học phân tử
Nhận diện thảo dược đóng vai trò rất quan trọng trong việc đảm bảo hiệu quả điều trị, an toàn cho người sử dụng, giảm sự thiếu công bằng trong thương mại và đem lại lòng tin cho người tiêu dùng. Đồng thời, nhận diện chính xác thảo dược cũng góp phần trong việc chuẩn hóa và công nghiệp hóa các thuốc có nguồn gốc thảo dược. Cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học hiện đại, các kĩ thuật sinh học phân tử ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Các kĩ thuật này bước đầu đã được ứng dụng có hiệu quả để nhận diện thảo dược. Sử dụng sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược có thể khắc phục được một số các nhược điểm của các phương pháp nhận diện hiện có như phương pháp nhận diện dựa vào hình thái, phương pháp vi học và phương pháp phân tích thành phần hóa học. Nhận diện thảo dược sử dụng công cụ sinh học phân tử có thể thực hiện với nhiều dạng khác nhau của của thảo dược từ mẫu tươi, mẫu khô đến mẫu đã sơ chế và kết quả không chịu ảnh hưởng bởi giai đoạn phát triển của thực vật, điều kiện môi trường, điều kiện thu hái... Do đó, phương pháp nhận diện dựa trên chỉ thị ADN là một công cụ tiên tiến, hiệu quả cho mục đích nhận diện thảo dược.
Tuy nhiên không có một phương pháp nào là hoàn hảo tuyệt đối. Bên cạnh những ưu điểm vượt trội, việc sử dụng phương pháp nhận diện thảo dược dựa trên ADN cũng phải đối mặt với một số khó khăn, thách thức.
Vấn đề đầu tiên là sự thoái biến của ADN. Ở thảo dược, sự thoái biến của ADN thường xuyên xảy do chúng thường được xử lý bằng nhiệt (phơi hoặc sấy khô), xay, nghiền hoặc được xử lý với nhiều chất hóa học khác nhau [78]. Vấn đề này có thể được giải quyết nhờ việc lựa chọn các kĩ thuật có thể áp dụng các ADN thoái biến. Một số kĩ thuật trong đó sử dụng các gen có nhiều bản sao (như gen ribosom), từ đó, cơ hội để thu được trình tự của toàn bộ gen là cao hơn. Một giải
pháp khác là sử dụng các kĩ thuật trong đó việc khuếch đại được thực hiện tại các vùng ADN có kích thước nhỏ, ví dụ như kĩ thuật nghiên cứu SSR với các trình tự mục tiêu thường có chiều dài khoảng vài chục bp do đó nguy cơ xảy ra đứt gãy ở bên trong đoạn trình tự mục tiêu này sẽ thấp hơn. Sử dụng kĩ thuật lai ADN microarray cũng rất hữu ích trong việc nhận diện các ADN đã bị thoái biến [78]. Ví dụ như kĩ thuật ADN microarray đã được áp dụng với hai loài Panax ginseng và
Panax quinquefolius ở dạng rễ đã chế biến và đã thành công trong việc nhận diện hai loài này [54].
Sự có mặt của các chất ức chế chuỗi phản ứng PCR cũng là một vấn đề cần quan tâm [78]. Thảo dược thường chứa các hợp chất phenolic, các polysaccharid và các sắc tố. Các chất này có thể đóng vai trò là những yếu tố ức chế phản ứng PCR. Lựa chọn một phương pháp chiết tách thích hợp có thể loại trừ được các yếu tố ảnh hưởng đến nói trên. Một giải pháp nữa là pha loãng ADN mẫu và thêm vào đó chất làm tăng cường phản ứng PCR [78]. Ví dụ như trong quá trình nghiên cứu ba loài
Tribulus terrestris, Tribulus lanuginosus và Tribulus subramanyamii, sau khi thử nhiều quy trình hướng dẫn chiết tách ADN khác nhau, phương pháp chiết tách ADN được mô tả bởi Milligan với một số cải tiến đã được lựa chọn. Dung dịch chiết tách được bổ sung LiCl có tách dụng loại bỏ các hợp chất polyphenol và polysaccharid. Hỗn hợp chloroform và isoamyl alcol được sử dụng để loại tạp, chủ yếu là protein do protein biến tính chuyển vào trong pha dầu còn ADN nằm ở pha nước. RNase cũng được sử dụng để loại bỏ ARN lẫn với ADN. Sử dụng phương pháp này thu được ADN có chất lượng tốt, tỉ lệ A260/A280 đạt 1,6 – 1,8 [9].
Vấn đề ngoại nhiễm bởi các ADN không thuộc loài mục tiêu cũng cần được xem xét [78]. Các ADN này có thể bắt nguồn từ nấm, vi khuẩn hoặc các côn trùng nhiễm vào trong thảo dược do quá trình bảo quản không đúng hoặc do các ADN từ các thực vật khác bị lẫn trong công thức phối hợp. Các ADN này sẽ được khuếch đại cùng với các ADN mục tiêu gây ảnh hưởng đến kết quả thu được. Vấn đề này có thể được giải quyết bằng một quy trình xử lý mẫu, dụng cụ thao tác nghiêm ngặt
hoặc sử dụng các kĩ thuật đặc trưng cho các ADN mục tiêu như kĩ thuật ARMS hoặc SCAR [78]. Ví dụ như trong nghiên cứu ở ba loài Phyllanthus amarus,
Phyllanthus urinaria và Phyllanthus debilis sử dụng kĩ thuật SCAR. Trong một hỗn hợp đồng lượng của ba loài trên, mồi SCAR đặc hiệu được thiết kế cho loài
Phyllanthus amarus chỉ khuếch đại các băng đặc trưng cho loài này mà không tạo ra băng ADN với các ADN nhiễu từ hai loài còn lại. Trường hợp tương tự khi sử dụng mồi đặc hiệu cho loài P. urinaria hoặc P. debilis. Mồi này chỉ khuếch đại ADN từ loài mục tiêu và không khuếch đại đoạn ADN ngoại nhiễm [68]. Bên cạnh sử dụng hai kĩ thuật SCAR và ARMS, nếu vùng nghiên cứu đặc trưng cho loài và quy trình xử lý và bảo quản mẫu nghiêm ngặt thì có thể sử dụng nghiên cứu microarray để nghiên cứu hỗn hợp ADN [78].
