Nghiên cứu khả năng tạo bacteiocin của vi khuẩn lactobacillus acidphilus

Ket-noi.com chia se BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM NGUYÊN PHƢƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM NGUYÊN PHƢƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: DS Lê Ngọc Khánh Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới DS Lê Ngọc Khánh, người trực tiếp hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn TS Đàm Thanh Xuân đóng góp nhiều ý kiến q báu tận tình giúp đỡ em thực đề tài Em xin cảm ơn quan tâm, giúp đỡ thầy cô giáo, anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược em suốt trình nghiên cứu làm thực nghiệm môn Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, thầy cơ, bạn bè, người động viên, giúp đỡ em học tập sống Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 17 tháng năm 2013 Sinh viên Phạm Nguyên Phương MỤC LỤC Danh mục kí hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Khái quát bacteriocin 1.1.1 Vài nét lịch sử 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Danh pháp phân loại 1.1.4 Tình hình nghiên cứu 1.2 Bacteriocin vi khuẩn lactic 1.2.1 Vài nét vi khuẩn lactic sinh bacteriocin 1.2.2 Phân loại 1.2.3 Tính chất 1.2.4 Sinh tổng hợp, phổ tác dụng chế tác dụng 1.2.5 Đánh giá hoạt tính bacteriocin 11 1.2.6 Chiết xuất tinh chế 11 1.2.7 Ứng dụng 13 Chƣơng NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG 16 PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16 2.1.1 Chủng vi khuẩn 16 2.1.2 Hóa chất 16 2.1.3 Mơi trường 16 2.1.4 Máy móc, dụng cụ 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.2.1 Sơ xác định bacteriocin dịch lên men sinh khối vi 18 khuẩn L acidophilus ATCC 4653 2.2.2 Nghiên cứu số tính chất bacteriocin sinh vi khuẩn 18 L acidophilus ATCC 4653 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 18 2.3.2 Phương pháp nhân giống L acidophilus 19 2.3.3 Phương pháp xử lí sinh khối L acidophilus 20 2.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính bacteriocin theo chế khuếch 20 tán qua giếng thạch 2.3.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính 21 bacteriocin 2.3.6 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính 22 bacteriocin 2.3.7 Phương pháp khảo sát khả chiết bacteriocin 22 (NH4)2SO4 Chƣơng THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Sơ xác định bacteriocin dịch lên men sinh khối vi 23 khuẩn L acidophilus ATCC 4653 3.1.1 Xác định bacteriocin dịch lên men 23 3.1.2 Xác định bacteriocin sinh khối 26 3.2 Nghiên cứu số tính chất bacteriocin sinh vi 28 khuẩn L acidophilus ATCC 4653 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng pH đến hoạt tính bacteriocin L 28 acidophilus ATCC 4653 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin 31 L acidophilus ATCC 4653 3.2.3 Nghiên cứu khả chiết bacteriocin L acidophilus ATCC 34 4653 phương pháp kết tủa (NH4)2SO4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 39 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATCC (American Type Culture Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Hoa Collection) Kì BC (Bacterial Cellulose) Cellulose vi khuẩn Dha Dehydroalanine Dhb Dehydrobutyrine FDA (U.S Food and Drug Cục quản lí Thực phẩm Dược Administration) phẩm Hoa Kì GC Guanine Cytosine GRAS (Generally Recognized As Được công nhận chung an toàn Safe) kDa kiloDalton LAB (Lactic Acid Bacteria) Vi khuẩn lactic Lan Lanthionine MeLan MethylLanthionine