]

Trên cơ sở kĩ thuật PCR, bằng việc sử dụng các mồi khác nhau sẽ thu được các marker ADN khác nhau Các mồi sử dụng có thể là mồi ngẫu nhiên, không yêu cầu thông tin trước về bộ gen hoặc các mồi đặc hiệu khuếch đại một vùng nhất định trên bộ gen mà thông tin về bộ gen cần được biết trước [26] Sau bước khuếch đại

nhờ PCR sử dụng các mồi đặc trưng cho từng kĩ thuật, các sản phẩm thu được sẽ được điện di trên gel để thu được sản phẩm khuếch đại và đánh giá kích thước [78]

2.1.1 Kĩ thuật PCR sử dụng các mồi ngẫu nhiên (RP-PCR)

Kĩ thuật PCR dùng mồi ngẫu nhiên (Random-primed PCR – RP-PCR) là kĩ thuật mà trong đó phản ứng khuếch đại được xảy ra trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi thấp, sử dụng một hoặc hai mồi ngẫu nhiên trong mỗi phản ứng PCR để tạo ra các đoạn ADN đặc trưng Các mồi này sẽ gắn vào các vị trí ngẫu nhiên trên ADN khuôn để khuếch đại Sự đa hình được đánh giá bằng sự có mặt hoặc không có mặt của một băng điện di nhất định [78]

Trong kĩ thuật RP-PCR bao gồm: kĩ thuật PCR với mồi tùy chọn (Arbitrarily primed-PCR – AP-PCR), kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch đại ngẫu nhiên (random amplified polymorphic DNA – RAPD) và kĩ thuật vân tay khuếch

đại ADN (DNA amplification fingerprinting – DAF) Với các kĩ thuật khác nhau thì

mồi được sử dụng có chiều dài khác nhau Kĩ thuật DAF có tính nghiêm ngặt thấp nhất do sử dụng mồi có chiều dài 5 – 8 nucleotid, tiếp đó là RAPD sử dụng mồi có chiều dài 10 nucleotid, AP-PCR sử dụng mồi có chiều dài khoảng 20 nucleotid [78]

Kĩ thuật DAF do sử dụng các mồi ngắn nên mô hình các băng thu được là rất phức tạp [57] Khi chiều dài của mồi tăng lên, số lượng vị trí gắn trên bộ gen mục tiêu giảm đi do giảm cơ hội tìm thấy các vị trí mục tiêu tương đồng hoặc gần tương đồng trên bộ gen [29]

Trong ba kĩ thuật trên, kĩ thuật RAPD được ứng dụng rộng rãi nhất do sự sẵn

có của mồi RAPD trên thị trường [55] Mồi RAPD có chiều dài 10 nucleotid thường

chứa hàm lượng GC từ 50% đến 80% vì trong quá trình lai ADN, nếu hàm lượng

GC nhỏ hơn 50 % thì sẽ không chịu được nhiệt độ của quá trình tổng hợp chuỗi [19]

Hình 1 Nguyên tắc của kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch đại

ngẫu nhiên – RAPD [8]

Một trong các ứng dụng kĩ thuật RAPD trong nhận diện thảo dược là trường

hợp của Senna angustifolia Mục đích của nghiên cứu là nhận diện Senna

angustifolia và phân biệt nó với các loài thân thuộc là S acutifolia, S.tora và S.sophera Trong nghiên cứu này, 32 mồi RAPD được sử dụng để khuếch đại ADN

chiết từ các mẫu, sau đó sản phẩm được điện di trên gel agarose và hiện màu bằng ethidium bromid dưới ánh sáng UV Trong 32 mồi được sử dụng có sáu mồi thu được các băng đặc trưng cho loài Dựa trên điện di đồ thu được thì thấy bốn loài khác nhau và cho thấy sự đa hình cao (Hình 2) Do đó, kĩ thuật này thích hợp để

phân biệt các loài Senna có kiểu hình giống nhau được bán trên thị trường [37]

Hình 2 Nghiên cứu RAPD với các loài S angustifolia, S acutifolia, S sophera,

bộ gen cần nghiên cứu

Bên cạnh những ưu điểm trên, RAPD cũng cho thấy nhược điểm là độ lặp lại (reproducibility) thấp Phản ứng RAPD-PCR chịu ảnh hưởng rất nhiều về điều kiện

phản ứng, độ sạch của mẫu Trong nghiên cứu với Senna angustifolia và các loài

thân thuộc, để khắc phục nhược điểm này, các tác giả chỉ xem xét các băng rõ ràng

và tin cậy Cùng với đó, quá trình chuẩn hóa quy trình chiết ADN từ mẫu và lựa

chọn các thông số kĩ thuật thích hợp cho phản ứng cũng được thực hiện Các ADN thu trong nghiên cứu được làm sạch khỏi các chất chuyển hóa thứ cấp bằng phương pháp CTAB cải tiến của Khan và cộng sự [37] Áp dụng phương pháp chiết tách này cho thấy ADN thu được có độ tinh sạch và chất lượng cao, tỉ lệ hấp thụ

