Nghiên cứu khả năng tạo bacteiocin của vi khuẩn lactobacillus acidphilus

Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh tác dụng ức chế vi khuẩn có hại của các bacteriocin sinh ra bởi LAB [20].. Trong y dược, nhiều loài LAB đã được sử dụng làm probiotic để cải thi

PHẠM NGUYÊN PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO

BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới DS Lê Ngọc Khánh, người

đã trực tiếp hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em có thể hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn TS Đàm Thanh Xuân đã đóng góp nhiều ý

kiến quí báu và tận tình giúp đỡ em thực hiện đề tài

Em cũng xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược đối với em trong suốt quá trình nghiên cứu và làm thực nghiệm tại bộ môn

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, thầy cô, bạn bè, những người luôn động viên, giúp đỡ em trong học tập và trong cuộc sống

Em xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 17 tháng 5 năm 2013 Sinh viên

Phạm Nguyên Phương

Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt

1.2.1 Vài nét về vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 6

1.2.4 Sinh tổng hợp, phổ tác dụng và cơ chế tác dụng 9 1.2.5 Đánh giá hoạt tính bacteriocin 11 1.2.6 Chiết xuất và tinh chế 11

khuẩn L acidophilus ATCC 4653

2.2.2 Nghiên cứu một số tính chất của bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn

L acidophilus ATCC 4653

18

2.3.1 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 18

2.3.2 Phương pháp nhân giống L acidophilus 19

2.3.3 Phương pháp xử lí sinh khối L acidophilus 20 2.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính bacteriocin theo cơ chế khuếch

3.1 Sơ bộ xác định bacteriocin trong dịch lên men và sinh khối vi

khuẩn L acidophilus ATCC 4653

23

3.1.1 Xác định bacteriocin trong dịch lên men 23 3.1.2 Xác định bacteriocin trong sinh khối 26

3.2 Nghiên cứu một số tính chất của bacteriocin sinh ra bởi vi

khuẩn L acidophilus ATCC 4653

4653 bằng phương pháp kết tủa (NH4)2SO4

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ATCC (American Type Culture

PMF (Proton Motive Force) Động lực proton

SDS (Sodium Dodecyl sulfate) Natri dodecyl sulfat

STT Tên bảng Trang

1.1 Phân loại bacteriocin của LAB 8 2.1 Các hóa chất sử dụng trong đề tài 16 2.2 Các máy móc sử dụng trong đề tài 17 3.1 Kết quả xác định bacteriocin trong dịch lên men của L

3.3 Hoạt tính bacteriocin của L acidophilus ATCC 4653 ở các

giá trị pH nghiên cứu trên vi khuẩn kiểm định B subtilis

ATCC 6633

30

3.4 Hoạt tính bacteriocin của L acidophilus ATCC 4653 sau

khi được xử lí nhiệt trên vi khuẩn kiểm định B subtilis

ATCC 6633

32

3.5 Hoạt tính bacteriocin của phần tủa và phần dịch thu được

khi bổ sung (NH4)2SO4 vào dịch lên men của L

acidophilus ATCC 4653 với vi khuẩn kiểm định là B

subtilis ATCC 6633

35

STT Tên hình Trang

1.1 Biểu đồ thống kê số lượng các công bố liên quan đến

bacteriocin trên Pubmed trong giai đoạn từ 1950 – 2010

5

3.1 Vòng ức chế tạo bởi dịch lên men của L acidophilus ATCC

4653 trên vi khuẩn kiểm định B subtilis ATCC 6633

26

3.2 Vòng ức chế tạo bởi dịch lên men của L acidophilus ATCC

4653 trên vi khuẩn kiểm định E coli ATCC 25922

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việc phát hiện ra các chất kháng sinh đánh dấu một bước tiến cách mạng của loài người trong cuộc chiến chống lại các bệnh nhiễm khuẩn, công nghệ kháng sinh được đánh giá là một trong những thành tựu khoa học lớn nhất của thế kỉ XX [52] Tuy nhiên, bước vào thế kỉ XXI, con người đang phải đối mặt với kỉ nguyên hậu kháng sinh với sự thiếu hụt các nhóm kháng sinh mới trong khi các chủng vi khuẩn kháng thuốc không ngừng gia tăng [13] Trước tình hình đó, việc nghiên cứu và phát triển những hợp chất mới có tác dụng kháng khuẩn để giảm sự phụ thuộc vào kháng sinh là hết sức cần thiết Bacteriocin chính là một trong số đó [52]

Bacteriocin là những peptid hay protein có tác dụng diệt khuẩn do vi khuẩn sinh ra [34] Chúng đã được phát hiện từ đầu thế kỉ XX nhưng mới được nghiên cứu rộng rãi trong một vài thập niên trở lại đây khi nhu cầu về những hợp chất kháng khuẩn nhằm thay thế kháng sinh và các chất bảo quản hóa học trở nên cấp thiết [26] Với đặc tính an toàn đã được FDA xác nhận, vi khuẩn lactic (LAB) là một nhóm vi khuẩn sinh bacteriocin thu hút sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học [52] Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh tác dụng ức chế vi khuẩn có hại của các bacteriocin sinh ra bởi

LAB [20] Nisin – một bacteriocin của Lactococcus lactis spp đã được sử

dụng rộng rãi trên thế giới như một chất bảo quản nguồn gốc sinh học an toàn

và hiệu quả [23] Thành công của nisin đã bước đầu cho thấy tiềm năng ứng dụng to lớn của bacteriocin từ LAB [22]

Tại Việt Nam, bacteriocin của LAB đã bắt đầu được nghiên cứu trong những năm gần đây, tuy nhiên số lượng nghiên cứu chưa nhiều và tập trung chủ yếu trong nhóm ngành thực phẩm và thú y Với mong muốn góp phần

nhỏ vào nghiên cứu bacteriocin của LAB ở Việt Nam, đề tài “Nghiên cứu

khả năng tạo bacteriocin của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus” được

thực hiện với các mục tiêu cụ thể như sau:

1 Sơ bộ xác định bacteriocin trong dịch lên men và sinh khối vi khuẩn L

acidophilus ATCC 4653

2 Nghiên cứu một số tính chất của bacteriocin sinh ra bởi L acidophilus ATCC 4653

Gratia tìm ra trên một chủng Escherichia coli [74], về sau chất này được biết

đến với tên gọi colicin V [73] và nay là microcin V [28] Năm 1953, thuật ngữ “bacteriocin” lần đầu được đề xuất và định nghĩa bởi Jacob và cộng sự, chủ yếu dựa trên các đặc tính của colicin [34] Năm 1976, Tagg và cộng sự chỉ ra sự khác biệt giữa colicin và các bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn Gram (+) [66], từ đó định nghĩa về bacteriocin được mở rộng và đến ngày nay, các peptid và protein do vi khuẩn sinh ra có tác dụng diệt khuẩn đều được gọi là bacteriocin [34]

1.1.2 Phân bố

Bacteriocin là sản phẩm phổ biến của giới vi khuẩn [34] Chúng đã được tìm thấy ở nhiều nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) và cả trên vi khuẩn cổ (Archaebacteria) [59] Đến nay, có khoảng 200 bacteriocin đã được mô tả [26] Tuy nhiên số lượng bacteriocin trong thực tế được ước tính lớn hơn thế rất nhiều Theo Klaenhammer, 99% các loài vi khuẩn có thể sinh ra ít nhất một bacteriocin [41]

1.1.3 Danh pháp và phân loại

a Danh pháp

Hiện nay chưa có hệ thống danh pháp quốc tế cho bacteriocin Tên của bacteriocin thường xuất phát từ tên chi hay tên loài vi sinh vật đầu tiên được

phát hiện sinh ra bacteriocin đó Ví dụ như colicin từ E coli, pyocin từ

Pseudomonas pyocynea, megacin từ Bacillus megaterium … [25]

b Phân loại

Hệ thống phân loại quốc tế dành cho bacteriocin chưa được chính thức xây dựng và hiện vẫn đang là chủ đề tranh luận trong giới khoa học [26] Riley và Wertz nghiên cứu bacteriocin theo 3 nhóm: bacteriocin của vi khuẩn Gram (-), bacteriocin của vi khuẩn Gram (+) và bacteriocin của vi khuẩn cổ [59] Chi tiết hơn, theo Desriac và cộng sự, bacteriocin được phân loại căn cứ nhiều tiêu chí, trong đó các tiêu chí cơ bản bao gồm: họ vi khuẩn sinh bacteriocin, trọng lượng phân tử, trình tự chuỗi acid amin và cấu trúc của đoạn gen (gene cluster) Các tác giả chia bacteriocin làm 2 nhóm lớn: nhóm thứ nhất là các bacteriocin bản chất protein (protein-bacteriocin), thường được sinh ra bởi vi khuẩn Gram (-), tiêu biểu là các vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriae); nhóm thứ 2 là các bacteriocin bản chất peptid (peptid-bacteriocin), thường được sinh ra bởi vi khuẩn Gram (+), tiêu biểu là các vi khuẩn lactic (LAB) Mỗi nhóm lại được chia thành nhiều lớp và phân lớp [26] (Phụ lục 1)

1.1.4 Tình hình nghiên cứu

a Thế giới

Dù được tìm ra từ khá sớm (1925) nhưng thời gian đầu số lượng các nghiên cứu về bacteriocin không nhiều và hầu hết tập trung vào các bacteriocin của vi khuẩn Gram (-) Cho đến những năm 60 của thế kỉ XX, mới chỉ có 3 chi vi khuẩn Gram (+) được đi sâu nghiên cứu về khả năng sinh

bacteriocin là Bacillus, Listeria và Staphylococcus [26] Tuy nhiên, cũng

trong giai đoạn này, nisin và subtilin – 2 bacteriocin quan trọng từ vi khuẩn Gram (+) đã được phát hiện Roger và cộng sự công bố nghiên cứu đầu tiên

về nisin vào năm 1928 [60], trong khi subtilin được Jansen và Hirschmann

phát hiện vào năm 1944 từ vi khuẩn Bacillus subtilis [37] Đến đầu những

năm 70, trình tự chuỗi acid amin của 2 bacteriocin này mới được xác định rõ [29] [75]

Kể từ những năm 80, số lượng các nghiên cứu về bacteriocin có sự gia tăng đáng kể, bao gồm cả các nghiên cứu trên colicin và trên các bacteriocin khác [26] Tiếp đó, việc nisin được FDA công nhận đạt tiêu chuẩn GRAS vào năm 1988 [58] đã thúc đẩy sự quan tâm của các nhà khoa học đối với các bacteriocin của LAB bởi tiềm năng ứng dụng to lớn trong công nghệ thực phẩm, y tế, thú y Kết quả tất yếu là sự bùng nổ các nghiên cứu về bacteriocin của LAB vào những thập niên cuối thế kỉ XX và đầu thế kỉ XXI [26] (Hình 1.1)

Hình 1.1: Biểu đồ thống kê số lượng các công bố liên quan đến bacteriocin

trên Pubmed trong giai đoạn từ 1950 – 2010 [26]

Trong 20 năm gần đây, trên toàn thế giới có 706 bằng sáng chế liên quan tới bacteriocin của LAB đã được cấp, trong số đó có 421 bằng trong lĩnh vực công nghệ bảo quản thực phẩm và 124 bằng về chất trợ sinh (probiotic) cho động vật [26] Các khả năng ứng dụng khác của bacteriocin như ngăn ngừa

nhiễm trùng khu trú [64], làm chất bảo vệ thực vật [33], làm chất thay thế kháng sinh [38]… cũng đã được đề xuất và nghiên cứu bước đầu

Microcin và bacteriocin từ vi khuẩn biển (marine bacteria) là 2 nhóm bacteriocin mới được đưa ra gần đây [26] Microcin có nguồn gốc từ vi khuẩn đường ruột như colicin [28] nhưng khối lượng phân tử nhỏ hơn và phần lớn được biến đổi sau dịch mã, tương tự nhóm lantibiotic ở vi khuẩn Gram (+) [35] Các bacteriocin từ vi khuẩn biển đến nay vẫn chưa được nghiên cứu nhiều tuy nhiên được dự báo là sẽ phát triển mạnh trong tương lai gần [26]

b Việt Nam

Ở Việt Nam, bacteriocin bắt đầu được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây, đặc biệt là bacteriocin của LAB [8] Bên cạnh các nghiên cứu lí thuyết [1] [2] [8], một số công trình đã bước đầu đưa bacteriocin vào ứng dụng trong thực tiễn Năm 2008, các tác giả Nguyễn Thúy Hương và Trần Thị Tưởng An đã sử dụng màng mỏng BC hấp phụ dịch

bacteriocin của Lactococcus lactis để bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu, giúp

tăng thời gian bảo quản từ 1 lên 3 ngày [3] Việc ứng dụng các kĩ thuật tiên tiến như cố định tế bào [3], tái tổ hợp gen [6] [7] nhằm mục tiêu sản xuất bacteriocin đạt hiệu quả cao cũng đang được nghiên cứu

1.2 Bacteriocin của vi khuẩn lactic

1.2.1 Vài nét về vi khuẩn lactic sinh bacteriocin

Vi khuẩn lactic (LAB) được định nghĩa là một nhóm vi khuẩn Gram (+), gồm các trực khuẩn và cầu khuẩn không sinh bào tử, không ưa khí (non-aerobic) nhưng chịu oxy (aerotolerant), sinh ra acid lactic là sản phẩm chính khi lên men carbohydrat LAB gồm nhiều chi, trong đó tiêu biểu nhất là các

chi Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus [43]

Các LAB đều không di động, catalase âm tính, tỉ lệ GC thấp dưới 50% [61] LAB ưa ấm và chịu nhiệt, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu tùy từng loài, dao

động từ 28 đến 45o

C LAB có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, khi lên men cần các vitamin, acid amin và peptid ngắn Nguồn carbohydrat có thể là glucose, fructose, lactose, maltose, sucrose; một số chủng vi khuẩn có thể sử dụng tinh

bột như Lactobacillus amylophilus và L amylovorus [5]

LAB phân bố rộng rãi trong nhiều hệ sinh thái, thường được tìm thấy trong một số loại thực phẩm (các sản phẩm từ sữa, thịt và rau quả lên men, bột nhào chua…), trên thực vật, trong đường tiêu hóa, hô hấp và sinh dục của người và động vật [61]

LAB có lịch sử ứng dụng lâu đời trong thực phẩm lên men vì các tác động có lợi về mặt dinh dưỡng, cảm quan và tuổi thọ sản phẩm, nhất là với các sản phẩm dễ hỏng như sữa, thịt, cá, một số loại rau quả [43] [69] Trong y dược, nhiều loài LAB đã được sử dụng làm probiotic để cải thiện và nâng cao sức khỏe với nhiều tác dụng trị liệu đáng chú ý như ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, điều trị tiêu chảy, tăng cường đáp ứng miễn dịch, giảm cholesterol máu, giảm nguy cơ mắc ung thư… [61]

Tác dụng kháng khuẩn là một đặc điểm rất đáng chú ý của LAB LAB sinh ra nhiều loại chất có tác dụng kháng khuẩn: acid lactic, acid acetic, ethanol, acid béo, H2O2, diacetyl… và đặc biệt là bacteriocin Mặc dù bacteriocin có thể được tìm thấy ở nhiều loại vi khuẩn khác, bacteriocin sinh

ra bởi LAB vẫn thu hút được sự chú ý đặc biệt của các nhà khoa học bởi tính

an toàn và tác dụng ức chế nhiều vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm như

Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes… [20] Trong số khoảng 200

bacteriocin đã được mô tả cho đến nay, bacteriocin từ LAB chiếm tới 90% [26]

1.2.2 Phân loại

Bacteriocin sinh ra bởi LAB rất đa dạng, trong việc phân loại chúng cũng tồn tại nhiều quan điểm khác nhau Cách phân loại phổ biến nhất do

Klaenhammer và cộng sự đề xuất vào năm 1993 [26], chia bacteriocin của vi khuẩn Gram (+) nói chung, của LAB nói riêng làm 3 lớp [42] Đặc điểm của 3 lớp này được tóm tắt trong bảng 1.1 Một số tác giả đã đề xuất lớp thứ 4 gồm các bacteriocin phức tạp trong cấu trúc có carbohydrat hoặc lipid; tuy nhiên

dữ liệu về các bacteriocin loại này còn rất hạn chế nên cần được nghiên cứu thêm [34]

Bảng 1.1: Phân loại bacteriocin của LAB [26] [34] [71]

I - Còn gọi là các lantibiotic

- Peptid nhỏ (thường < 5 kDa)

- Bền nhiệt

- Biến đổi mạnh sau dịch mã, dẫn tới sự tạo thành

các acid amin hiếm gặp: Lan, MeLan, Dha, Dhb

- Chia làm 2 typ: typ A và typ B

Nisin, lactocin S, epidermin…

II - Peptid nhỏ (thường < 10 kDa)

- Bền nhiệt

- Ít biến đổi sau dịch mã, không chứa Lan

- Chia làm 4 phân lớp: IIa, IIb, IIc, IId

Pediocin PA-1, lactacin F, enterocin AS-48…

III - Protein kích thước lớn (thường > 30 kDa)

- Kém bền nhiệt

Helveticin J, millericin, enterolysin…

1.2.3 Tính chất

Trừ một số ít các bacteriocin thuộc lớp III là các protein, bacteriocin của LAB đa phần là các peptid [26] Chúng thường mang điện (+), có tính sơ nước (hydrophobic) hoặc lưỡng thân (amphiphilic) nhưng đa phần là lưỡng thân, gồm từ 20 đến 60 acid amin [50] [71] Giống như nhiều bacteriocin của

vi khuẩn Gram (+), chúng có thể tồn tại dưới dạng các kết tập có khối lượng lớn (30 – 300 kDa) [54] [66] Dạng kết tập làm giảm hoạt tính của

bacteriocin, đồng thời dễ gây nhầm lẫn trong việc xác định khối lượng phân

tử của bacteriocin tinh khiết Để phá vỡ các kết tập này, có thể sử dụng các tác nhân phân tách như urê, SDS, các biện pháp như siêu lọc, chiết loại lipid bằng dung môi hữu cơ [54]

Độ ổn định là một tiêu chí quan trọng khi nghiên cứu về bacteriocin, nó liên quan tới khả năng sản xuất và đưa bacteriocin vào ứng dụng trong thực

tế 3 yếu tố ảnh hưởng thường được đánh giá là nhiệt độ, pH và enzym [54]; ảnh hưởng của các yếu tố này với mỗi bacteriocin có thể rất khác nhau [66]

Đa số bacteriocin của LAB khá bền nhiệt (trừ lớp III), chịu pH acid tốt hơn

pH kiềm [66], dễ bị bất hoạt bởi các enzym phân giải protein như proteinase

K, pronase, pepsin, trypsin [54]

Ngoài một số nét chung, các bacteriocin của LAB có những đặc điểm riêng rất đa dạng Một số tính chất cơ bản của các bacteriocin tiêu biểu từ LAB được giới thiệu trong Phụ lục 2

1.2.4 Sinh tổng hợp, phổ tác dụng và cơ chế tác dụng

a Sinh tổng hợp

Bacteriocin được tổng hợp tại ribosom dưới dạng tiền chất không hoạt động, chúng chỉ trở nên có hoạt tính sau khi được biến đổi nhờ các phản ứng enzym đặc hiệu [51] Theo Tagg và cộng sự, các bacteriocin của vi khuẩn Gram (+) có thể tồn tại dưới dạng ngoại bào (extracellular form) hoặc gắn với

tế bào (cell-associated form), tỉ lệ mỗi dạng phụ thuộc vào đặc điểm môi trường [66]

Môi trường sống của vi khuẩn còn có ảnh hưởng lớn tới lượng bacteriocin sinh ra, trong đó các yếu tố chủ yếu là thành phần môi trường, nhiệt độ và pH Các yếu tố này có thể ảnh hưởng trực tiếp đến sự sản sinh bacteriocin hoặc gián tiếp thông qua sự sản xuất sinh khối do bacteriocin được coi là sản phẩm trao đổi chất bậc 1 của vi khuẩn [20]

b Phổ tác dụng

Phổ tác dụng của các bacteriocin nhìn chung rất khác nhau (Phụ lục 2) Căn cứ phổ tác dụng, có thể chia bacteriocin của LAB làm 2 nhóm Nhóm thứ nhất là các bacteriocin chỉ có tác dụng trên các loài gần gũi với loài sinh ra

nó, ví dụ như lactobin A sinh ra bởi Lactobacillus amylovorus chỉ ức chế một

số Lactobacillus sp gần gũi Nhóm thứ 2, ít gặp hơn, có phổ tác dụng rộng, ví

dụ như nisin sinh ra bởi một số dòng Lactococcus lactis subsp lactis có khả

năng ức chế nhiều vi khuẩn Gram (+) Nói chung, các bacteriocin của LAB thường ít thể hiện hoạt tính trên vi khuẩn Gram (-) [54]

Bacteriocin có thể có tác dụng diệt khuẩn hoặc kìm khuẩn trên các chủng

vi khuẩn nhạy cảm, mức độ tác dụng khác nhau do ảnh hưởng bởi nhiều yếu

tố như nồng độ, mức độ tinh sạch bacteriocin, các điều kiện thực nghiệm… [17]

c Cơ chế tác dụng

Cơ chế tác dụng của bacteriocin rất đa dạng, một bacteriocin có thể có nhiều hơn một cơ chế tấn công tế bào đích [52] Một số cơ chế đã được đề xuất: thay đổi hoạt tính enzym nội bào, ức chế bào tử nảy mầm, tạo lỗ trên màng tế bào… Nhìn chung, lớp vỏ tế bào được coi là đích tác dụng chính của các bacteriocin từ LAB Bacteriocin phá vỡ tính toàn vẹn của lớp vỏ tế bào vi khuẩn nhạy cảm, gây mất các chất nội bào, tiêu hao PMF, cuối cùng gây chết

tế bào [54]

Cơ chế tác dụng cụ thể của bacteriocin ở từng lớp là khác nhau Các bacteriocin lớp I (lantibiotic) ức chế tổng hợp vách tế bào và / hoặc tạo lỗ trên màng tế bào bằng cách gắn vào lipid II [52] Các bacteriocin lớp II có cấu trúc xoắn ốc và lưỡng thân nên có thể xen vào màng tế bào đích, từ đó tạo lỗ, khử cực và làm chết tế bào [18] Cơ chế tác dụng của các bacteriocin lớp III nói chung chưa rõ [54]; một số tác giả cho rằng đó là các lysin tiêu khuẩn hay tiêu

khuẩn tố (bacteriolysin), tác động trực tiếp lên vách tế bào đích gây phá hủy

tế bào [18]

1.2.5 Đánh giá hoạt tính bacteriocin

Có nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính bacteriocin, về cơ bản chúng đều dựa trên việc đánh giá tác dụng đối kháng của mẫu thử đối với các chủng

vi sinh vật chỉ thị [66] Một số ví dụ: phương pháp “spot-on-lawn”, phương pháp khuếch tán qua giếng thạch [56], phương pháp đo độ đục [40]… (Phụ lục 3) Ảnh hưởng của các tác nhân ức chế khác không phải là bacteriocin như

pH, H2O2… cần được loại trừ bằng phương pháp thích hợp [66]

Gần đây một số phương pháp mới để đánh giá hoạt tính bacteriocin đã được đề xuất Năm 2001, Mugochi và cộng sự đưa ra phương pháp đánh giá hoạt tính bacteriocin bằng cách đo nồng độ ion K+ giải phóng từ vi khuẩn chỉ thị [48] Phương pháp này được cho là có hiệu quả sánh ngang với phương pháp khuếch tán qua giếng thạch [34]