MRS de Man, Rogosa, Sharpe MRSA (Methicillin-Resistant Tụ cầu vàng kháng methicillin Staphylococcus aureus) PMF (Proton Motive Force) Động lực proton SDS (Sodium Dodecyl sulfate) Natri dodecyl sulfat sp (species) Loài subsp (subspecies) Phân loài VRE (Vancomycin-Resistant Cầu khuẩn ruột kháng vancomycin Enterococci) UV (Ultraviolet) Tia cực tím DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 Phân loại bacteriocin LAB 2.1 Các hóa chất sử dụng đề tài 16 2.2 Các máy móc sử dụng đề tài 17 3.1 Kết xác định bacteriocin dịch lên men L 24 acidophilus ATCC 4653 3.2 Kết xác định bacteriocin sinh khối L 26 acidophilus ATCC 4653 3.3 Hoạt tính bacteriocin L acidophilus ATCC 4653 30 giá trị pH nghiên cứu vi khuẩn kiểm định B subtilis ATCC 6633 3.4 Hoạt tính bacteriocin L acidophilus ATCC 4653 sau 32 xử lí nhiệt vi khuẩn kiểm định B subtilis ATCC 6633 3.5 Hoạt tính bacteriocin phần tủa phần dịch thu bổ sung (NH4)2SO4 vào dịch lên men L acidophilus ATCC 4653 với vi khuẩn kiểm định B subtilis ATCC 6633 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình Trang 1.1 Biểu đồ thống kê số lượng công bố liên quan đến bacteriocin Pubmed giai đoạn từ 1950 – 2010 3.1 Vòng ức chế tạo dịch lên men L acidophilus ATCC 26 4653 vi khuẩn kiểm định B subtilis ATCC 6633 3.2 Vòng ức chế tạo dịch lên men L acidophilus ATCC 26 4653 vi khuẩn kiểm định E coli ATCC 25922 3.3 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính bacteriocin L 31 acidophilus ATCC 4653 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin L 33 acidophilus ATCC 4653 3.5 Sự thay đổi hoạt tính bacteriocin phần tủa phần dịch theo nồng độ (NH4)2SO4 sử dụng 36 ĐẶT VẤN ĐỀ Việc phát chất kháng sinh đánh dấu bước tiến cách mạng loài người chiến chống lại bệnh nhiễm khuẩn, công nghệ kháng sinh đánh giá thành tựu khoa học lớn kỉ XX [52] Tuy nhiên, bước vào kỉ XXI, người phải đối mặt với kỉ nguyên hậu kháng sinh với thiếu hụt nhóm kháng sinh chủng vi khuẩn kháng thuốc khơng ngừng gia tăng [13] Trước tình hình đó, việc nghiên cứu phát triển hợp chất có tác dụng kháng khuẩn để giảm phụ thuộc vào kháng sinh cần thiết Bacteriocin số [52] Bacteriocin peptid hay protein có tác dụng diệt khuẩn vi khuẩn sinh [34] Chúng phát từ đầu kỉ XX nghiên cứu rộng rãi vài thập niên trở lại nhu cầu hợp chất kháng khuẩn nhằm thay kháng sinh chất bảo quản hóa học trở nên cấp thiết [26] Với đặc tính an tồn FDA xác nhận, vi khuẩn lactic (LAB) nhóm vi khuẩn sinh bacteriocin thu hút quan tâm đặc biệt nhà khoa học [52] Nhiều công trình nghiên cứu chứng minh tác dụng ức chế vi khuẩn có hại bacteriocin sinh LAB [20] Nisin – bacteriocin Lactococcus lactis spp sử dụng rộng rãi giới chất bảo quản nguồn gốc sinh học an toàn hiệu [23] Thành công nisin bước đầu cho thấy tiềm ứng dụng to lớn bacteriocin từ LAB [22] Tại Việt Nam, bacteriocin LAB bắt đầu nghiên cứu năm gần đây, nhiên số lượng nghiên cứu chưa nhiều tập trung chủ yếu nhóm ngành thực phẩm thú y Với mong muốn góp phần nhỏ vào nghiên cứu bacteriocin LAB Việt Nam, đề tài “Nghiên cứu characterization and optimization of production of acidocin B, a novel bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus M46”, Journal of Applied Microbiology, 77(2), 140-148 16 Cheigh, C.I., Kook, M.C., Kim, S.B., Hong, Y.H., and Pyun, Y.R (2004), “Simple one-step purification of nisin Z from unclarified culture broth of Lactococcus lactis subsp lactis A164 using expanded bed ion exchange