A260/A280 là 1,8 – 2,0 [39] Tiếp đó là quá trình chuẩn hóa điều kiện của phản

ứng Phản ứng PCR được thực hiện với nồng độ MgCl2 khác nhau 0,5mM, 1mM, 1,5mM đồng thời giữ nguyên các thông số khác Nồng độ MgCl2 1,5mM được xác định là tối ưu nhất đã được sử dụng trong phản ứng khuếch đại Ban đầu phản ứng

khuếch đại được thử với nồng độ enzym là 0,9 đơn vị Taq polymerase nhưng quá

trình thực hiện không cho kết quả tốt Do đó, lượng enzym này được giảm xuống 0,5 đơn vị cho mỗi 25µl dung dịch phản ứng Trong các thử nghiệm PCR, nhiệt độ gắn mồi là 360C được xác định Quá trình biến tính ADN là một quá trình nghiêm ngặt trong PCR Trong hầu hết các phản ứng khuếch đại, thời gian ủ để thực hiện quá trình biến tính ADN là một phút ở nhiệt độ 940C Cùng với đó, với mỗi mẫu quá trình được làm ba lần để đảm bảo độ tin cậy của thử nghiệm [37]

Mặc dù tồn tại nhược điểm nêu trên, nhưng do có ưu điểm là nhanh và đơn giản, kĩ thuật RAPD vẫn được ứng dụng rộng rãi để phân biệt các loài dùng làm

thuốc với loài giả mạo thuộc các chi như Echinacea, Typhonium, Dendrobium và các sản phẩm từ nó, rễ của Astragalus, loài Dendrobium officinale, Tinospora

cordifolia, Piper nigrum, Mimosae tenuiflorae, Rahmannia glutinosa [37], Glycirrhiza glabra [38], Cuscuta reflexa và Cuscuta chinensis [35], Ruta graveolens [36] và Picrorhiza kurrooa và loài giả mạo [29]

2.1.2 Kĩ thuật sự đa hình chiều dài của các đoạn ADN có thể khuếch đại trực

tiếp (DALP)

Kĩ thuật sự đa hình chiều dài của các đoạn ADN có thể khuếch đại trực tiếp (Direct amplification of length polymorphisms – DALP) được sử dụng để thu được dấu vân tay ADN của bộ gen và cho phép giải trình tự trực tiếp sản phẩm thu được nếu cần Hai mồi được sử dụng, trong đó một mồi xuôi bao gồm phần trung tâm là

mồi giải trình tự phổ biến M13 (universal M13 sequencing primer) và các trình tự ngẫu nhiên Một mồi ngược chỉ bao gồm mồi M13 Cặp mồi này giúp tạo ra mô hình nhiều băng rất phức tạp Các sản phẩm PCR được thăm dò trên gel polyacrylamid biến tính Do sự thiết kế đặc biệt của mồi, mỗi băng của các mô hình khác nhau có thể được giải trình tự trực tiếp với mồi giải trình tự chung khi cần thiết [58]

Một ví dụ sử dụng kĩ thuật DALP để nhận diện cây thuốc là ở loài Panax

ginseng Sâm là một loại dược liệu quý nên sự giả mạo thường xuyên xảy ra Rất

nhiều nghiên cứu với nhiều kĩ thuật khác nhau đã được khai thác nhằm phân biệt

các loài Panax Ngoài RAPD, kĩ thuật DALP cũng đã được khai thác trong nhận diện Panax ginseng và Panax quinquefolius Trong nghiên cứu sử dụng DALP,

phản ứng khuếch đại được thực hiện với mồi xuôi là (5’-GTT TTC CCA GTC ACG ACG C-3’) và mồi ngược là (5’-AAC AGC TAT GAC CAT GA-3’) Một trong hai mồi được đánh dấu bằng ATP-P33 Kết quả thu được cho thấy một đoạn đặc hiệu

636 bp chỉ xuất hiện ở mẫu Panax ginseng nhưng không xuất hiện tại mẫu Panax

quinquefolius [25]

Như vậy sử dụng DALP có thể giúp phân biệt được hai loài sâm với nhau Cũng như các kĩ thuật RP-PCR, kĩ thuật này có ưu điểm là không yêu cầu bất kì thông tin nào về bộ gen cần nghiên cứu Hơn thế nữa, do sử dụng mồi dài hơn cũng như mức độ chính xác yêu cầu cao hơn, kĩ thuật này cho thấy độ tin cậy cao hơn so với các kĩ thuật RP-PCR