1.2.6 Chiết xuất và tinh chế

Do tính chất của các bacteriocin rất đa dạng nên không có phương pháp hay qui trình chiết tách chung [32] Vấn đề thường gặp trong quá trình chiết xuất và tinh chế bacteriocin là sự hao hụt bacteriocin và sự giảm hoạt tính ức chế vi sinh vật [66] Một qui trình sản xuất bacteriocin chỉ được coi là lí tưởng khi có thể áp dụng với qui mô lớn, cho hiệu suất thu nhận bacteriocin trên 50% và độ tinh sạch khoảng 90% [54]

a Chiết xuất

Bacteriocin có thể được chiết xuất bằng nhiều cách, tiêu biểu trong số đó

là các phương pháp: kết tủa bằng amoni sulfat, hấp phụ - giải hấp phụ và chiết bằng dung môi hữu cơ [56]

- Kết tủa bằng amoni sulfat

Do có bản chất protein, bacteriocin có thể được kết tủa bằng muối do hiện tượng salting out (tính tan của protein giảm mạnh ở nồng độ muối cao) [56] Amoni sulfat thường được sử dụng nhất [56], ngoài ra cũng có tác giả sử dụng diatomite calcium silicate [19] Muối được thêm từ từ vào mẫu (dịch nổi

đã loại sinh khối tế bào) cho đến khi đạt nồng độ mong muốn Nồng độ muối cần thiết để kết tủa các bacteriocin khác nhau có thể khác nhau, cần khảo sát

để tìm ra nồng độ muối thích hợp với từng trường hợp cụ thể Tủa bacteriocin được tách riêng bằng cách li tâm, sau đó hoà trong lượng nhỏ (vừa đủ) đệm phosphat pH 7 (giá trị pH của dung dịch đệm có thể khác nhau giữa các nghiên cứu) hoặc nước cất vô trùng Thường loại muối bằng bằng phương pháp thẩm tích [56]

- Hấp phụ - giải hấp phụ

Phương pháp này được phát triển bởi Yang và cộng sự dựa trên đặc tính của một số bacteriocin: bacteriocin được hấp phụ lên bề mặt tế bào vi khuẩn sinh bacteriocin đó ở pH gần trung tính và được giải phóng trở lại môi trường sau khi xử lí ở pH thấp (pH khoảng 1,5 – 2,0) [70] Ưu điểm của phương pháp này là ít kéo theo các protein tạp so với phương pháp kết tủa bằng amoni sulfat [56]

- Chiết bằng dung môi hữu cơ

Phương pháp này cũng xuất phát từ bản chất protein của bacteriocin: khi thêm dung môi hữu cơ vào mẫu, hằng số điện môi giảm xuống, độ tan của protein giảm và tạo kết tủa [4] Ethanol và aceton là hai dung môi khá thông dụng được sử dụng để chiết bacteriocin Phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ đã được ứng dụng thành công với một số bacteriocin như lactococcin

B, pediocin PA-1, lacticin Q… [56]

b Tinh chế

Bacteriocin sau khi được chiết xuất thường còn lẫn nhiều tạp Để thu được bacteriocin tinh khiết cần trải qua các bước tinh chế [54] Các kĩ thuật tinh chế bacteriocin rất đa dạng (Phụ lục 4), có thể dựa trên kích thước (ví dụ: sắc kí lọc gel, siêu lọc…) hoặc điện tích riêng của bacteriocin (ví dụ: sắc kí trao đổi ion, điện di…) [66] Quá trình tinh chế thường trải qua nhiều bước, kết hợp nhiều kĩ thuật khác nhau [54] Tuy nhiên, một số qui trình đơn giản nhằm tinh chế bacteriocin ở qui mô công nghiệp đã được phát triển thành công Năm 1997, Suárez và cộng sự đã đề xuất qui trình tinh chế nisin A bằng phương pháp sắc kí ái lực miễn dịch nhờ kháng thể đơn dòng kháng nisin A, cho kết quả tốt [63] Năm 2004, Cheigh và cộng sự đã tinh chế được nisin Z

từ môi trường nuôi cấy Lactococcus lactis subsp.lactis A164 bằng phương pháp sắc kí trao đổi ion nền mở rộng, thu được nisin Z có độ tinh khiết gấp 31 lần với hiệu suất 90% [16]

1.2.7 Ứng dụng

Với tác dụng kháng khuẩn, bacteriocin được ứng dụng trong 2 lĩnh vực lớn: công nghệ dược phẩm và công nghệ thực phẩm [59]

a Trong công nghệ dược phẩm

Bacteriocin được nghiên cứu ứng dụng trong công nghệ dược phẩm theo

2 hướng chính: probiotic [27] và chất thay thế kháng sinh [59]

- Probiotic

Probiotic được định nghĩa là các vi sinh vật sống khi được sử dụng với lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe của vật chủ [55] Tác dụng của các chế phẩm probiotic có thể là trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua

sự điều chỉnh khu hệ vi sinh vật đường ruột [9] Bacteriocin được cho là đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các probiotic, là một trong các tiêu chí lựa chọn chủng vi sinh vật làm probiotic [27]

Đã có nhiều giả thiết được đưa ra về cơ chế bacteriocin tham gia vào hoạt động của probiotic Một là, bacteriocin giúp probiotic xâm nhập và chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật đường ruột Hai là, bacteriocin thể hiện tác dụng kháng khuẩn, trực tiếp ức chế các vi khuẩn gây bệnh Ba là, bacteriocin mang tín hiệu kích thích hệ miễn dịch của vật chủ Hiện nay, các nhà khoa học vẫn đang tìm kiếm những bằng chứng để khẳng định chính xác vai trò và

cơ chế tác dụng của bacteriocin trong hoạt động của probiotic, nhất là các

Về mặt lí thuyết, bacteriocin được sinh ra trong tự nhiên rất đa dạng nên khả năng tìm ra những chất có tác dụng kháng lại các vi khuẩn gây bệnh là rất lớn Mặt khác, do bacteriocin thường có tác dụng đặc hiệu trên một số loài vi khuẩn nhất định, chúng có thể được sử dụng như những thuốc thiết kế riêng cho từng tác nhân gây bệnh, nhờ đó giảm tần suất xuất hiện vi khuẩn kháng thuốc [59]

Các nghiên cứu thực nghiệm đã cho những kết quả bước đầu khả quan

Ở đây chỉ nêu ra một vài ví dụ: Nisin, mersacidin, mutacin 1140, lacticin

3147 đã được báo cáo về tác dụng trên các vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc

như MRSA, VRE [52] Nisin F tiêm vào chuột nhiễm Staphylococcus aureus cho thấy có tác dụng kiểm soát sự phát triển của S aureus [14] Lacticin 3147 thể hiện tác dụng ức chế Clostridium difficile trên mô hình ex vivo của ruột

kết [57] Một liều duy nhất mutacin B-Ny266 tiêm màng bụng vào chuột

nhiễm S aureus nhạy cảm với methicillin cho tỉ lệ tử vong là 0%, trong khi tỉ

lệ tử vong ở nhóm chuột đối chứng (không dùng mutacin B-Ny266) là từ 70 đến 100% [47]

Mặc dù vẫn cần thêm nhiều nghiên cứu để có thể đưa bacteriocin vào ứng dụng trên thực tiễn lâm sàng nhưng những kết quả trên đã cho thấy tiềm năng to lớn của bacteriocin trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn [27] Trong tương lai, sử dụng bacteriocin hứa hẹn sẽ là một liệu pháp an toàn và hiệu quả thay thế các kháng sinh truyền thống [59]

b Trong công nghệ thực phẩm

Bacteriocin của LAB được nghiên cứu ứng dụng làm chất bảo quản trong công nghệ thực phẩm bởi có nhiều ưu điểm: ức chế hiệu quả nhiều vi

khuẩn gây hỏng và gây bệnh trong thực phẩm (điển hình là Listeria

monocytogenes) [34], thân thiện với môi trường và sức khỏe con người [54]

Chúng được sử dụng dưới 2 dạng: trực tiếp hoặc gián tiếp [20] Dạng trực tiếp

là các bacteriocin đã được tinh chế, hiện nay mới chỉ có nisin và pediocin

PA-1 được dùng rộng rãi làm chất bảo quản thực phẩm với các tên thương mại như Nisaplin, ALTA 2341… [20] [52] [54] Dạng gián tiếp là các LAB được dùng làm giống khởi động (starter culture) hoặc bổ sung vào các thực phẩm lên men, bacteriocin được chúng sinh ra sẽ phát huy tác dụng kháng khuẩn, giúp tăng tuổi thọ và tính an toàn cho sản phẩm [20] Để tăng hiệu quả kháng khuẩn, bacteriocin có thể được sử dụng kết hợp với các phương pháp khác như tạo môi trường acid, bổ sung NaCl…[34]

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

- Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis ATCC 6633

- Chủng vi khuẩn Escherichia coli ATCC 25922

2.1.2 Hóa chất

Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng trong đề tài

Acid lactic Trung Quốc MgSO4.7H2O Trung Quốc Amoni citrat Trung Quốc MnSO4.H2O Trung Quốc Cao nấm men Đức NaCl Trung Quốc Cao thịt Đức NaOH Trung Quốc Cát thủy tinh Trung Quốc Natri acetat Trung Quốc Chỉ thị màu Trung Quốc (NH4)2SO4 Trung Quốc Glucose Trung Quốc Pepton Ấn Độ

HCl 1N Trung Quốc Thạch Việt Nam

K2HPO4 Trung Quốc Xanh methylen Trung Quốc

KH2PO4 Trung Quốc

2.1.3 Môi trường

a Công thức môi trường MRS lỏng

Pepton : 1,0 g Amoni citrat : 0,2 g

Cao thịt : 1,0 g Natri acetat : 0,5 g

Cao nấm men : 0,5 g MgSO4.7H2O : 0,02 g

Glucose : 2,0 g MnSO4.H2O : 0,004 g

K2HPO4 : 0,2 g Nước máy vừa đủ : 100 ml

b Công thức môi trường thạch thường

Bảng 2.2: Các máy móc sử dụng trong đề tài

Bếp cách thủy Trung Quốc Máy li tâm Đức (Rotofix) Cân kĩ thuật Đức (Sartorius) Máy li tâm cao

tốc

Đức (Universal)

Cân phân tích Đức (Sartorius) Nồi hấp tiệt trùng Nhật (ALP)

Lò vi sóng Hàn Quốc (Daewoo) Tủ ấm Đức (Memmert) Máy đo vòng vô

b Dụng cụ

Bình định mức 50, 100, 1000 ml Ống nghiệm

Bình nón 100, 250, 500, 1000 ml Pipet chia vạch

Chày cối sứ Pipet Pasteur

Cốc có mỏ Pipet tip (Đầu côn)

Đèn cồn Pipetman (Pipet Eppendorf)

Đĩa petri đường kính 9 cm Que cấy đầu tròn

Ống đong Tuýp Eppendorf 1,5 ml

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Sơ bộ xác định bacteriocin trong dịch lên men và sinh khối vi khuẩn

L acidophilus ATCC 4653

- Xác định bacteriocin trong dịch lên men

- Xác định bacteriocin trong sinh khối

2.2.2 Nghiên cứu một số tính chất của bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn L acidophilus ATCC 4653

- Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin

- Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin

- Khả năng chiết bacteriocin bằng phương pháp kết tủa (NH4)2SO4

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật

Các chủng vi khuẩn sử dụng trong đề tài, bao gồm chủng vi khuẩn thử

nghiệm L acidophilus, các chủng vi khuẩn kiểm định B subtilis và E coli

được bảo quản bằng phương pháp cấy truyền định kì lên môi trường mới Các thao tác cấy truyền được thực hiện trong tủ cấy vi sinh Tủ cấy được tiệt trùng trước khi sử dụng bằng cách lau sạch bằng cồn 70o

và bật đèn UV trong 20 phút

a Phương pháp cấy truyền L acidophilus từ môi trường dịch thể

Môi trường MRS lỏng được pha chế theo công thức ở mục 2.1.3 a, phân phối vào các ống nghiệm, mỗi ống 9 ml môi trường, nút kín và tiệt trùng trong nồi hấp ở 115oC trong 20 phút, để nguội Trộn đều ống giống lỏng của

L acidophilus bằng máy lắc Vortex để có hỗn dịch tế bào đồng nhất Dùng

pipet Eppendorf hút 1 ml hỗn dịch tế bào từ ống giống cấy sang ống môi trường mới Nuôi trong tủ ấm CO2 5% ở 37oC trong 24 giờ

Sau thời gian ủ, loại bỏ các ống không đạt yêu cầu nếu có (vi sinh vật không mọc, mọc kém, nghi ngờ bị nhiễm) Các ống giống được gói kĩ, bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 10oC (ngăn mát) Việc cấy truyền được thực hiện 1 – 2 tuần/lần

b Phương pháp cấy truyền B subtilis và E coli từ môi trường thạch

Môi trường thạch thường được pha chế theo công thức ở mục 2.1.3 b, phân phối vào các ống nghiệm, mỗi ống 10 ml môi trường, nút kín và tiệt trùng trong nồi hấp ở 121oC trong 20 phút Sau khi tiệt trùng, đặt các ống môi trường nằm nghiêng khoảng 15 – 20o

trên mặt bàn sạch để thạch đông lại Dùng que cấy vô trùng lấy một vòng vi sinh vật từ ống giống đặc cấy sang

ống môi trường mới, lướt que cấy trên bề mặt thạch theo hình zigzag Cả B

subtilis và E coli đều được nuôi trong tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ

Sau thời gian ủ, loại bỏ các ống không đạt yêu cầu nếu có (vi sinh vật không mọc, mọc kém, nghi ngờ bị nhiễm) Các ống giống được gói kĩ, bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 10oC (ngăn mát) Việc cấy truyền được thực hiện 1 – 2 tháng/lần

2.3.2 Phương pháp nhân giống L acidophilus

Phân phối môi trường MRS lỏng vào các bình nón, mỗi bình 100 ml môi trường, nút kín và tiệt trùng trong nồi hấp ở 115oC trong 20 phút, để nguội

Trong tủ cấy vô trùng, tiến hành cấy 1 ống giống lỏng 10 ml của L

acidophilus vào mỗi bình nón Nuôi trong tủ ấm CO2 5% ở 37oC trong 18 giờ [30]

2.3.3 Phương pháp xử lí sinh khối L acidophilus

Sinh khối L acidophilus được thu nhận từ dịch nuôi cấy vi khuẩn sau 18

giờ bằng cách li tâm (4.000 vòng/phút, 20 phút [10]) Tách riêng phần dịch nổi, thu được sinh khối ở đáy ống li tâm Xử lí sinh khối thu được theo các bước sau:

- Rửa sinh khối bằng nước cất (1 lần)

- Trộn sinh khối ướt với cát thủy tinh đã hấp tiệt trùng theo tỉ lệ 1:1, nghiền hỗn hợp tạo thành bằng chày cối sứ để phá vỡ tế bào vi khuẩn

- Bổ sung NaCl 0,9% vào hỗn hợp thu được theo tỉ lệ 1:1 (1 ml NaCl 0,9% cho 1 g hỗn hợp), khuấy đều để tạo thành hỗn dịch

- Li tâm hỗn dịch thu được bằng máy li tâm cao tốc ở 18.000 vòng/phút trong 20 phút để thu dịch nổi (dịch phá tế bào)

Kiểm tra mức độ phá vỡ tế bào của phương pháp nghiền bằng cách làm tiêu bản sinh khối trước và sau khi xử lí, nhuộm đơn với thuốc nhuộm xanh methylen rồi soi qua kính hiển vi với vật kính dầu (100x)

2.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính bacteriocin theo cơ chế khuếch tán qua giếng thạch

 Nguyên tắc:

Bacteriocin từ mẫu thử trong các giếng khuếch tán vào môi trường thạch cấy vi sinh vật kiểm định và ức chế sự phát triển của các vi sinh vật nhạy cảm tạo ra vòng ức chế [65] Đo đường kính vòng ức chế tạo thành nếu có và đánh giá

 Tiến hành:

- Làm hỗn dịch vi khuẩn kiểm định bằng cách thêm 5 ml nước cất vô trùng vào ống giống đặc của vi khuẩn kiểm định, gõ nhẹ thành ống nghiệm vào lòng bàn tay để vi khuẩn trên thạch phân tán vào nước

- Môi trường thạch thường được pha chế theo công thức ở mục 2.1.3 b, phân phối vào các bình nón, nút kín và tiệt trùng trong nồi hấp ở 121oC trong 20 phút

- Khi môi trường thạch thường còn ấm (khoảng 45 – 50oC), đổ hỗn dịch

vi khuẩn kiểm định vào bình nón đựng môi trường theo tỉ lệ 5 ml hỗn dịch : 100 ml môi trường, lắc tròn nhẹ để vi khuẩn phân tán đều trong môi trường rồi đổ ra các đĩa petri đường kính 9 cm vô trùng (16 ml môi trường/đĩa), để nguội cho thạch đông lại

- Khi thạch đã đông, dùng thanh kim loại vô trùng (đường kính 7,8mm) khoan tạo các giếng trên môi trường thạch trong đĩa petri

- Dùng pipet Eppendorf nhỏ 50 μl mẫu thử vào mỗi giếng thạch

- Các đĩa petri đã nhỏ mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ cho vi khuẩn kiểm định phát triển

- Sau thời gian ủ, đo đường kính vòng ức chế (nếu có) bằng máy đo đường kính vòng vô khuẩn và đánh giá

Một thí nghiệm được tiến hành với 3 đĩa thử song song, đường kính vòng ức chế của mỗi mẫu thử là kết quả trung bình đo được từ 3 đĩa thử Theo Sifour và cộng sự, vùng ức chế nhỏ nhất có ý nghĩa là 1 mm [62] Do đường kính giếng thạch là 7,8mm, đường kính vòng ức chế tối thiểu được xác định là 8,8mm

2.3.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin

Lấy 10 ml dịch bacteriocin cho mỗi mẫu thử, xác định pH bằng chỉ thị màu, từ đó chỉnh pH về các giá trị pH nghiên cứu bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N đã tiệt trùng [44] Để 2 giờ [1] ở nhiệt độ phòng [62] Đánh giá hoạt tính

của dịch bacteriocin đã chỉnh pH theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.4, so

sánh giữa các mẫu và rút ra nhận xét

2.3.6.Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính

bacteriocin

Lấy 10 ml dịch bacteriocin cho mỗi mẫu thử, đun trên bếp cách thủy ở

các giá trị nhiệt độ nghiên cứu trong 30 phút [44] Để nguội ở nhiệt độ phòng

Đánh giá hoạt tính của dịch bacteriocin đã xử lí nhiệt theo phương pháp đã

nêu ở mục 2.3.4, so sánh với mẫu chuẩn đối chiếu là dịch bacteriocin không

xử lí nhiệt và rút ra nhận xét

2.3.7 Phương pháp khảo sát khả năng chiết bacteriocin bằng (NH 4 ) 2 SO 4

 Nguyên tắc:

Bacteriocin có bản chất protein nên tạo kết tủa khi nồng độ (NH4)2SO4

đủ lớn [56] Tách riêng phần tủa bacteriocin và phần dịch, đánh giá hoạt tính

bacteriocin của mỗi phần Bacteriocin kết tủa càng nhiều thì hoạt tính của

phần tủa càng lớn, hoạt tính của phần dịch càng nhỏ

- Li tâm dịch bacteriocin đã hòa tan muối bằng máy li tâm cao tốc ở

10.000 vòng/phút trong 20 phút để phân riêng phần tủa và phần dịch

[56]

- Hòa tan phần tủa trong đệm phosphat pH 7,0 [56] theo tỉ lệ khoảng 1

ml đệm cho phần tủa của 30 ml dịch bacteriocin ban đầu [46]

- Đánh giá hoạt tính bacteriocin của phần tủa và phần dịch theo phương

pháp đã nêu ở mục 2.3.4, so sánh giữa các mẫu và rút ra nhận xét

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Sơ bộ xác định bacteriocin trong dịch lên men và sinh khối vi khuẩn

L acidophilus ATCC 4653

L acidophilus là vi khuẩn Gram (+), do đó về mặt lí thuyết bacteriocin

của nó có thể tồn tại dưới 2 dạng: dạng gắn với tế bào và dạng ngoại bào [66]

Vì vậy, nội dung đầu tiên của đề tài là tiến hành xác định sơ bộ bacteriocin

trong dịch lên men và sinh khối của chủng L acidophilus thử nghiệm

 Mục đích:

- Xác định vị trí tồn tại của bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn L

acidophilus ATCC 4653

- Nhận định sơ bộ về hoạt tính của bacteriocin sinh ra bởi L acidophilus

ATCC 4653 trên các vi khuẩn kiểm định được sử dụng

 Cách tiến hành:

Nuôi cấy L acidophilus ATCC 4653 theo mục 2.3.2 Li tâm dịch nuôi

cấy ở 4.000 vòng/phút trong 20 phút để tách riêng phần dịch nổi (dịch lên men) và sinh khối [10] Xử lí sinh khối thu được theo mục 2.3.3 để thu dịch phá tế bào Tiến hành xác định bacteriocin trong dịch lên men và dịch phá tế bào theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.4; trong đó mẫu trắng đối với dịch lên men là dung dịch acid lactic có pH 4 (tương đương pH dịch lên men), đối với dịch phá tế bào là dung dịch NaCl 0,9% Các vi khuẩn kiểm định được lựa

chọn là B subtilis ATCC 6633, đại diện cho vi khuẩn Gram (+) và E coli

ATCC 25922, đại diện cho vi khuẩn Gram (-) [44] Thí nghiệm được lặp lại 3

lần trên 3 mẻ nuôi cấy độc lập của L acidophilus ATCC 4653

 Kết quả:

3.1.1 Xác định bacteriocin trong dịch lên men

Kết quả xác định bacteriocin trong dịch lên men của L acidophilus

ATCC 4653 được thể hiện trong bảng 3.1

Bảng 3.1: Kết quả xác định bacteriocin trong dịch lên men của L acidophilus

ATCC 4653

Lần thí

nghiệm

Đường kính vòng ức chế (mm)

Trên B subtilis ATCC 6633 Trên E coli ATCC 25922

Dịch lên men Acid lactic

Acid lactic

pH 4

Lần 1 16,0 (-) 18,7 (-) Lần 2 16,2 (-) 19,8 (-) Lần 3 17,7 (-) 22,5 (-)

Ghi chú: (-): không xuất hiện vòng ức chế

 Nhận xét và bàn luận:

Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy: trong cả 3 lần thí nghiệm, dịch lên men của

L acidophilus ATCC 4653 đều tạo được vòng ức chế trên các chủng vi khuẩn

kiểm định B subtilis ATCC 6633 và E coli ATCC 25922 Mẫu trắng là dung

dịch acid lactic có pH 4 (tương đương pH dịch lên men) không tạo vòng ức chế trong tất cả các thí nghiệm tương ứng, điều này cho phép loại trừ tác dụng của acid hữu cơ có trong dịch lên men Từ đó, có thể rút ra 2 kết luận sau:

Một là, bacteriocin có trong dịch lên men của L acidophilus ATCC

4653 Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu đã có về bacteriocin của L

acidophilus [24] [39] [49] [67] [72] Trong các nghiên cứu này, các tác giả

đều sử dụng dịch lên men của vi khuẩn để thu nhận bacteriocin