chromatography”, Biotechnology letters, 26(17), 1341-1345 17 Cintas, L.M., Casaus, M.P., Herranz, C., Nes, I.F., & Hernández, P.E (2001), “Review: bacteriocins of lactic acid bacteria”, Food Science and Technology International, 7(4), 281-305 18 Cotter, P.D., Hill, C., & Ross, R.P (2005), “Bacteriocins: developing innate immunity for food”, Nature Reviews Microbiology, 3(10), 777-788 19 Coventry, M.J., Gordon, J.B., Alexander, M., Hickey, M.W., and Wan, J (1996), “A food-grade process for isolation and partial purification of bacteriocins of lactic acid bacteria that uses diatomite calcium silicate”, Applied and environmental microbiology, 62(5), 1764-1769 20 De Vuyst, L., and Leroy, F (2007) “Bacteriocins from lactic acid bacteria: production, purification, and food applications”, Journal of molecular microbiology and biotechnology, 13(4), 194-199 21 De Vuyst, L., and Vandamme, E.J (1994), “Antimicrobial potential of lactic acid bacteria”, Bacteriocins of lactic acid bacteria, 91-142 22 Deegan, L.H., Cotter, P.D., Hill, C., and Ross, P (2006), “Bacteriocins: biological tools for bio-preservation and shelf-life extension”, International Dairy Journal, 16(9), 1058-1071 23 Delves-Broughton, J., Blackburn, P., Evans, R J., and Hugenholtz, J (1996), “Applications of Leeuwenhoek, 69(2), 193-202 the bacteriocin, nisin”, Antonie van 24 Deraz, S.F., Karlsson, E.N., Hedström, M., Andersson, M.M., and Mattiasson, B (2005), “Purification and characterisation of acidocin D20079, a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus DSM20079”, Journal of biotechnology, 117(4), 343-354 25 Deshmukh, P.V., and Thorat, P.R (2013), “Bacteriocins: a new trend in antimicrobial food packaging”, International Journal of Advanced Research in Engineering and Applied Sciences, 2(1), 1-12 26 Desriac, F., Defer, D., Bourgougnon, N., Brillet, B., Le Chevalier, P., and Fleury, Y (2010), “Bacteriocin as weapons in the marine animal-associated bacteria warfare: inventory and potential applications as an aquaculture probiotic”, Marine drugs, 8(4), 1153-1177 27 Dobson, A., Cotter, P.D., Ross, R.P., and Hill, C (2012), “Bacteriocin production: a probiotic trait?”, Applied and environmental microbiology, 78(1), 1-6 28 Duquesne, S., Destoumieux-Garzón, D., Peduzzi, J., and Rebuffat, S (2007), “Microcins, gene-encoded antibacterial peptides from enterobacteria”, Natural product reports, 24(4), 708-734 29 Gross, E., and Morell, J.L (1970), “Nisin The assignment of sulfide bridges of beta.-methyllanthionine to a novel bicyclic structure of identical ring size”, Journal of the American Chemical Society, 92(9), 2919-2920 30 Han, K.S., Kim, Y., Kim, S.H., and Oh, S (2007), “Characterization and purification of acidocin 1B, a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus GP1B”, Journal of microbiology and biotechnology, 17(5), 774783 31 Hansen, J.N., Chung, Y.J., Liu, W., and Steen, M.J (1991), “Biosynthesis and mechanism of action of nisin and subtilin”, Nisin and Novel Lantibiotics, 287-302 32 Heng, N.C., Wescombe, P.A., Burton, J.P., Jack, R.W., and Tagg, J.R (2007), “The diversity of bacteriocins in Gram-positive bacteria”, Bacteriocins: Ecology and Evolution, 45-92 33 Holtsmark, I., Eijsink, V.G., and Brurberg, M.B (2008), “Bacteriocins from plant pathogenic bacteria”, FEMS microbiology letters, 280(1), 1-7 34 Hoover, D.G., and Chen, H (2005), “Bacteriocins with potential for use