2.1.3 Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại (AFLP)

Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại (Amplified fragment length polyphorphism – AFLP) là kĩ thuật liên quan đến sự khuếch đại toàn bộ các đoạn ADN giới hạn từ ADN bộ gen sau khi đã được cắt nhờ các enzym giới hạn [60]

AFLP là sự kết hợp giữa kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn giới hạn (Restriction fragment length polymorphism – RFLP) và kĩ thuật PCR RFLP là một

kĩ thuật dựa trên kĩ thuật lai phân tử Trong RFLP, đoạn ADN được cắt bằng enzym giới hạn sau đó điện di trên gel agarose Các băng ADN đa hình được chuyển lên màng lai và lai với mẫu dò được đánh dấu hóa học Sự đa dạng được đánh giá bằng

sự có mặt hoặc vắng mặt của các băng [26]

Trong kĩ thuật AFLP, ADN bộ gen sẽ được cắt nhờ các enzym giới hạn tại nhiều vị trí giới hạn khác nhau ở nhiều locus để tạo ra các đoạn giới hạn có đầu dính, các enzym cắt được sử dụng là sự kết hợp giữa một enzym cắt hiếm (rare

cutter) (EcoRI hoặc PstI) với một enzym cắt thường (frequent cutter) (MseI hoặc

TaqI) ADN cần phải tinh sạch khỏi các chất ức chế ảnh hưởng đến enzym giới hạn

Sau đó, các đoạn giới hạn sẽ được gắn với các adaptor ở cuối đoạn tạo ra trình tự đã biết cho phản ứng khuếch đại PCR tiếp theo Sau khi thực hiện bước gắn adaptor, phản ứng khuếch đại ban đầu được thực hiện sử dụng mồi có bổ sung thêm một nucleotid chọn lọc Kế đó, phản ứng khuếch đại chọn lọc được thực hiện với mồi bổ sung thêm 3 nucleotid chọn lọc, một trong hai mồi được đánh dấu huỳnh quang

hoặc phóng xạ Quá trình khuếch đại được thực hiện trong điều kiện nghiêm ngặt

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid biến tính với thiết bị tự ghi phóng xạ, hiện màu bằng AgNO3 hoặc dùng máy giải trình tự tự động [60]

Hình 3 Nguyên tắc của kĩ thuật AFLP [60]

Kĩ thuật AFLP đã được nghiên cứu trong nhận diện các loài thuộc chi

Swertia Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân biệt loài Swertia chirayita với các

loài cùng chi là Swertia angustifolia, Swertia bimaculata, Swertia ciliata, Swertia

cordata và Swertia alata thông qua các marker AFLP đặc trưng Sau khi chiết tách

được ADN của các loài này, các đoạn ADN được cắt bằng enzym EcoRi và Tru9I,

quá trình gắn adaptor được thực hiện đồng thời trong một hỗn hợp phản ứng Phản ứng được ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng Quá trình khuếch đại ban đầu được thực

hiện với mồi MseI gắn thêm nucleotid C ở đầu 3’ và mồi EcoRI gắn thêm nucleotid

A ở đầu 3’ Bước khuếch đại tiếp theo sử dụng mồi MseI 5’-[Primer-Cxx]-3’ và mồi

EcoRI 5’-[Primer-Axx]-3’, trong đó mồi EcoRI được đánh dấu huỳnh quang Sản

phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamid Kết quả thu được cho thấy trong 64 cặp mồi được sử dụng thì có 46 cặp tạo các băng ADN Trong tổng số 5312 băng thì có đến 5304 băng đa hình Trong các băng này, 743 băng đặc trưng cho các loài khác nhau được nghiên cứu Các đoạn đặc trưng cho sáu loài nghiên cứu đã được xây dựng dựa vào nghiên cứu này cho thấy AFLP hoàn toàn có thể sử dụng để nhận

biết Swertia chirayita và các loài họ hàng của nó [51]

Trong nghiên cứu trên có một số điểm đặc biệt Thứ nhất là trong hỗn hợp phản ứng cắt và gắn adaptor, ngoài các thành phần thông thường còn có sự có mặt của albumin huyết thanh bò (bovine serum albumin – BSA) BSA được cho vào nhằm mục đích ngăn cản các thành phần lẫn trong ADN chưa tinh sạch gắn vào enzym, có thể ngăn cản hoạt động của enzym [42] Thứ hai là một trong hai mồi dùng trong bước khuếch đại chọn lọc cần phải được đánh dấu để phục vụ cho bước tiếp theo là thăm dò các đoạn AFLP trên gel polyacrylamid Thứ ba là nhiệt độ gắn mồi là 560C Nhiệt độ này cao hơn so với kĩ thuật RAPD Đây chính là ưu điểm của phương pháp AFLP so với RAPD vì nhiệt độ phản ứng thấp sẽ làm giảm tính đặc hiệu của phản ứng