Mặc dù còn tồn tại những điểm hạn chế, các công cụ sinh học phân tử vẫn là một phương pháp hiệu quả trong nhận diện thảo dược và những điểm hạn chế còn tồn tại hoàn toàn có thể khắc phục được. Hiện nay đã có nhiều loại vân tay hoặc mã vạch đã được áp dụng rộng rãi trên toàn thế giới như dấu vân tay SCAR, ISSR hay mã vạch ITS.
Trong sinh học phân tử, có rất nhiều kĩ thuật có thể được sử dụng để nhận diện thảo dược. Căn cứ để nhận diện thảo dược là các marker ADN có thể thu được nhờ các phương pháp khuếch đại PCR với nhiều loại mồi khác nhau, phương pháp giải trình tự ADN và phương pháp ADN microarray. Trong mỗi phương pháp này lại có rất nhiều kĩ thuật khác nhau. Một khó khăn cho những nhà nghiên cứu là việc phải lựa chọn một hoặc một số marker phù hợp cho các nghiên cứu của mình. Một marker phù hợp là một marker có sự đa hình cao, xuất hiện trong bộ gen với tần suất lớn, quy trình thực nghiệm đơn giản, nhanh, chi phí thấp, hiệu suất cao, độ tin cậy cao và có khả năng trao đổi dữ liệu giữa các phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, không một kĩ thuật nào có thể đạt được tất cả các tiêu chuẩn này. Do đó, việc lựa chọn marker cho một nghiên cứu phải xem xét đến các yếu tố sau:
- Mức độ đơn giản của kĩ thuật và thời gian cần để thực hiện. - Khả năng phản ánh mức độ đa hình của marker.
- Chất lượng và số lượng mẫu ADN hiện có.
- Khả năng trao đổi dữ liệu giữa các phòng thí nghiệm. - Kích thước, số lượng mẫu nghiên cứu.
- Thiết bị và các kĩ năng cần thiết. - Chi phí thực hiện.
Các đặc điểm SCAR ARMS SSR CAPS RP-PCR ISSR AFLP Giải trình Lai Chi phí phát triển Trung bình Trung bình Cao Trung bình Thấp Thấp Thấp Trung bình Trung bình
Chi phí vận hành Thấp Thấp Trung bình Trung
bình Thấp Thấp Trung bình Trung bình Trung bình
Số vị trí khuếch đại Một vị trí Một vị trí Một vị trí Một vị trí Nhiều vị trí
Nhiều vị trí
Nhiều vị
trí Một vị trí Một vị trí
Yêu cầu về tính nguyên vẹn của ADN mẫu Trung bình Trung bình Thấp Trung
bình Cao Cao Cao
Trung bình
Trung bình
Yêu cầu về độ tinh sạch của
ADN mẫu Cao Cao Trung bình Cao Cao Cao Cao Cao Cao
Kiến thức cần biết trước về bộ
gen Có Có Có Không Không Không Không Có Có
Hiệu suất Thấp Thấp Cao Thấp Cao Cao Cao Thấp Cao
Kĩ năng yêu cầu Thấp Thấp Trung bình-
thấp Thấp Thấp Thấp Trung bình Trung bình Trung bình Khả năng tự động hóa Có Có Có Khó Có Có Có Có Khó
Độ tin cậy Cao Cao Cao Cao Thấp Trung
bình Cao Cao
Trung bình
Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm riêng nên tùy vào mục đích và điều kiện sẵn có để lựa chọn một phương pháp thích hợp nhất. Từ góc độ mục đích của nghiên cứu, nếu muốn thực hiện nghiên cứu trên số lượng mẫu lớn thì nên sử dụng các phương pháp cho phép nghiên cứu với số lượng mẫu lớn như phương pháp giải trình tự ADN và phương pháp ADN microarray. Phương pháp ADN microarray thích hợp cho nhận diện loài trong hỗn hợp các loài nghi ngờ. Phương pháp giải trình tự ADN thích hợp cho việc xác định các mẫu chưa biết rõ loài. Với số lượng mẫu nhỏ có thể sử dụng các marker thu được dựa vào phản ứng khuếch đại PCR. Với các marker này, căn cứ vào độ tin cậy mong muốn đạt được có thể lựa chọn phương pháp. Kĩ thuật nhận diện chính xác được đề xuất là kĩ thuật SCAR hoặc ARMS. Kĩ thuật có độ lặp lại giữa các lần thí nghiệm thấp, độ tin cậy thấp như kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) chỉ thích hợp trong việc phân nhóm các thảo dược hoặc để phân biệt các mẫu với nhau vì với cùng một mẫu mỗi lần thử nghiệm chạy PCR sẽ có thể cho một mô hình băng ADN khác nhau.