in foods”, Antimicrobials in food, Third Edition, 389-428 35 Jack, R.W., and Jung, G (2000), “Lantibiotics and microcins: polypeptides with unusual chemical diversity”, Current opinion in chemical biology, 4(3), 310-317 36 Jack, R.W., Tagg, J.R., and Ray, B (1995), “Bacteriocins of grampositive bacteria”, Microbiological reviews, 59(2), 171-200 37 Jansen, E.F., and Hirschmann, D.J (1944), “Subtilin, an antibacterial product of Bacillus subtilis: culturing conditions and properties”, Archives of Biochemistry, 4, 297-304 38 Joerger, R.D (2003), “Alternatives to antibiotics: bacteriocins, antimicrobial peptides and bacteriophages”, Poultry science, 82(4), 640-647 39 Kanatani, K., Oshimura, M., and Sano, K (1995), “Isolation and characterization of acidocin A and cloning of the bacteriocin gene from Lactobacillus acidophilus”, Applied and environmental microbiology, 61(3), 1061-1067 40 Kimura, H., Nagano, R., Matsusaki, H., Sonomoto, K., and Ishizaki, A (1997), “A bacteriocin of strain Pediococcus sp ISK-1 isolated from Nukadoko, bed of fermented rice bran”, Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 61(6), 1049-1051 41 Klaenhammer, T.R (1988), bacteria”, Biochimie, 70(3), 337-349 “Bacteriocins of lactic acid 42 Klaenhammer, T.R (1993), “Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria”, FEMS microbiology reviews, 12(1), 39-85 43 Lasztity, R (2009), Food Quality and Standards Volume 3, EOLSS Publishers Co Ltd, Oxford, UK 44 Mahrous, H., Mohamed, A., El-Mongy, M.A., El-Batal, A.I., and Hamza, H.A (2013), “Study bacteriocin production and optimization using new isolates of Lactobacillus spp isolated from some dairy products under different culture conditions”, Food and Nutrition Sciences, 4, 342-356 45 Mehta, A.M., Patel, K.A., and Dave, P.J (1983), “Purification and properties of the inhibitory protein isolated from Lactobacillus acidophilus AC1”, Microbios, 38(152), 73-81 46 Mørtvedt, C.I., Nissen-Meyer, J., Sletten, K., and Nes, I.F (1991), “Purification and amino acid sequence of lactocin S, a bacteriocin produced by Lactobacillus sake L45”, Applied and environmental microbiology, 57(6), 1829-1834 47 Mota-Meira, M., Morency, H., and Lavoie, M.C (2005), “In vivo activity of mutacin B-Ny266”, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 56(5), 869871 48 Mugochi, T., Nandakumar, M.P., Zvauya, R., and Mattiasson, B (2001), “Bioassay for the rapid detection of bacteriocins in fermentation broth”, Biotechnology letters, 23(15), 1243-1247 49 Muriana, P.M., and Klaenhammer, T.R (1991), “Purification and partial characterization of lactacin F, a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus 11088”, Applied and environmental microbiology, 57(1), 114121 50 Nes, I.F., and Holo, H (2000), “Class II antimicrobial peptides from lactic acid bacteria”, Peptide Science, 55(1), 50-61 51 Nes, I.F., Diep, D.B., Håvarstein, L.S., Brurberg, M.B., Eijsink, V., and Holo, H (1996), “Biosynthesis of bacteriocins in lactic acid bacteria”, Antonie van Leeuwenhoek, 70(2-4), 113-128 52 Nishie, M., Nagao, J.I., and Sonomoto, K (2012), “Antibacterial peptides “bacteriocins”: an overview of their diverse characteristics and applications”, Biocontrol science, 17(1), 1-16 53 Oscáriz, J C., and Pisabarro, A.G (2001), “Classification and mode of action of membrane-active bacteriocins produced by gram-positive bacteria”, International Microbiology, 4(1), 