So sánh kĩ thuật AFLP và kĩ thuật RAPD cho thấy kĩ thuật AFLP đáng tin cậy hơn và có tính lặp lại cao hơn Đồng thời, số lượng băng ADN đa hình thu được

trong một loài với kĩ thuật AFLP lớn hơn so với kĩ thuật RAPD [45] Tuy nhiên,

RAPD lại nhanh, đơn giản và quá trình thực hiện không trải qua nhiều bước phức tạp như kĩ thuật AFLP Một nhược điểm nữa của AFLP so với RAPD là phương pháp này còn sử dụng gel polyacrylamid kết hợp hiện hình bằng muối bạc đồng thời

sử dụng phương pháp thăm dò bằng huỳnh quang do đó sẽ làm chi phí cao hơn và

tốn công sức hơn RAPD

Kĩ thuật AFLP ngoài sử dụng để nhận diện Swertia chirayita còn được sử dụng để nhận diện các loài thuộc chi Zingiber là Zingiber officinale, Z montanum

và Z zerumbet [22]

2.1.4 Kĩ thuật sự đa hình các trình tự khuếch đại được phân cắt (CAPS)

Kĩ thuật sự đa hình các trình tự khuếch đại được phân cắt (Cleaved amplified polymorphism sequence – CAPS), với tên gọi ban đầu PCR-RFLP, là sự kết hợp của kĩ thuật PCR với kĩ thuật RFLP Quá trình tạo marker CAPS được thực hiện qua hai bước Đầu tiên, một trình tự xác định được khuếch đại sử dụng mồi đặc hiệu Tiếp theo, sản phẩm thu được sẽ được cắt bằng enzym giới hạn, thường là enzym nhận biết đặc hiệu bốn base Các đoạn cắt ra sẽ được tách trên gel agarose

[26]

Cả hai kĩ thuật CAPS và AFLP có điểm giống nhau là dựa trên hai kĩ thuật RFLP và PCR Tuy nhiên, điểm khác nhau giữa CAPS và AFLP là thứ tự thực hiện của hai kĩ thuật này Trong kĩ thuật AFLP, bước cắt bằng bằng enzym giới hạn được thực hiện trước, tiếp đó là bước khuếch đại PCR Trái lại, trong kĩ thuật CAPS bước

khuếch đại lại được thực hiện trước, kế đó mới là bước cắt bằng enzym giới hạn

Hình 4 Nguyên tắc của kĩ thuật CAPS [6]

Một ví dụ sử dụng CAPS trong nhận diện cây thuốc là ở loài Paris

polyphylla var yunnanensis Trong nghiên cứu này, kĩ thuật CAPS đã được sử

dụng nhằm mục đích phân biệt loài P polyphylla var yunnanensis với các loài

thân thuộc có kiểu hình giống nhau và việc nhầm lẫn thường xuyên xảy ra Mẫu

dùng để khuếch đại được lấy từ 12 loài bao gồm Paris polyphylla var yunnanensis

và 11 loài thân thuộc là P dunniana, P daliensis, P vietnamensis, P mairei, P

cronquistii, P delavayi var delavayi, P thibeitca, P fargessi, P delavayi var petiolata, P marmomata và P axialis Phản ứng khuếch đại được thực hiện sử

dụng hai mồi là ITS1 và ITS5 để khuếch đại toàn bộ vùng ITS Các trình tự thu

được sau đó được đem so sánh và kết quả thu được cho thấy Paris polyphylla var

yunnanensis có một vị trí đặc trưng (C/GGCCA) có thể cắt được bằng enzym giới

hạn EaeI tại vị trí 200 Nghiên cứu trên 11 loài còn lại không thấy có vị trí này Điều này cho thấy rằng vùng ITS của Paris polyphylla var yunnanensis có thể được

cắt thành 2 đoạn trong khi ở các loài còn lại thì không Sau khi được phân cắt nhờ

enzym giới hạn, hai đoạn thu được từ mẫu Paris polyphylla var yunnanensis và các

mẫu cho kết quả âm tính được quan sát thấy trên bản điện di trên gel Do có kích thước khác nhau nên hai đoạn này có thể phân tách nhau trên gel agarose 1,5% điện

di Như vậy, việc nhận diện Paris polyphylla var yunnanensis bằng CAPS là có thể

thực hiện được [49]

Hình 5 Nghiên cứu CAPS trên các sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1, ITS5 và

