Bên cạnh các mã vạch chuẩn, có nhiều trình tự ADN khác cũng có thể được sử dụng trong nhận diện thảo dược.
Các vùng atpF – atpH và psbK – psbI là hai vùng không mã hóa nằm ở lục lạp, đã được đề xuất là các mã vạch để nhận diện thực vật. Hai marker này không được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu hệ thống và nguồn gốc phát sinh loài nên có rất ít dữ liệu về chúng. Trong nghiên cứu của nhóm CBOL, psbK – psbI cho hiệu quả nhận diện cao nhưng có nhược điểm là không phổ biến và chất lượng trình tự đạt được thấp. Trái lại, vùng atpF – atpH cho hiệu quả nhận diện tương tự nhưng phổ biến hơn và chất lượng trình tự đạt được ở mức trung bình. Một vài nghiên cứu đã được thực hiện với hai vùng này và cho thấy khả năng áp dụng trong nghiên cứu hệ thực vật ở Hàn Quốc [27].
Vùng intron trnL và vùng trnL – trnF đã được sử dụng rất lâu để nghiên cứu nguồn gốc phát sinh loài ở thực vật. Việc giải trình tự cả hai vùng này đều được thực hiện dễ dàng. Một trong các ưu điểm khi sử dụng intron trnL là vùng ở giữa intron có thể được sử dụng làm vị trí gắn mồi và vị trí này tiếp giáp ngay với một vị trí có sự đa dạng cao [27]. Sử dụng intron trong nhận diện 40 mẫu bao gồm tám loài
Lonicera và một thứ (var) cho thấy tỉ lệ nhận diện thành công là 50% [66]. Vùng
trnL – trnF có chiều dài hợp lý, tỉ lệ khuếch đại thành công cao, tuy nhiên sự đa dạng trong trình tự lại kém vùng trnH – psbA tới 3 lần [12]. Trong các nghiên cứu trên cây thuốc, vùng trnL – trnF đã thành công trong nhận diện Cardiocrinum giganteum với loài họ hàng thân thuộc là C. cordatum. Mức độ nhận diện của vùng này chỉ ở mức vừa phải trong một số trường hợp. Trường hợp nhận diện vị thuốc “Cangzu” có nguồn gốc từ Atractylodes chinensis và A. lancea với các loài
Atractylodes là một ví dụ. Nó có thể phân biệt A. chinensis với A. koreana và A. macrocephala nhưng không thể phân biệt A. lanceae từ A. japonica [47].
Ngoài các vùng trên, vùng nối giữa hai gen 5S ở ADN ribosom nhân cũng là một trong những vùng được sử dụng trong nhận diện thảo dược. Đây là một trong những vùng thường xuyên được sử dụng (chiếm 5%) do có sự biến đổi lớn, đồng thời hiệu quả nhận diện cao [47]. Vùng này đã được sử dụng trong nghiên cứu
Swertia mussotii và các loài Swertia giả mạo, cho thấy sự đa dạng giữa các loài thay đổi từ 31% đến 65% [47]. Vùng nối giữa hai gen 5S cũng đã được sử dụng nhận diện loài Epimedium có tác dụng chữa bệnh [47]. Mặc dù có sự đa dạng lớn và hiệu quả nhận diện cao, nhưng sử dụng vùng này trong nhận diện thảo dược sẽ phải đối mặt với một số vấn đề như có quá nhiều bản sao cùng với đó là sự biến đổi nhiều về trình tự giữa các loài và trong một loài sẽ làm cho việc so sánh trở nên khó khăn. Do đó, vùng nối giữa hai gen 5S không được sử dụng như là một mã vạch chuẩn [47].
Tóm lại, bên cạnh các marker thu được bằng khuếch đại PCR, các marker dựa trên phương pháp giải trình tự ADN cũng được sử dụng để nhận diện thảo dược. Đây là một công cụ có độ chính xác cao, tin cậy và hiệu quả. Với một thảo dược, có rất nhiều phương pháp được nghiên cứu với mục đích nhận diện. Ví dụ như loài Ruta graveolens với loài giả mạo là Euphorbia dracunculoides trước đây đã được phân biệt bằng RAPD thì nay cũng có thể phân biệt nhờ so sánh trình tự vùng ITS. Các loài Panax đã được nhận diện bằng marker RAPD, AFLP, SCAR, MARMS… thì nay lại có thể nhận biết nhờ giải trình tự vùng ITS. Các loài
Dendrobium, bên cạnh nhận diện bằng ARMS còn có thể nhận diện nhờ trnH –
psbA… Nhìn chung so với phương pháp marker dựa trên phản ứng khuếch đại PCR, phương pháp dựa vào giải trình tự có ưu điểm hơn là cho phép nghiên cứu trên số lượng lớn các mẫu, đồng thời lượng thông tin thu được cũng nhiều hơn. So với một số phương pháp như RAPD, ISSR hay DALP thì kết quả thu được của phương pháp dựa trên giải trình tự ADN là chính xác hơn. Tuy nhiên, sử dụng các marker dựa
trên giải trình cũng tồn tại nhược điểm là quá trình nghiên cứu khá phức tạp và đòi hỏi những kiến thức trước về trình tự cần nghiên cứu để thiết kế mồi cho trình tự này.
2.3. Phương pháp ADN micrroarray
Microarray là một phương pháp dựa trên sự lai phân tử [2]. Nguyên tắc của lai phân tử là một quá trình trong đó hai sợi ADN ở dạng sợi đơn có trình tự nucleotid bổ sung cho nhau sẽ bắt cặp với nhau tạo thành ADN mạch kép thông qua cầu nối là các liên kết hydro [78]. Trong microarray, các mẫu dò được cố định trên giá thể rắn còn các trình tự mục tiêu được đánh dấu phục vụ cho quá trình lai [2].
Trong phương pháp ADN microarray, hai kĩ thuật thường được sử dụng trong nhận diện thảo dược là kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là các oligonucleotid và kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là gen. Hai kĩ thuật này đều phụ thuộc vào thông tin có sẵn về trình tự của loài nghiên cứu. Các trình tự trong bộ gen của các loài được đem ra so sánh để từ đó xác định các trình tự đặc trưng cho một loài cụ thể. Hàng trăm hoặc hàng nghìn trình tự đặc trưng được gắn lên một microarray duy nhất để nhận diện thảo dược trong một hỗn hợp phức tạp nhiều thành phần [53].
2.3.1. Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là các oligonucleotid
Trong kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò oligonucleotid, các mẫu dò đặc trưng cho loài có chiều dài từ 25 – 60 nucleotid được gắn lên một giá thể rắn. Mẫu dò có thể có nguồn gốc từ vùng mã hóa hoặc vùng không mã hóa. Mỗi microarray được gắn mẫu dò từ hàng trăm loài khác nhau. Các mẫu ADN được chiết tách từ loài mục tiêu, với trình tự tương ứng với mẫu dò được khuếch đại, được đánh dấu huỳnh quang và lai trên array oligonucleotid dưới điều kiện thực hiện chính xác, nghiêm ngặt [53].
Hình 18. Nguyên tắc của kĩ thuật microarray với mẫu dò là oligonucleotid hoặc gen để nhận diện thảo dược [53]
Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là các oligonucleotid đã thành công trong nhận diện tám loài Panax khác nhau dựa vào gen 18S rADN. Quá trình nghiên cứu đã thu được các tín hiệu đặc trưng tại mỗi điểm từ đó giúp xác định được tám loài này. Trong quá trình nghiên cứu có một vài điểm chú ý là quá trình lai được thử nghiệm ở 4 mức nhiệt độ là 55, 60, 65 và 680C với các đoạn ADN đặc trưng của tám loài sâm này. Kết quả cho thấy mức độ nghiêm ngặt càng cao thì phản ứng lai càng đặc hiệu. Nhiệt độ 680C được lựa chọn vì cho phép quan sát mô hình các điểm huỳnh quang đặc trưng cho mỗi loài. Trong kĩ thuật microarray thì việc phải có các mẫu dò chứng âm và chứng dương là cần thiết. Trong nghiên cứu trên, các mẫu dò chứng âm và chứng dương đều được sử dụng nhằm kiểm soát sai
số, đảm bảo độ tin cậy của kết quả. Mẫu dò chứng dương được sử dụng trong nghiên cứu trên là mẫu dò có chiều dài 27 bp bổ sung với vị trí từ 227 – 253 theo đầu từ 5’ – 3’ với trình tự gen 18 rADN, là vùng có sự khác biệt lớn giữa các loài và có sự tương đồng cao ở trong một loài sâm. Các mẫu dò chứng dương được sắp xếp theo sơ đồ nhất định trên mỗi array. Các mẫu dò chứng âm dài 25 bp với trình tự nucleotid được lựa chọn ngẫu nhiên mà đã được xác nhận là không tương đồng với trình tự mục tiêu [83].
Ngoài sử dụng để nhận diện các loài sâm, kĩ thuật này cho thấy hiệu quả trong nhận diện nhiều loài thảo dược có độc tính cao như Aconitum carmichaeli, A. kusnezoffi, Alocasia macrorrhiza, Croton tiglium, Datura inoxia, Datura metel, Datura tatula, Dysosma pleiantha, Dysosma versipellis, Euphorbia kansui, Hyoscyamus niger, Pinellia cordata, Pinellia pedatisecta, Pinellia ternata, Rhododendron molle, Strychnox nux-vomica, Typhonium divaricatum, Typhonium giganteum bằng sử dụng các mẫu dò là các oligonucleotid dựa vào trình tự của gen 5S rADN [11]. Cùng với đó, kĩ thuật này đã được áp dụng để phân biệt loài
Dendrobium officinale với 7 loài Dendrobium khác dựa vào trình tự tại vùng nối giữa hai gen 5S [67].
2.3.2. Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là gen
Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là gen về cơ bản là giống với kĩ thuật microarray oligonucleotid ngoại trừ việc sử dụng các mẫu dò là các trình tự đặc trưng từ các vùng mã hóa. Mẫu dò có kích thước mở rộng toàn bộ gen, nằm trong khoảng 0.5 – 1.5 kb. Các bước chiết tách ADN, quá trình lai và thăm dò tương tự như kĩ thuật trên. Tuy nhiên, so với kĩ thuật microarray, các đoạn gen đặc trưng được sử dụng làm mẫu dò thay vì vài oligonucleotid từ một trình tự gen [53]. Một nghiên cứu sử dụng kĩ thuật này đã được thực hiện với 5 loài Dendrobium là
Dendrobium oficinale, D. loddigesii, D. fimbriatum, D. chrysanthum, D. nobile. Mẫu dò để nhận các loài Dendrobium được xây dựng dựa trên trình tự ITS. Trình tự ITS được gắn lên giá thể, trong đó các trình tự ITS2 được đánh dấu huỳnh quang
cho các tín hiệu đặc trưng của mỗi loài. Từ kết quả thu được cho thấy phương pháp đủ nhạy để thăm dò sự có mặt của Dendrobium nobile trong một hỗn hợp thảo dược chứa chín thành phần khác nhau [79]. So với kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò oligonucleotid, kĩ thuật này đặc hiệu hơn do sử dụng trình tự mẫu dò dài hơn. Tuy nhiên, nhược điểm chung của cả hai phương pháp này là không thích hợp trong nghiên cứu các loài khi chưa có đủ thông tin về bộ gen do những thông tin về bộ gen là cần thiết để thiết kế mẫu dò oligonucleotid hoặc thiết kế mồi.
Như vậy, bên cạnh các phương pháp marker dựa vào PCR và marker dựa vào giải trình tự, các marker thu được dựa vào phương pháp microarray cũng được sử dụng với mục đích nhận diện thảo dược. Phương pháp microarray đem lại một công cụ hiệu quả trong nhận diện thảo dược. Nếu như phương pháp marker dựa vào khuếch đại PCR có nhược điểm là việc thăm dò đa dạng được thực hiện trên gel do đó rất tốn thời gian công sức và làm giới hạn số mẫu được thăm dò thì phương pháp microarray lại tỏ ra có ưu điểm vượt trội vì cho phép một số lượng lớn các mẫu dò ADN lai với các đoạn ADN mục tiêu, do đó chúng rất chính xác và giúp tiết kiệm được công sức. Kĩ thuật microarray cho phép thăm dò nhiều loài khác nhau. Việc thăm dò sự có mặt của một thành phần trong một hỗn hợp các thành phần hay các sản phẩm đã qua chế biến, xử lý bằng nhiệt cũng đã được thực hiện. Tuy nhiên phương pháp này cũng có nhược điểm là cần một số lượng mẫu lớn và quá trình thực hiện tốn thời gian do quá trình lai kéo dài thường đòi hỏi là ủ qua đêm. Trong khi đó, các phương pháp khác lại tỏ ra là tiết kiệm thời gian hơn ví dụ như trong trường hợp nhận diện Panax giseng và Panax quinquefolius là một ví dụ. Phân biệt
Panax ginseng và Panax quinquefolius dựa vào giải trình tự vùng ITS sử dụng phương pháp pyrosequencing cho phép việc nghiên cứu đồng thời các mẫu chỉ trong vòng 15 phút [46]. Một nhược điểm nữa của các phương pháp microarray là nếu điều kiện không được thực hiện nghiêm ngặt thì sự lai chéo giữa các trình tự tương tự nhau sẽ xảy ra dẫn đến những dương tính giả.
Chương 3. Bàn luận
3.1. Đánh giá về các phương pháp nhận diện thảo dược sử dụng công cụ sinh học phân tử học phân tử
Nhận diện thảo dược đóng vai trò rất quan trọng trong việc đảm bảo hiệu quả điều trị, an toàn cho người sử dụng, giảm sự thiếu công bằng trong thương mại và đem lại lòng tin cho người tiêu dùng. Đồng thời, nhận diện chính xác thảo dược cũng góp phần trong việc chuẩn hóa và công nghiệp hóa các thuốc có nguồn gốc thảo dược. Cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học hiện đại, các kĩ thuật sinh học phân tử ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Các kĩ thuật này bước đầu đã được ứng dụng có hiệu quả để nhận diện thảo dược. Sử dụng sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược có thể khắc phục được một số các nhược điểm của các phương pháp nhận diện hiện có như phương pháp nhận diện dựa vào hình thái, phương pháp vi học và phương pháp phân tích thành phần hóa học. Nhận diện thảo dược sử dụng công cụ sinh học phân tử có thể thực hiện với nhiều dạng khác nhau của của thảo dược từ mẫu tươi, mẫu khô đến mẫu đã sơ chế và kết quả không chịu ảnh hưởng bởi giai đoạn phát triển của thực vật, điều kiện môi trường, điều kiện thu hái... Do đó, phương pháp nhận diện dựa trên chỉ thị ADN là một công cụ tiên tiến, hiệu quả cho mục đích nhận diện thảo dược.
Tuy nhiên không có một phương pháp nào là hoàn hảo tuyệt đối. Bên cạnh những ưu điểm vượt trội, việc sử dụng phương pháp nhận diện thảo dược dựa trên ADN cũng phải đối mặt với một số khó khăn, thách thức.
Vấn đề đầu tiên là sự thoái biến của ADN. Ở thảo dược, sự thoái biến của ADN thường xuyên xảy do chúng thường được xử lý bằng nhiệt (phơi hoặc sấy khô), xay, nghiền hoặc được xử lý với nhiều chất hóa học khác nhau [78]. Vấn đề này có thể được giải quyết nhờ việc lựa chọn các kĩ thuật có thể áp dụng các ADN thoái biến. Một số kĩ thuật trong đó sử dụng các gen có nhiều bản sao (như gen ribosom), từ đó, cơ hội để thu được trình tự của toàn bộ gen là cao hơn. Một giải
pháp khác là sử dụng các kĩ thuật trong đó việc khuếch đại được thực hiện tại các vùng ADN có kích thước nhỏ, ví dụ như kĩ thuật nghiên cứu SSR với các trình tự mục tiêu thường có chiều dài khoảng vài chục bp do đó nguy cơ xảy ra đứt gãy ở bên trong đoạn trình tự mục tiêu này sẽ thấp hơn. Sử dụng kĩ thuật lai ADN microarray cũng rất hữu ích trong việc nhận diện các ADN đã bị thoái biến [78]. Ví dụ như kĩ thuật ADN microarray đã được áp dụng với hai loài Panax ginseng và
Panax quinquefolius ở dạng rễ đã chế biến và đã thành công trong việc nhận diện hai loài này [54].
Sự có mặt của các chất ức chế chuỗi phản ứng PCR cũng là một vấn đề cần quan tâm [78]. Thảo dược thường chứa các hợp chất phenolic, các polysaccharid và các sắc tố. Các chất này có thể đóng vai trò là những yếu tố ức chế phản ứng PCR. Lựa chọn một phương pháp chiết tách thích hợp có thể loại trừ được các yếu tố ảnh hưởng đến nói trên. Một giải pháp nữa là pha loãng ADN mẫu và thêm vào đó chất làm tăng cường phản ứng PCR [78]. Ví dụ như trong quá trình nghiên cứu ba loài
Tribulus terrestris, Tribulus lanuginosus và Tribulus subramanyamii, sau khi thử nhiều quy trình hướng dẫn chiết tách ADN khác nhau, phương pháp chiết tách ADN được mô tả bởi Milligan với một số cải tiến đã được lựa chọn. Dung dịch chiết tách được bổ sung LiCl có tách dụng loại bỏ các hợp chất polyphenol và polysaccharid. Hỗn hợp chloroform và isoamyl alcol được sử dụng để loại tạp, chủ yếu là protein do protein biến tính chuyển vào trong pha dầu còn ADN nằm ở pha nước. RNase cũng được sử dụng để loại bỏ ARN lẫn với ADN. Sử dụng phương pháp này thu được ADN có chất lượng tốt, tỉ lệ A260/A280 đạt 1,6 – 1,8 [9].
Vấn đề ngoại nhiễm bởi các ADN không thuộc loài mục tiêu cũng cần được xem xét [78]. Các ADN này có thể bắt nguồn từ nấm, vi khuẩn hoặc các côn trùng