13-19 54 Parada, J.L., Caron, C.R., Medeiros, A.B.P., and Soccol, C.R (2007), “Bacteriocins from lactic acid bacteria: purification, properties and use as biopreservatives”, Brazilian Archives of Biology and Technology, 50(3), 521542 55 Pineiro, M., and Stanton, C (2007), “Probiotic bacteria: legislative framework - requirements to evidence basis”, The Journal of nutrition, 137(3), 850S-853S 56 Pingitore, E.V., Salvucci, E., Sesma, F., and Nader-Macias, M.E (2007), “Different strategies for purification of antimicrobial peptides from Lactic Acid Bacteria (LAB)”, Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology, 1, 557-568 57 Rea, M C., Dobson, A., O'Sullivan, O., Crispie, F., Fouhy, F., Cotter, P D., Shanahan, F., Kiely, B., Hill, C., Ross, R.P (2011), “Effect of broad-and narrow-spectrum antimicrobials on Clostridium difficile and microbial diversity in a model of the distal colon”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 108(Supplement 1), 4639-4644 58 Register, F (1988), “Nisin preparation: affirmation of GRAS status as a direct human food ingredient”, Federal Register, 53, 11247-11251 59 Riley, M.A., and Wertz, J.E (2002), “Bacteriocins: evolution, ecology, and application”, Annual Reviews in Microbiology, 56(1), 117-137 60 Rogers, L.A (1928), “The inhibitory effect of Streptococcus lactis on Lactobacillus bulgaricus”, J Bacteriol, 16, 321–325 61 Savadogo, A., Ouattara, A.C., Bassole, H.I., and Traore, S.A (2006), “Bacteriocins and lactic acid bacteria-a minireview”, African Journal of Biotechnology, 5(9), 678-683 62 Sifour, M., Tayeb, I., Haddar, H.O., Namous, H., and Aissaoui, S (2012), “Production and characterization of bacteriocin of Lactobacillus plantarum F12 with inhibitory activity against Listeria monocytogenes”, The Online Journal of Science and Technology, 2(1), 55-61 63 Suárez, A.M., Azcona, J.I., Rodríguez, J.M., Sanz, B., and Hernandez, P.E (1997), “One-step purification of nisin A by immunoaffinity chromatography”, Applied and environmental microbiology, 63(12), 49904992 64 Tagg, J.R., and Dierksen, K.P (2003), “Bacterial replacement therapy: adapting „germ warfare‟ to infection prevention”, Trends in biotechnology, 21(5), 217-223 65 Tagg, J.R., and McGiven, A.R (1971), “Assay system for bacteriocins”, Applied microbiology, 21(5), 943 66 Tagg, J.R., Dajani, A.S., and Wannamaker, L.W (1976), “Bacteriocins of gram-positive bacteria”, Bacteriological reviews, 40(3), 722-756 67 Tahara, T., Oshimura, M., Umezawa, C., and Kanatani, K (1996), “Isolation, partial characterization, and mode of action of Acidocin J1132, a two-component bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus JCM 1132”, Applied and environmental microbiology, 62(3), 892-897 68 Toba, T., Yoshioka, E., and Itoh, T (1991), “Acidophilucin A, a new heat‐labile bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus LAPT 1060”, Letters in applied microbiology, 12(4), 106-108 69 Wood, B.J., and Holzapfel, W.H.N (1995), The Genera of Lactic Acid Bacteria, Blackie Academic & Professional, London, UK 70 Yang, R., Johnson, M.C., and Ray, B (1992), “Novel method to extract large amounts of bacteriocins from lactic acid bacteria”, Applied and Environmental Microbiology, 58(10), 3355-3359 71 Zacharof, M.P., and Lovitt, R.W (2012), “Bacteriocins Produced by Lactic Acid Bacteria a Review Article”, APCBEE Procedia, 2, 50-56 72 