được cắt bằng enzym giới hạn EaeI [49]

1 Paris daliensis; 2 P vietnamensis; 3 P mairei; 4 P cronquistii; 5 P

delavayi var.delavayi; 6 P thibeitca; 7 P fargessi; 8 P delavayi var petiolata; 9

P marmomata;10 P axialis; 11 P dunniana; 12 P polyphylla var yunnanensis; M: Thang ADN

Nghiên cứu tương tự được thực hiện với Actinidia macrosperma là một dược liệu nổi tiếng về tác dụng kháng ung thư cùng với các loài giả mạo với nó là A

valvata và A melanandra Nghiên cứu này được thực hiện dựa trên trình tự trnK,

là một trình tự ADN lục lạp Do Actinidia macrosperma có mô hình điện di trên gel

đặc trưng sau khi cắt bằng enzym nên việc nhận diện nó cũng có thể được thực hiện

nhờ kĩ thuật CAPS [80]

Qua các nghiên cứu trên có thể thấy rằng khả năng của kĩ thuật này trong thăm dò đa dạng ADN là không cao như phương pháp AFLP vì sự thăm dò bằng CAPS yêu cầu cần có sự thay đổi nucleotid ảnh hưởng đến vị trí giới hạn thì mới có thể thực hiện được Nghiên cứu trên thực hiện được là vì có các sự thay đổi vị trí cắt giới hạn cần thiết Nếu không có những sự thay đổi này thì việc áp dụng CAPS trong nhận diện là không thể thực hiện được Cũng có thể thấy rằng trong các nghiên cứu trên, việc lựa chọn vùng nghiên cứu của tác giả là hợp lý Vùng ITS của

ADN ribosom và vùng trnK của ADN lục lạp là hai vùng mà sự đa hình thường

xuyên xảy ra Sự lựa chọn vùng nghiên cứu hợp lý đã đóng góp vào thành công của các nghiên cứu

Ngoài nhận diện hai loài trên CAPS còn được ứng dụng để nhận diện nhiều

loài khác thuộc các chi Alisma, Angelica, Sinopodophyllum và Dysosma, Ephedra,

Fritillaria, Artemisia, Panax, Atractylodes, Glehnia, Astragalus, Den-drobium, Duboisia và Codonopsis [26]

2.1.5 Kĩ thuật phân tích các trình tự lặp đơn giản (SSR)

Các ADN siêu vệ tinh là các trình tự ADN lặp lại song song, với các đơn vị lặp lại dài 1 – 6 bp, phân bố trên khắp bộ gen [26] Đặc điểm nổi bật của các siêu vệ tinh là tính không vững bền Tần số đột biến của các siêu vệ tinh cao, nằm trong khoảng 10-2 đến 10-6 tại mỗi locus trong mỗi thế hệ do đột biến thêm vào hoặc mất

đi các đơn vị lặp lại, xuất hiện do trượt lỗi trong quá trình sao chép (ADN

replication slippage) và tái tổ hợp Do đó, số lượng các đơn vị lặp lại tại mỗi vị trí trong bộ gen là khác nhau giữa các loài [56] Trái ngược với các trình tự siêu vệ

tinh, các đoạn ADN nằm cạnh chúng lại có sự bảo tồn cao giữa các cá thể trong

cùng một loài và đôi khi là giữa các loài khác nhau [59] Sự khác nhau về số lượng các đoạn lặp lại ở siêu vệ tinh và sự bảo tồn của các vị trí bên cạnh nó chính là cơ sở

để tạo ra các marker về sự đa dạng sử dụng trong sinh học phân tử

Trong kĩ thuật phân tích các trình tự lặp đơn giản (Simple sequence repeats analysis – SSR), các siêu vệ tinh được khuếch đại nhờ sử dụng mồi là trình tự ở vùng bên cạnh các siêu vệ tinh này Các mồi PCR được thiết kế đặc hiệu với một vị trí trên bộ gen Cặp mồi đặc hiệu có thể sử dụng được cho mỗi cá thể trong loài và tạo ra nhiều sản phẩm với kích thước khác nhau ứng với mỗi chiều dài khác nhau của các siêu vệ tinh [8]

Hình 6 Nguyên tắc của kĩ thuật phân tích các trình tự lặp lại đơn giản SSR [6]

Nghiên cứu SSR đã được ứng dụng trong nhận diện các loài sâm Trong

nghiên cứu SSR, Panax ginseng cho thấy mô hình điện di khác nhau so với Panax

quinquefolius Hơn nữa, kĩ thuật này còn có thể giúp nhận diện giữa loài Panax quinquefolius được trồng với loài này mọc ở trong tự nhiên [40]

Nhìn chung sử dụng SSR trong nhận diện cây thuốc đã đem lại một công cụ hiệu quả, chính xác và có độ tin cậy cao trong nhận diện cây thuốc Tuy nhiên, sử dụng phương pháp này cũng tồn tại những nhược điểm là tốn kém và tốn công sức khi phải nghiên cứu các đoạn thu được trên gel polyacrylamid, hiện màu bằng muối bạc vì các đoạn ADN thu được có sự sai khác nhau rất ít về kích thước [28]

2.1.6 Kĩ thuật sự đa hình trình tự giữa các vùng lặp (ISSR)

Kĩ thuật sự đa hình trình tự giữa các vùng lặp (inter-simple sequence repeat polymorphism – ISSR) là một kĩ thuật sử dụng PCR để khuếch đại đoạn ADN nằm giữa hai vùng siêu vệ tinh có trình tự giống nhau nhưng định hướng ngược chiều nhau Khoảng cách giữa hai vùng này phải nằm trong khoảng có thể khuếch đại được Mồi được sử dụng là các trình tự ADN có chiều dài từ 15 – 30 bp bổ sung với

2 siêu vệ tinh kế tiếp nhau, do đó giúp khuếch đại đoạn ADN ở giữa [60] Thông

thường, các mồi sử dụng trong phản ứng khuếch đại này thường được gắn thêm một

mỏ neo là các nucleotid chọn lọc ở đầu 3’ hoặc 5’ để ngăn cản mồi gắn vào trình tự nằm giữa hai siêu vệ tinh, từ đó, có thể làm giảm số băng ADN thu được khi mồi

gắn vào vùng siêu vệ tinh có đơn vị lặp lại chứa hai nucleotid [78] Sản phẩm thu

được có thể được thăm dò bằng điện di trên gel agarose hoặc điện di trên gel

polyacrylamid [60]

Hai kĩ thuật SSR và ISSR đều liên quan đến siêu vệ tinh Tuy nhiên, trình tự mồi và đoạn ADN mục tiêu thu ở hai kĩ thuật là khác nhau Kĩ thuật SSR dùng các mồi bổ sung với trình tự bên cạnh các siêu vệ tinh để thu được các đoạn ADN mục tiêu chính là các đoạn siêu vệ tinh Trái lại, kĩ thuật ISSR sử dụng mồi là các trình

tự lặp lại, bổ sung với hai siêu vệ tinh, đoạn ADN mục tiêu nằm giữa hai siêu vệ tinh đó Hay nói cách khác, đoạn ADN mục tiêu trong kĩ thuật ISSR là đoạn nằm ngoài đoạn siêu vệ tinh

Hình 7 Nguyên tắc của kĩ thuật ISSR – PCR [60]

Tái hiện quá trình khuếch đại với một mồi đơn (AG)8

(a) Mồi (AG)n không gắn mỏ neo có thể bắt cặp ở bất cứ vị trí nào trên vùng lặp lại (TC)n của phân tử ADN khuôn dẫn đến việc tạo ra kết quả nhiễu trên băng điện di ADN

(b) Mồi (AG)n gắn thêm 2 nucleotid (NN) tại đầu 3’ được bắt cặp với vùng đặc hiệu trên phân tử ADN khuôn tạo dạng băng sạch trên điện di đồ

(c) Mồi (AG)n được gắn thêm 2 nucleotid (NN) tại đầu 5’ bắt cặp với vùng đặc trưng trên phân tử ADN khuôn tạo băng có kích thước lớn hơn

Kĩ thuật ISSR đã được áp dụng để nhận diện các loài Rheum officinale,

Rheum palmatum và Rheum tanguticum Các loài này có kiểu hình về cây cũng như

sản phẩm chế biến rất giống nhau, do đó việc nhầm lẫn thường xuyên xảy ra Nghiên cứu ISSR được thực hiện sử dụng 15 mồi chọn lọc và tạo ra 132 đoạn ADN

đa hình Số lượng vị trí được thăm dò với mỗi mồi là từ 7 đến 14 vị trí và kích thước sản phẩm thay đổi từ 200 – 1700bp Điều này cho thấy các trình tự ADN nằm giữa các vùng siêu vệ tinh rất mở rộng và có độ phân tán cao trong các bộ gen của

ba loài này Trong 15 mồi này, 3 mồi tạo ra các băng có độ đa hình cao và đáng tin cậy trong ba loài được lựa chọn để tạo ra các marker đặc hiệu trong nhận diện chúng (Hình 8) Việc nhận diện ba loài này bằng phương pháp ISSR là hoàn toàn có