Zamfir, M., Callewaert, R., Cornea, P.C., Savu, L., Vatafu, I., and De Vuyst, L (1999), “Purification and characterization of a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus IBB 801”, Journal of applied microbiology, 87(6), 923-931 Tiếng Pháp 73 Fredericq, P., Joiris, E., Betz-Barreau, M., and Gratia, A (1949), “Recherche des germes producteurs de colicines dans les selles de malades atteints de fièvre paratyphoïde B”, CR Soc Biol, 143, 556-559 74 Gratia, A (1925), “Sur un remarquable exemple d'antagonisme entre deux souches de colibacille”, CR Soc Biol, 93, 1040-1041 Tiếng Đức 75 Gross, E., Kiltz H.H., Nebelin, E (1973), “Subtilin, VI Die Struktur des Subtilins”, Hoppe Seylers Z Physiol Chem, 354(7), 810–812 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phân loại sơ bacteriocin đặc điểm số bacteriocin tiêu biểu cho nhóm [26] (A) Proteinbacteriocin Vi khuẩn Gram (-) Escherichia coli Lớp Phân lớp Tên Khối lƣợng phân tử (kDa) Cơ chế tác dụng Colicin A A, E1 – E9, K, L, N, S4, U, Y B, D, H, Ia, Ib, M, 5, 10 Pyocin R2 Pyocin S1, S2, AP41 Pyocin F Alveicin A, B 40 đến 80 Nuclease / Tạo lỗ 40 đến 80 Nuclease / Tạo lỗ Tạo lỗ Giống phage 408/358 aa Giống phage Tạo lỗ Klebicin C, D 96 Nuclease Serracin Serracin P 66 Giống phage Glynericin Glynericin A 50 Giống phage 669 Giống phage 68/76 Giống phage B Pseudomonas aeruginosa Pyocin Hafnia alvei Alveicin Klebsiella pneumonia Serratia plymithicum Xanthomonas campestris Yersinia enterocolitica Erwinia carotovora Vi khuẩn Gram (+) Lactobacillus helveticus Streptococcus milleri Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus Klebicin Typ R Typ S Typ F Giống colicin Giống colicin Enterocoliticin Carotovoricin Carotovoricin Er 270 aa 75/84/ 94 Helveticin J III 37,5 Chưa rõ Millericin III 30 Enterolysin III 34,5 Lysostaphin III 25 Thủy phân peptidoglycan Thủy phân peptidoglycan Thủy phân peptidoglycan (B) Lớp Phân lớp Tên Khối lƣợng phân tử (kDa) Cơ chế tác dụng Microcin I Microcin B17 Microcin V Microcin E492 3,1 Enzym nội bào Tạo lỗ Tạo lỗ Nisin Lacticin 481 Mersacidin Pediocin Plantaricin E/F Carnocyclin A Lactococcin A 3,5 4,6 3,5/3,7 Tạo lỗ Tạo lỗ 5,8 Tạo lỗ 5,8 Tạo lỗ Patellamides 0,7 Peptidbacteriocin Vi khuẩn Gram (-) Escherichia coli II IIa IIb Typ A A1 A2 8,8 7,9 Vi khuẩn Gram (+) I (Hay lantibiotic) II Typ B IIa IIb IIc IId Cyanobacteria Prochloron didemni Giống microcin Ghi chú: aa: acid amin Tạo lỗ Tạo lỗ Phụ lục 2: Một số bacteriocin LAB tính chất [55] Lồi sản xuất Lactococcus lactis subsp lactis Lactococcus lactis subsp cremoris Lactobacillus acidophilus Bacteriocin Phổ tác dụng Đặc điểm Nisin Vi khuẩn Gram (+) Lacticin 3147 Lactococcin B Clostridium sp Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Streptococcus dysgalactiae Enterococcus faecalis Propionibacterium acne Streptococcus mutans Lactobacillus Lantibiotic, 3,5 kDa, 34 acid amin, có sản phẩm thương mại Lantibiotic, 4,2 kDa, bền nhiệt, thể hoạt tính pH acid sinh lí Acidocin CH5 Vi khuẩn Gram (+) Lactacin F Lactacin B Lactobacillus amylovorus Lactobin A Lactobacillus casei Lactocin 705 Leuconostoc gelidum Leucocin A Leuconostoc mesenteroides Mesentericin Y105 Pediococcus acidilactici Pediocin F Bacteriocin lớp II, xấp xỉ kDa, phổ tác dụng hẹp Bacteriocin lớp II, tạo kết tập khối lượng lớn Lactobacillus fermentum Bacteriocin lớp II, 6,3 Enterococcus faecalis kDa, 57 acid amin, bền Lactobacillus delbrueckii nhiệt Lactobacillus helveticus