51, 52, 53 và 560C đã được thử nghiệm với tất cả các mồi để chọn ra nhiệt độ cho kết quả tối ưu nhất Một điều đáng lưu ý nữa là để việc nhận diện hiệu quả và kiểm soát sự biến dị cá thể, chỉ các băng chọn lọc có mặt ở tất cả năm cá thể trong mỗi loài mới được chọn lựa để nghiên cứu

Nhìn chung, cũng như RAPD và AFLP, phương pháp này có ưu điểm là không yêu cầu phải biết trước thông tin về bộ gen So với RAPD, phương pháp này cũng đơn giản và nhanh nhưng lại cho độ chính xác cao hơn RAPD So với AFLP, ISSR có ưu điểm là đơn giản hơn, dễ thực hiện hơn và không cần phải giải trình tự

Do đó, sử dụng ISSR trong nhận diện thảo dược, đặc biệt là trong những mẫu nhiều thành phần, thì chi phí sẽ thấp hơn so với sử dụng kĩ thuật AFLP

Do những ưu điểm của nó, ISSR còn được dùng để nhận diện nhiều loài khác

như các loài thuộc chi Cistanche bao gồm Cistanche deserticola, C tubulosa, C

salsa và C sinensis [62], các loài thuộc các chi Dendrobium, Fritillaria, Salvia, Vitex, Cannabis, Rhodiola và Houttuynia [26]

2.1.7 Kĩ thuật khuếch đại trực tiếp vùng ADN tiểu vệ tinh (DAMD)

Tiểu vệ tinh cũng là một loại ADN lặp lại song song có mặt trong bộ gen của sinh vật nhân chuẩn Chúng tương tự như siêu vệ tinh ngoại trừ các đơn vị lặp lại dài hơn 10bp Các tiểu vệ tinh cho thấy sự đa dạng chiều dài các allel Kĩ thuật khuếch đại trực tiếp vùng ADN tiểu vệ tinh (Directed amplification of minisatellite-region DNA – DAMD) là kĩ thuật liên quan đến việc khuếch đại vùng giàu tiểu vệ tinh với mức độ nghiêm ngặt khá cao nhờ sử dụng mồi đặc hiệu là trình tự trung tâm của đoạn lặp lại song song [30], [78]

Kĩ thuật này được khai thác để nhận diện Panax ginseng và Panax

quinquefolius Trong nghiên cứu với hai loài này, phản ứng khuếch đại được thực

hiện với mồi Pge2 là trình tự tiểu vệ tinh ở trung tâm dài 22 bp Kết quả thu được cho thấy bên cạnh các băng có mặt ở cả hai loài sâm thì có ba băng 990, 1490 và

1640 bp đặc trưng chỉ có mặt Panax quinquefolius nhưng không thấy ở Panax

ginseng Nghiên cứu này cho thấy bằng việc sử dụng mồi tiểu vệ tinh Pge2 (Hình 9)

có thể giúp phân biệt P ginseng và P quinquefolius [24]

Hình 9 Trình tự của tiểu vệ tinh Pge2 [24]

Bên cạnh sử dụng để nhận biết hai loài sâm ở trên, kĩ thuật DAMD còn được

sử dụng nhằm mục đích nhận diện năm loài Salvia là Salvia tomentosa, Salvia

sclarea, Salvia virgata, Salvia fruticosa và Salvia dichroantha Trong nghiên cứu

này, 22 mồi có trình tự giống vùng trung tâm tiểu vệ tinh được sử dụng để khuếch

đại các mẫu từ năm loài Salvia cùng với mẫu từ hai loài khác là Origanum

majorona và Sideritis pisidica Điểm đặc biệt của phản ứng khuếch đại này là sử

dụng nhiệt độ gắn mồi cao ngay từ đầu là 600C, sau đó giảm dần nhiệt độ xuống

550C nhằm mục đích loại trừ việc thu được các sản phẩm khuếch đại không chính xác Sau bước giảm nhiệt độ, nhiệt độ gắn mồi được áp dụng ở 550C Kết quả thu được 70 marker đặc hiệu cho các loài có kích thước từ 186 – 2000 bp Trong các

marker đặc hiệu thu được thì S virgata có 20 marker đặc hiệu, S tomentosa có 9 marker đặc hiệu, S fruticosa có 13 marker đặc hiệu, S dichroantha có 11 marker đặc hiệu và S sclarea có 17 marker đặc hiệu [30]

Kết quả trên cho thấy có thể sử dụng kĩ thuật DAMD để nhận diện các loài

Salvia khác nhau So với RAPD, phương pháp này tỏ ra có độ tin cậy cao hơn do sử

dụng nhiệt độ gắn mồi cao làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng gắn mồi