Lactobacillus delbrueckii Bacteriocin lớp II, 6,3 Lactabacillus helveticus kDa, bền nhiệt, Lactobacillus bulgaricus phát pH môi Lactococcus lactis trường nuôi cấy giữ ổn định từ 5,0 – 6,0 Lactobacillus acidophilus Bacteriocin lớp II, 4,8 Lactobacillus delbrueckii kDa, 50 acid amin, phổ tác dụng hẹp Listeria monocytogenes Bacteriocin lớp II, gồm Lactobacillus plantarum peptid; peptid gồm 33 acid amin, khối lượng phân tử 3,4 kDa Lactobacillus Bacteriocin lớp II, 3,9 Enterococcus faecalis kDa, 37 acid amin, bền Listeria monocytogenes pH acid, bền nhiệt Enterococcus faecalis Bacteriocin lớp II, 3,8 Listeria monocytogenes kDa, 37 acid amin, bền nhiệt Vi khuẩn Gram (+) Bacteriocin lớp II, 4,5 kDa, bền với nhiệt Pediocin PA-1 Listeria monocytogenes Pediocin AcH Vi khuẩn Gram (+) Vi khuẩn Gram (-) bổ sung stress Lactobacillus Lactococcus Leuconostoc Pediococcus Staphylococcus Enterococcus Listeria Clostridium Listeria monocytogenes Pediococcus Pediococcus pentosaceous Pediocin A Enterococcus faecium Enterocin A Lactobacillus sake Lactocin S Sakacin P Lactobacillus curvatus Lactobacillus helveticus Curvacin A Helveticin J Lactobacillus Leuconostoc Pediococcus Listeria monocytogenes Listeria monocytogenes Enterococcus faecalis Lactobacillus bulgaricus Lactococcus lactis dung môi hữu cơ, hoạt động khoảng pH rộng Bacteriocin lớp II, 4,6 kDa, 44 acid amin Bacteriocin lớp II, 4,6 kDa, 44 acid amin, phổ tác dụng rộng Bacteriocin lớp II, 2,7 kDa, bền nhiệt Bacteriocin lớp II, 4,8 kDa, 47 acid amin, bền nhiệt Lantibiotic, 3,7 kDa, thể hoạt tính khoảng pH 4.5 – 7.5 Bacteriocin lớp II, 4,4 kDa, bền nhiệt Bacteriocin lớp II, 4,3 kDa Bacteriocin lớp III, 37 kDa, phổ tác dụng hẹp, bền nhiệt Phụ lục 3: Một số phương pháp đánh giá hoạt tính bacteriocin Phƣơng pháp Nguyên tắc Cách tiến hành Phương pháp Bacteriocin có khả khuếch Mẫu thử nhỏ giọt lên môi “spot-on-lawn” tán môi trường đặc trường đặc (~2% thạch) Đổ hỗn (Spot-on-lawn bán đặc, mẫu thử chứa hợp vi sinh vật thị trộn assay) [57] bacteriocin ức chế phát môi trường thạch mềm (~0.7% triển vi sinh vật thị, tạo thạch) lên Ủ qua đêm, đánh thành vòng ức chế xung quanh giá vòng ức chế tạo thành mẫu thử Nhỏ mẫu thử lên khoanh giấy Phương pháp khuếch tán qua lọc vô trùng, để khô đặt lên bề khoanh giấy lọc mặt môi trường đặc cấy vi sinh (Disc diffusion vật thị Ủ qua đêm, đánh giá assay) [57] vòng ức chế tạo thành Phương pháp Trên mơi trường đặc cấy vi khuếch tán qua sinh vật thị, khoan tạo giếng thạch giếng Nhỏ mẫu thử vào (Well diffusion giếng Ủ qua đêm, đánh giá vòng assay) [57] ức chế tạo thành Phương pháp đo Trong môi trường lỏng, mẫu Cho mẫu thử vào ống môi trường độ đục thử chứa bacteriocin ức chế lỏng cấy vi sinh vật thị Ủ (Turbidometric phát triển vi sinh vật qua đêm, đo mật độ quang (OD – assay) [41] thị, làm cho số lượng tế bào vi optical density) bước sóng thích sinh vật thị giảm xuống so hợp, so với ống đối chứng (khơng với khơng có mặt mẫu thử cho mẫu thử) Đánh giá tác dụng Số lượng tế bào đánh giá ức chế mẫu thử vi sinh thông qua độ đục môi vật thị trường Phụ lục 4: Một số qui trình tinh chế bacteriocin LAB [57] Bacteriocin Tinh chế Plantaricin ST31 Kết tủa amoni sulfat – Chiết pha rắn (Cột Sep-pak C18) – RP HPLC Sắc kí trao đổi cation Sắc kí trao đổi ion mở rộng Trao đổi cation – Sắc kí phân bố pha đảo Hấp phụ / tách – RP HPLC Hấp phụ - Giải hấp phụ – RP HPLC Kết tủa amoni sulfat – Sắc kí phân bố (Cột C18) Kết tủa