2.1.8 Kĩ thuật khuếch đại vùng đặc trưng (SCAR)

Kĩ thuật khuếch đại vùng đặc trưng (Sequence characterized amplified regions – SCAR) là một kĩ thuật mà trong đó các đoạn ADN đặc trưng cho một vị trí xác định trên bộ gen được khuếch đại nhờ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu [6] Mồi SCAR là các đoạn oligonucleotid có chiều dài 15 – 30 bp được thiết

kế dựa vào các đoạn đa hình thu được sau các phản ứng RAPD-PCR [6], ISSR-PCR [6] hoặc AFLP-PCR [45] Để thu được mồi, các đoạn đa hình này được nhân dòng

và giải trình tự Trình tự này được dùng để thiết kế mồi Sự đa hình được đánh giá bằng sự có mặt hay vắng mặt của đoạn SCAR trên băng điện di [6]

Hình 10 Nguyên tắc của kĩ thuật SCAR (sử dụng mồi SCAR đặc hiệu từ

marker RAPD) [61]

Kĩ thuật AFLP-SCAR đã được áp dụng để phân biệt Panax notoginseng với các loài khác trong chi Panax là Panax ginseng, Panax japonicus, Panax

quinquefolius Đầu tiên, phản ứng khuếch đại AFLP-PCR được thực hiện với các

loài này Một băng AFLP rõ ràng và đặc trưng cho Panax notoginseng được tạo ra

Sau khi tách và giải trình tự đoạn AFLP này thu được một trình tự PNG8 dài 509bp

Dựa trên trình tự PNG8, hai mồi đặc hiệu cho Panax notoginseng là PNG8-1 và

PNG8-2 đã được thiết kế, từ đó lần lượt cho các đoạn ADN dài 402 và 260 bp Nghiên cứu này đã thành công trong việc xây dựng mô hình băng khuếch đại đặc

trưng của Panax notoginseng so với các loài Panax ginseng, Panax japonicus,

Panax quinquefolius Từ đó, cho thấy việc nhận diện Panax notoginseng sử dụng

mồi SCAR đặc hiệu là hoàn toàn có thể [45]

Hình 11 Trình tự của đoạn ADN đặc trưng cho loài Panax notoginseng [45]

Tổng chiều dài của đoạn ADN (PNG8) là 509 bp Mồi được thiết kế cho phản ứng PCR được gạch chân và đặt tên là PNG 8-1 ( -) và PNG 8-2 (–––)

Bảng 1 Trình tự mồi SCAR dùng cho phản ứng khuếch đại PCR [45] Marker SCAR Trình tự (5’ đến 3’)

PNG 8-1

Xuôi: CTCCGACAAGGGTGGCTGGAA Ngược: GCCACTTCCAACAATGATACCAT

PNG 8-2

Xuôi: CTTAGACCAAAGCCTCAGCA Ngược: GAGGGTGGGAGGAGGTAAA

Sau bước khuếch đại sử dụng mồi SCAR đặc hiệu, sản phẩm thu được sau đó được điện di trên gel agarose, hiện màu bằng ethidium bromid Sự có mặt hoặc vắng mặt của các băng thu được được so sánh với các mẫu của các loài khác Trong quá trình thực hiện phản ứng khuếch đại SCAR, việc tối ưu hóa các các điều kiện là cần thiết để đảm bảo độ tin cậy của nghiên cứu Hai nhiệt độ 580C và 620C lần lượt được thử nghiệm Nhiệt độ 620C cho thấy tối ưu hơn cho nhận diện P notoginseng

với các loài khác do cho các băng rõ nét hơn Do đó, điều kiện tối ưu được lựa chọn

là 5 phút 950C, 32 chu kì với 30 giây tại 950C, 30 giây tại 620C và 30 giây tại 720C

và cuối cùng là giai đoạn kéo dài trong 10 phút ở 720C So sánh với marker AFLP, marker SCAR ổn định hơn, rõ ràng hơn và đặc biệt là thuận tiện hơn trong thực hành Do đó, việc chuyển từ marker AFLP sang SCAR đem lại một phương pháp hiệu quả hơn để nhận diện các loài thảo dược khác nhau

Các mồi SCAR cũng có thể được xây dựng từ các đoạn RAPD đa dạng

Trường hợp Phyllanthus amarus là ví dụ Phyllanthus amarus là một loài cây được

sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền tại Thái Lan do có tác dụng lợi tiểu, chữa các

bệnh về gan và các bệnh truyền nhiễm do virus Hai loài thân thuộc của Phyllanthus

amarus là Phyllanthus debilis và Phyllanthus urinaria với tác dụng khác và ít hiệu

quả hơn thường dễ bị nhầm lẫn với Phyllanthus amarus do có kiểu hình tương tự

Đầu tiên, khuếch đại RAPD-PCR được thực hiện để thu được các marker RAPD