ethanol – Điện di tập trung đẳng điện – Siêu lọc Sắc kí trao đổi cation – Sắc kí phân bố (Cột C18) – HPLC Nisin Z Enterocin AS48 Plantaricin C19 Pediocin ACM Salivaricin Pediocin PA-1 Lactococcin Mesentericin Y105 Sakacin A Sakacin P Enterocin A Pediocin A-1 Divercin V41 Acidocin D20079 Kết tủa amoni sulfat – Sắc kí trao đổi cation – Sắc kí tương tác kị nước (Cột Octyl Sepharose) Lacticin Q Kết tủa aceton – Sắc kí trao đổi cation – RP HPLC Lactobin A Kết tủa amoni sulfat – Chiết hệ dung môi chloroform : methanol – RP HPLC Divergicin M35 Sắc kí trao đổi cation – Chiết pha rắn (Cột Seppak C18) – RP HPLC Enterocin CRL35 Kết tủa amoni sulfat – Lọc phân tử (Cột Biogel P-6) – Sắc kí trao đổi cation – HPLC Bozacin 14 Kết tủa amoni sulfat - Chiết pha rắn (Cột Sep-pak C18) – RP HPLC Mutacin B-Ny266 Sắc kí phân bố (Cột C18) – HPLC (x3) Abp118 Kết tủa amoni sulfat – Sắc kí tương tác kị nước – Sắc kí trao đổi cation – RP HPLC (Cột C8 C18) Macedocin Kết tủa amoni sulfat – Sắc kí trao đổi anion – Sắc kí trao đổi cation – Sắc kí phân bố pha đảo – Lọc gel Piscicocin CS526 Kết tủa amoni sulfat – Lọc gel – Sắc kí Số Hiệu bƣớc suất (%) 0,8 1 2 2 5,9 90,0 24,3 15,0 40,4 7,3 3 29,0 41,0 60,0 3 3 3 10,0 10,0 66,0 25,0 10,0 16,0 64,0 0,07 10,0 2,0 4,4 4 1,0 6,4 1,6 7,0 Propionicin F Pediocin PD-1 trao đổi cation – Sắc kí phân bố (Cột C18) – RP HPLC Kết tủa amoni sulfat – Sắc kí trao đổi anion – Sắc kí phân bố pha đảo (x3) Kết tủa amoni sulfat – Thẩm tích – Đơng khơ – Chiết methanol – Chiết chloroform – Trao đổi cation 0,5 34,0 Phụ lục 5: Các bacteriocin tìm thấy Lactobacillus acidophilus [11] Bacteriocin Lactacin B Lactacin F Chủng vi khuẩn L acidophilus N L acidophilus 11088 Acidophilucin L acidophilus A LAPT 1060 Acidocin L acidophilus 8912 TK8912 Acidocin B L acidophilus M46 Acidocin A L acidophilus TK9201 Acidocin L acidophilus CH5 CH5 Acidocin L acidophilus JCM J1229 1229 Acidocin L acidophilus JCM J1132 1132 Acidophilicin L acidophilus LA-1 LA-1 Acidocin L acidophilus LF221A LF221 Acidocin LF221B Acidophilin L acidophilus IBB 801 801 Acidocin L acidophilus D20079 DSM20079 Acidocin L acidophilus AA11 AA11 Acidocin 1B L acidophilus GP1B Phổ tác dụng Các vi khuẩn thuộc họ Lactobacillaceae Các lactobacilli, Enterococcus faecalis L delbrueckii, L helveticus Lactobacillus Lactococcus sp L fermentum, Clostridium sporogenes Một số LAB gần gũi Listeria monocytogenes Các chi Lactobacillus, Bacillus, Micrococcus Corynebacterium Lactobacillus Lactococcus sp Lactobacillus sp L delbrucki, L casei, L jugurti Một số LAB, B cereus, Clostridium sp., L innocua, S aureus Một số lactobacilli gần gũi, E coli S panama Lactobacillus spp Salmonella, Shigella, E coli, S aureus, B cereus, B subtilis Shigella, E coli, P aeruginosa, L monocytogenes, Yersinia enterocolitica ... PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 2.1.1 Chủng vi khuẩn a Vi khuẩn thử nghiệm Chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ATCC 4653 b Vi khuẩn kiểm định (chỉ thị) - Chủng vi khuẩn Bacillus... bacteriocin LAB Vi t Nam, đề tài Nghiên cứu khả tạo bacteriocin vi khuẩn Lactobacillus acidophilus” thực với mục tiêu cụ thể sau: Sơ xác định bacteriocin dịch lên men sinh khối vi khuẩn L acidophilus...BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM NGUYÊN PHƢƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO BACTERIOCIN CỦA VI KHUẨN LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: