Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định của loài tục đoạn (dipsacus japonicus miq) trong nuôi cấy in vitro

LỜI CẢM ƠN Sau thời gian học tập Viện Công sinh học Lâm Nghiệp, rèn luyện thầy cô bạn bổ sung vốn kiến thức sống chuyên ngành vô quý giá Nhắm nâng cao trình độ, kỹ làm việc hồn thành chương trình đại học, thơng qua đồng ý Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp Việt Nam, tiến hành thực đề tài tốt nghiệp: “Nghiên cứu khả tạo rễ bất định loài Tục đoạn (Dipsacus japonicus Miq.) ni cấy in vitro” Trong suốt q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, nhận quan tâm giúp đỡ tận tình nhiều mặt Trường đại học Lâm nghiệp, đặc biệt Viện Công nghệ sinh học , thầy cô giáo trực tiếp giảng dạy Cho phép bày tỏ long biết ơn chân thành đến thầy cô, đặc biệt Ths Nguyễn Thị Thơ tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Tơi xin cảm ơn anh chị kỹ thuật viên giúp tơi sửa chữa lỗi sai, thiếu sót q trình thí nghiệm Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè tạo điều kiện vật chất lẫn tinh thần cho tơi hồn thành tốt luận văn tốt nghiệp Vì kiến thức thân cịn hạn chế, q tình thực hiện, hồn thành chun đề tơi khơng tránh khỏi sai sót, kính mong nhận ý kiến đóng góp từ thầy cơ, bạn bè để tơi có thêm kinh nghiệm cho nghề nghiệp sau Hà Nội, ngày 14/05/2018 Nhâm Sỹ Bắc CÁC CHỮ VIẾT TẮT KÝ HIỆU GIẢI THÍCH Cs Cộng CTTN Cơng thức thí nghiệm ĐC Đối chứng ĐHST Điều hòa sinh trưởng IBA Indole butyric acid MS Murashige Skoog (1962) NAA 𝛼-naphthalen acetic acid TB Trung bình DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG, BIỂU, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ Hình STT ảnh, bảng biểu Bảng 2.1 Bảng 2.2 Bảng 2.3 Nội dung hình ảnh, bảng biểu Cách bố trí thí nghiệm thu thập số liệu ảnh hưởng IBA NAA đến khả cảm ứng rễ bất định Tục đoạn từ Cách bố trí thí nghiệm thu thập số liệu ảnh hưởng IBA NAA đến khả cảm ứng rễ bất định Tục đoạn từ rễ Cách bố trí thí nghiệm thu thập số liệu ảnh hưởng hàm lượng đường sucrose đến khả nhân nhanh rễ Tục đoạn từ rễ Cách bố trí thí nghiệm thu thập số liệu ảnh hưởng hàm lượng agar đến khả nhân nhanh rễ Tục đoạn từ rễ Bảng 2.4 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Kết ảnh hưởng hàm lượng đường sucrose đến khả nhân nhanh rễ Tục đoạn từ rễ Bảng 3.4 Kết ảnh hưởng hàm lượng agar đến khả nhân nhanh rễ Tục đoạn từ rễ Hình Cây Tục đoạn Dipsacus japonicus Miq 10 Hình 3.1 Rễ bất định hình thành từ Tục đoạn in vitro sau tuần tuổi 11 Hình 3.2 Rễ bất định hình thành từ rễ Tục đoạn in vitro sau tuần tuổi 12 Hình 3.3 Ảnh hưởng hàm lượng sucrose đến hình thành rễ bất định từ rễ Tục đoạn in vitro sau tuần tuổi 13 Hình 3.4 Ảnh hưởng hàm lượng agar đến hình thành rễ bất định từ rễ Tục đoạn in vitro sau tuần tuổi Kết ảnh hưởng IBA NAA đến khả cảm ứng rễ bất định Tục đoạn từ Kết ảnh hưởng IBA NAA đến khả cảm ứng rễ bất định Tục đoạn từ rễ ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, song song với phát triển đất nước vấn đề đáng lo ngại tình trạng sức khỏe người bị đe dọa cách nghiêm trọng vấn nạn ô nhiễm môi trường hay nóng lên tồn cầu Trước mối nguy hại này, bệnh tật người ngày gia tăng, số ca bệnh liên quan đến nhóm bệnh truyền nhiễm (như nhiễm trùng đường hô hấp, cúm, viêm phổi …) tăng lên cách rõ rệt Nhằm đảm bảo sức khỏe điều trị nhu cầu sử dụng thuốc ngày gia tăng Tuy nhiên, loại thuốc sử dụng có nguồn gốc tổng hợp phương pháp hóa học nên nhiều mang lại tác dụng phụ không mong muốn cho người sử dụng Đặc biệt, việc tổng hợp hóa học phải tốn nhiều thời gian, trải qua nhiều công đoạn nhiều phản ứng tổng hợp để có hợp chất có tính dược lý trị bệnh Do đó, phương pháp tách chiết dược liệu có nguồn gốc tự nhiên nghiên cứu để khắc phục nhược điểm Thực vật nguồn dược liệu quý có sẵn tự nhiên, cung cấp hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học ứng dụng việc sản xuất dược phẩm Những hợp chất coi chất trao đổi thứ cấp diện với hàm lượng nhỏ Trong tự nhiên, hợp chất có vai trị việc chống lại tác nhân ngoại xâm vi sinh vật động vật (Nguyễn Hoàng Lộc, 2011) Trong năm gần đây, việc khai thác nguồn dược liệu tự nhiên từ thực vật trở thành vấn đề quan trọng mang tính tồn cầu Vấn đề đặt nơi sống tự nhiên lồi thuốc bị biến nhanh chóng biến động điều kiện môi trường, địa lý khai thác bừa bãi người Kết dẫn đến cạn kiệt nguồn dược liệu thiên nhiên (Nguyễn Hoàng Lộc, 2011) Một giải pháp cho việc khắc phục vấn đề ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật, coi thay trì nguồn nguyên liệu cung cấp cho việc thu nhận hợp chất thứ cấp cho việc sản xuất sinh dược phẩm Việc lựa chọn phương pháp ni cấy tế bào thực vật có nhiều ưu điểm (1) Cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu cho việc tách chiết hoạt chất theo quy mô công nghiệp mà không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên; (2) Các nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật cho thấy hàm lượng hoạt chất sinh học tích lũy tế bào thường cao nhiều lần so với quan tích lũy chúng tự nhiên Tục đoạn (Dipsacus japonicus Miq.) thuốc quý, phân bố nhiều Việt Nam Trung Quốc, rễ chúng thường dùng làm thuốc chữa bệnh thấp khớp, nhức xương, di tinh, bạch đới, động thai đau bụng, gan thận yếu, chấn thương,… (Đỗ Tất Lợi, 2004) Ngoài ra, nhiều tác dụng dược lý khác Tục đoạn phát chống viêm, thuốc bổ, làm dịu đau, cầm máu, lợi sữa Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu khả tạo rễ bất định Tục đoạn in vitro Vì vậy, tơi thực đề tài: “Nghiên cứu khả tạo rễ bất định loài Tục đoạn (Dipsacus japonicus Miq.) nuôi cấy in vitro” nhằm tìm mơi trường thích hợp để tạo nhiều rễ Từ tạo nguồn nguyên liệu thu nhận hợp chất thứ cấp để sản xuất dược phẩm CHƯƠNG TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Tục đoạn Cây Tục đoạn thuộc họ Tục đoạn (Dipsacacea) loại ưa sáng, thường mọc lẫn trảng cỏ, Tục đoạn thấy mọc tự nhiên vùng núi cao 1.1.1 Sơ lược họ Dipsacaceae Họ Tục đoạn (danh pháp khoa học: Dipsacaceae thuộc Tục đoạn (Dipsacales) chứa khoảng 290 - 350 loài thân thảo bụi sống lâu năm hay hai năm 11 - 14 chi Có nguồn gốc chủ yếu vùng ơn đới, chúng tìm thấy châu Âu, châu Á châu Phi, đặc biệt khu vực ven Địa Trung Hải Một vài loài họ hợp thủy thổ khu vực khác Có 14 chi: Bassecoia, Cephalaria, Dipsacus, KnautiaLomelosia, Pseudoscabiosa, Pterocephalidium, Pterocephalodes, Pterocephalus, Scabiosa, Sixalix, SuccisaSuccisella, Triplostegia 1.1.2 Vị trí phân loại Tục đoạn Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Dipsacales Họ: Dipsacaceae Chi: Dipsacus Lồi: Dipsacus japonicus Miq Hình 1: Cây Tục đoạn Dipsacus japonicus Miq (Nguồn:http://vienduoclieu.org.vn/Dipsacus_japonicus_1654) Tên thông thường: Đầu vù (H’mông), Sâm nam, Oa thái, Sơn cân thái, jaou pa en (Mèo Xiêng Khoảng), Rễ kế (Miền nam) 1.1.3 Đặc điểm sinh học Tục đoạn 1.1.3.1 Đặc điểm hình thái Cây thảo, cao 1,5 - m, có rễ mập, phân nhánh thân có cạnh gai thưa Lá mọc đối, khơng cuống, có bẹ, hình mác, dài - 10 cm, rộng - cm, mép khía răng, phần gốc thân chia thùy khơng đều, to dần phía ngọn, thùy tận to hình trứng, phía ngun có hình mác hẹp, gân rõ mặt dưới, hai mặt gần màu Cụm hoa hình đầu, mọc cán dài phủ đầy lơng Lá bắc có lơng mi mép phía Hoa màu trắng, đài nhỏ gần nhau, hàn liền phía gần giữa, cánh hoa thành hình phễu, nhị, nhị hình chỉ, thị khỏi tràng hoa, nhẵn, bao dài mm Quả bế, dài - mm, rộng 0,5 - mm, hình cạnh, nhẵn 1.1.3.2 Sinh thái, sinh trưởng, phát triển phân bố Tục đoạn ưa sáng, thường mọc lẫn trảng cỏ đồi bụi, chân núi đá vôi, độ cao 1.300 - 1.600 m Vốn có nguồn gốc phía Bắc, thích nghi với điều kiện khí hậu ẩm mát quanh năm, Việt Nam, Tục đoạn thấy mọc tự nhiên vùng núi cao, sát biên giới phía Bắc Nhiệt độ trung bình năm từ 13,8 đến 15,3oC, mùa đơng lạnh kéo dài, có lúc xuống 0oC Cây mọc từ hạt quan sát vào tháng - 5, sinh trưởng nhanh mùa hè thu Mùa hoa tháng - 11 Toàn phần mặt đất tàn lụi vào mùa đông, phần gốc củ mặt đất mọc lại vào mùa xuân năm sau Tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt (Võ Văn Chi, 1997) Phân bố: Việt Nam: Tục đoạn phân bố tỉnh Hà Giang (huyện Quản Bạ, Yên Minh, Đồng Văn, Mèo Vạc); Lai Châu (Phong thổ, Sìn Hồ); Điện Biên (Tủa Chùa); Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát); Yên Bái (Mù Cang Chải) Năm 1978, Viện Dược liệu đưa giống từ Sa Pa trồng Trại dược liệu Trà My (Quảng Nam), có quần thể nhỏ trở nên hoang dại hóa Trên giới: Phân bố chủ yếu Trung Quốc, Nhật Bản Ấn Độ 1.1.3.3 Bộ phận dùng Bộ phận thường sử dụng làm thuốc rễ Rễ Tục đoạn đào vào khoảng từ tháng đến tháng 8, rửa sạch, thái nhỏ, phơi khơ 1.1.3.4 Thành phần hóa học Bao gồm: tinh dầu, tannin, saponin, alkaloids Rễ củ Tục đoạn có chứa số chất sucrose, b-sitosterol, akebia saponin D Rễ củ chứa triterpen glycosid, iridoid glycosid (swerosid, loganin, cantleyosid) Ngồi ra, cịn chứa saponin japondipsaponin E1 E2 (Võ Văn Chi, 1997) 1.1.3.5 Tác dụng dược lý Tục đoạn có vị đắng, cay, tính ơn quy vào kinh can, thận; có tác dụng bổ gan thận, tục cân cốt (nối gân xương), hành huyết, huyết, an thai Thuốc có tác dụng làm mủ (bài nùng) ung nhọt, cầm máu, giảm đau, có tác dụng tăng sữa làm tăng nhanh tổ chức tái sinh Theo Đỗ Tất Lợi, 2006: loài Dipsacus pilosus (cùng chi khác lồi với Tục đoạn), có nhận xét với liều 0,2 - 0,3g cao thể trọng chó mèo thấy huyết áp cao lên, nhịp tim nhanh lên, đồng thời biên độ mạch tăng, thở mau sâu Thử tủy sống ếch thấy cao Dipsacus pilosus có tác dụng gây mê mạnh (Đỗ Tất Lợi, 2006) Trong Y học cổ truyền, Tục đoạn dùng làm thuốc bổ, chữa đau lưng mỏi gối, té ngã sưng tấy, gãy xương, động thai, doạ sẩy thai, sữa sau đẻ, nam giới di tinh Được dùng dạng thuốc sắc hay chế viên hoàn để uống, ngày 12 g Một số thuốc có Tục đoạnvà cách sử dụng [1]: Thuốc bổ gan thận, chữa đau lưng mỏi gối: Tục đoạn, Ngưu tất, Đỗ trọng, Tang kí sinh, Câu kỉ tử, Đương quy, Hà thủ ô sắc ngâm rượu uống Chữa động thai, doạ sẩy thai: Tục đoạn (tẩm rượu), Đỗ trọng (trích gừng), Táo nhục; chế viên, uống Chữa vết thương sưng tấy, gãy xương: Tục đoạn, Cốt toái bổ, Ngưu tất, Nhũ hương, Một dược, Tam thất, Đỗ trọng, Đương quy, Xuyên khung; sắc uống Chữa kinh nguyệt nhiều, kinh nhạt màu: Tục đoạn, Thục địa, Đương quy, Ngải diệp, Xuyên khung; sắc uống Phòng ngừa sẩy thai trường hợp hay đẻ non: Tục đoạn 8g; đảng sâm, hoàng cầm, xuyên khung, hoàng kỳ, đương quy vị 4g; thục địa, bạch thược vị 3g; cam thảo (chích), bạch truật, sa nhân vị 2g; gạo nếp nắm Tất thái nhỏ, nấu với nhiều lần nước để lấy nước thuốc đặc Sau đó, cho gạo nếp vo vào nấu thành cháo, ăn ngày Dùng liên tục - ngày liệu trình Chữa động thai, dọa sẩy thai thai - tháng: Tục đoạn (tẩm rượu) 60g, đỗ trọng (tẩm nước gừng, cho đứt tơ) 60g Đem hai vị thuốc tán nhỏ, trộn với táo nhục (thịt táo), làm thành viên to hạt ngô Ngày uống 30 viên với nước cháo Với phụ nữ bị động thai, thai lậu (dọa sẩy), băng lậu, khí hư, bạch đới dùng thử Tục đoạn, đương quy, long cốt, xích thạch chỉ, hồng kỳ, địa du thứ 12g, thục địa 16g, ngãi diệp, xuyên khung thứ 6g Đem tất tán bột làm hoàn, lần uống 8g, ngày lần An thai: Tục đoạn 20g, đỗ trọng 12g, trứng gà Cho tất vào nồi nấu với nước, trứng chín bóc vỏ, lại bỏ vào nấu tiếp lúc bắc ăn trứng, uống nước canh Cách ngày dùng lần, dùng khoảng - lần để cảm nhận hiệu Chữa sữa khơng thơng, sữa sau sinh: Lấy Tục đoạn 15g, ma hoàng, xuyên sơn giáp (rang cháy) vị 6g; xuyên khung, đương quy vị 5g; thiên hoa phấn, thông thảo vị 9g Cho tất vào nồi sắc lấy nước thuốc uống Chữa kinh nguyệt nhiều, kinh màu nhạt: Chuẩn bị Tục đoạn 10g, đương quy 10g, thục địa 12g, ngải diệp 3g, xuyên khung 3g Sắc lấy nước uống ngày thang Cải thiện chứng lãnh cảm phụ nữ: Lấy Tục đoạn 20g, đỗ trọng 20g, ba kích 20g, nhục thung dung 20g, đậu đen 30g, đuôi lợn 50g Tất rửa sạch, cho vào nồi hầm nhừ ăn ngày lần Ăn liền tuần Chữa tê thấp, đau mỏi gân xương: Tục đoạn, ngưu tất, tang ký sinh, đỗ trọng vị 10g; câu kỷ, hà thủ ô đỏ, đương quy vị 5g, tất thái nhỏ, phơi khơ, sắc với 400ml nước cịn 100ml, uống làm lần ngày Có thể ngâm rượu uống Nếu bị đau lưng chân (thuộc thể hư hàn thấp), gân cốt co cứng, chân gối mỏi lấy Tục đoạn, đỗ trọng, mộc qua, tỳ giải, ngưu tất thứ 80g Nghiền tất thành bột mịn luyện mật làm hoàn, viên hoàn nặng 10g Người bệnh lần uống viên, ngày uống - lần, uống với nước nóng rượu nóng Trị can thận suy nhược, chân tay đau buốt: Nếu can thận suy nhược, sống lưng thắt lưng đau buốt dùng hồn Tục đoạn gồm: Tục đoạn 12g, phòng phong 12g, ngưu tất 12g, ngũ gia bì 12g, tỳ giải 12g, ý dĩ nhân 12g, thục địa 20g, bạch truật 12g, khương hoạt 8g Đem tất vị nghiền thành bột mịn, làm viên hoàn Ngày uống - lần, lần 12g, uống với nước muối loãng rượu ấm 10.Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Văn Kết (2011) “Nghiên cứu khả tạo rễ bất định sâm Ngọc Linh ni cấy in vitro”, Tạp chí khoa học DHQGHN, Khoa học tự nhiên công nghệ, 27, tr 30-36 11.Hà Thị Loan, Dương Hoa X , Nguyễn Quốc Bình, Nguyễn Hồng Qn, Vũ Thị Đào, Nathalie Pawlicki-Jullian, Eric Gontier (2014) “Nghiên cứu tạo rễ tóc sâm Ngọc Linh Panax vietnamensis phương pháp chuyển gen ROL nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes”, Tạp chí sinh học, 36(1se): 293300 12.Nguyễn Hồng Lộc, (2011), “Nghiên cứu khả tích lũy số hoạt chất sinh học có giá trị từ nuôi cấy tế bào thực vật”, Bản tin khoa học công nghệ tỉnh Thừa Thiên Huế, trang 9-12 13.Phạm Văn Lộc cộng (2014), “ Nghiên cứu tạo rễ bất định đinh lăng (Polyscias fruticosa L Harms) phương pháp nuôi cấy in vitro” 14.Đỗ Tất Lợi (2006) Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học 15.Nguyễn Đức Lượng, (2011), Công nghệ tế bào, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh 16.Trương Quỳnh Như, Võ Thanh Phúc, Lê Thị Thủy Tiên (2015), “Khảo sát ảnh hưởng auxin lên hình thành tăng sinh rễ bất định dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don)”, Tạp chí phát triển KHvàCN, 18(5), tr 75 – 86 17.Nguyễn Thị Quỳnh, Hoàng Ngọc Nhung, Nguyễn Lê Anh Thư (2013) “Nghiên cứu hình thành tăng trưởng rễ bất định từ nuôi cấy in vitro Đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba Kitagawa)”, Tạp chí sinh học, tr35(3se):165-173 18.Bùi Đình Thạch (2016) Nghiên cứu tạo rễ tơ Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.) khảo sát khả tạo plumbagin nuôi cấy in vitro, Luận án tiến sĩ Viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 19.Nguyễn Trung Thành, Paek Kee (2008), “Nhân nhanh rễ bất định Nhân sâm Panax ginseng C.A Meyer ảnh hưởng số nhân tố lý hóa lên tăng trưởng sinh khối sản phẩm trao đổi chất ginsenosides”, Tạp chí khoa học DHQGHN, Khoa học tự nhiên công nghệ 24, tr 318-323 20.Ninh Thị Thảo , Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Thuỳ Linh, Nguyễn Tuấn Minh, Nguyễn Quỳnh Chi, Trần Thị Anh Đào (2016), “Nghiên cứu cảm ứng nuôi cấy rễ bất định ba kích (Morinda officinalis How)”, Tạp chí KH Nơng nghiệp Việt Nam 2016, tập 14, số 6: 921-930 21.Ninh Thị Thảo, Lê Tiến Vinh, Lã Hoàng Anh, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Thị Phương Thảo (2015) Nghiên cứu cảm ứng nuôi cấy rễ tơ Đan sâm (Salvia miltiorrhiza bunge) Tạp chí Khoa học Phát triển, Vol.13, No 2: 251-258 22.Mai Trần Ngọc Tiếng cs, (1980), Kích Thích Tố Giâm Cành, Phần II: Cơ chế tạo rễ bất định, Thông báo khoa học số 4, Đại học Tổng hợp TP Hồ Chí Minh, Trang 93-98 23.Nguyễn Văn Uyển, (1993), Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống trồng, NXB Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh 2.Tài liệu tiếng anh 24.Demet A., Daradogan T (2010), “The effect of carbon sources on in vitro microtuberization of potato (Solanum tuberosum L.)”, Turkish Journal of Field Crops, 15(1), pp 7-11 25.Abdullahil, B (2010), Growth, secondary metabolite production and antioxidant enzyme response of Morinda citrifolia adventitious root as affected by auxin and cytokinin, Plant Biotechnology Reports, 4(2): 109-116 26.Gao X.F., Xu Z.H., Liu J.J., Ma L.P., Yin L.P., Jia W (2006), “Adventitious root induction and in vitro culture of Panax notoginseng”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi., 31(18), pp 1485-8 27.Son S.H., Choi S.M., Hyung S.J., Yun S.R., Choi M.S., Shin E.M., Hong Y.P (1999) “Induction and culture of mountain ginseng adventitious roots and AFLP analysis for indentifying mountain ginseng”, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 4(2), pp 119-123 28.Verstraeten I., Beeckman T., Geelen D (2013), Adventitious root induction in Arabidopsis thaliana as a model for in vitro root organogenesis, Methods in Molecular Biology, 959: 159-175 29.Escalona M., Lorenzo J.C., Gonzales B.L., Daquinta M., Borroto C.G , Gozales J.I., Desjardine Y (1999), “Pineapple (Ananas comosus L Merr.) micropropagation in temporary immersion system”, Plant Cell Rep, 18, pp 743 – 748 30.Amoo, S O., Aremu, A O., Staden, J (2013), Shoot proliferation and rooting treatments influence secondary metabolite production and antioxidant activity in tissue culture-derived Aloe arborescens grown ex vitro Plant Growth Regulators, 70: 115-122 31.Reis, R., Borges, A., Chierrito, T., de Souto, E., de Souza, L., Iacomini, M., de Oliveira, A., Goncalves, R (2011), Establishment of adventitious root culture of Stevia rebaudiana Bertoni in a roller bottle system Plant Cell Tissue Organ Culture, 106: 329-335 32.Kim, J S., Hahn, E J., Yeung, E C., Paek, K Y (2003), Lateral root development and saponin accumulation as affected by IBA or NAA in adventitious root cultures of Panax ginseng C A Meyer In vitroCellular and Developmental Biology - Plant, 39(2): 245-249 33.Lee Y., Lee D.E., Lee H.S., Kim S.K, Lee W.S., Kim S.H., M.W (2011), “Influence of auxins, cytokinins, and nitrogen on production of rutin from callus and adventitious roots of the white mulberry tree (Morusalba L.)”, Plant cell, Tissue and Organ Culture(PCTOC), 105(1), pp 9-19 PHỤ BIỂU PHỤ BIỂU 01: MÔI TRƯỜNG MS (MURASHIGE SKOOG, 1996) Các thành phần môi trường Hàm lượng (mg/l) KNO3 1900 NH4NO3 1650 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 CaCl2 332 H3BO3 6,2 MnSO4.H2O 22,3 ZnSO4 8,6 Na2MoO4 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2 0,025 FeSO4.7H2O 27,8 Na2EDTA 37,3 Glycin Myo - Inositol 100 Thiamine HCl 0,1 Axit nicotinic 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 PHỤ BIỂU 02: ẢNH HƯỞNG CỦA IBA VÀ NAA ĐẾN KHẢ NĂNG CẢM ỨNG RỄ BẤT ĐỊNH TỤC ĐOẠN TỪ LÁ Descriptives N DC B1 Mean 12.1267 Std Std 95% Confidence Minim Maxi Deviation Error Interval for Mean um mum 10.21 13.69 1.76670 Lower Upper Bound Bound 1.02001 7.7379 16.5154 247.4767 91.65211 52.91537 19.8002 475.1531 171.43 349.24 B2 267.2233 10.47437 6.04738 241.2036 293.2431 257.08 278.00 B3 307.9533 46.47187 26.83054 192.5108 423.3959 268.57 359.21 B4 380.4500 25.09023 14.48585 318.1224 442.7776 354.58 404.68 B5 209.9433 10.85730 6.26846 182.9723 236.9144 201.07 222.05 B6 160.8567 31.70875 18.30705 82.0878 239.6256 127.22 190.20 B7 204.3000 45.95297 26.53096 90.1465 318.4535 169.62 256.42 B8 161.3733 16.67290 9.62610 119.9556 202.7911 146.18 179.21 105.65550 20.33341 175.0600 258.6518 KLRT Total 27 216.8559 10.21 404.68 DC 1.2067 15822 09135 8136 1.5997 1.07 1.38 B1 15.8300 4.58287 2.64592 4.4455 27.2145 11.10 20.25 B2 20.8033 8.18696 4.72674 4658 41.1409 14.67 30.10 B3 24.6133 4.65813 2.68937 13.0419 36.1848 21.20 29.92 B4 35.3667 7.52930 4.34705 16.6628 54.0705 27.39 42.35 B5 14.0400 2.90985 1.68000 6.8115 21.2685 11.40 17.16 B6 10.7467 1.53050 88364 6.9447 14.5486 9.33 12.37 B7 18.1167 4.82173 2.78382 6.1388 30.0945 13.08 22.69 B8 11.2333 2.44837 1.41357 5.1512 17.3154 9.28 13.98 27 16.8841 10.07933 1.93977 12.8968 20.8713 1.07 42.35 KLRK Total Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic df1 df2 Sig KLRT 4.129 18 006 KLRK 2.398 18 059 ANOVA Sum of Squares Between Groups KLRT Within Groups Total Between Groups KLRK Within Groups Total df Mean Square 260610.012 32576.252 29630.167 18 1646.120 290240.179 26 2228.421 278.553 412.991 18 22.944 2641.413 26 F Sig 19.790 000 12.141 000 PHỤ BIỂU 03: ẢNH HƯỞNG CỦA IBA VÀ NAA ĐẾN KHẢ NĂNG CẢM ỨNG RỄ BẤT ĐỊNH TỤC ĐOẠN TỪ RỄ Descriptives N Mean Std Std 95% Confidence Interval Minimu Maximu Deviation Error for Mean m m Lower Bound Upper Bound DC 1598 532.5591 3.70209 09262 532.3774 BR1 12235 4081.6485 113.70583 1.02795 BR2 12703 4306.6666 533.14726 BR3 14195 4733.8962 KL BR4 15778 RT BR5 532.7407 527.89 536.95 4079.6336 4083.6635 3942.46 4220.57 4.73031 4297.3945 4315.9388 3490.89 4816.61 100.15305 84060 4732.2485 4735.5439 4643.37 4870.83 5259.5109 29.35929 23373 5259.0528 5259.9691 5219.91 5290.44 10152 3408.4938 294.92588 2.92710 3402.7561 3414.2315 3140.86 3788.40 BR6 13492 4506.2403 200.58910 1.72693 4502.8553 4509.6253 4244.47 4736.84 BR7 12069 4024.0239 65.50134 59623 4022.8551 4025.1926 3934.66 4092.27 BR8 10518 3507.7411 79.82145 77832 3506.2154 3509.2667 3422.45 3612.83 Total 102740 4249.0087 775.73000 2.42014 4244.2652 4253.7521 527.89 5290.44 DC 1598 25.3006 85122 02130 25.2588 25.3424 24.21 26.29 BR1 12235 191.4185 6.04476 05465 191.3113 191.5256 185.06 199.67 BR2 12703 196.8026 12.85862 11409 196.5790 197.0262 185.73 217.22 BR3 14195 253.2300 12.16007 10206 253.0299 253.4300 236.24 264.61 KL BR4 15778 419.9783 33.55701 26715 419.4547 420.5020 372.77 445.42 RK BR5 10152 154.1303 7.80697 07748 153.9784 154.2822 145.08 163.65 BR6 13492 179.6642 9.63667 08296 179.5016 179.8268 168.88 191.89 BR7 12069 167.8723 27.64685 25166 167.3790 168.3656 132.07 199.73 BR8 10518 210.9803 7.72203 07530 210.8327 211.1279 202.70 221.38 Total 102740 227.1505 91.09630 28420 226.5934 227.7075 24.21 445.42 Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic df1 df2 Sig KLRT 16974.648 102731 000 KLRK 18758.898 102731 000 ANOVA Sum of Squares Between Groups KLRT Within Groups Total Between Groups KLRK Within Groups Total df Mean Square 56354708315.041 7044338539.380 5469285928.869 102731 53238.905 61823994243.910 102739 818448283.497 102306035.437 34136083.660 102731 332.286 852584367.157 102739 F Sig 132315.617 000 307885.387 000 PHỤ BIỂU 04: ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG SUCROSE ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH RỄ TỤC ĐOẠN TỪ RỄ Descriptives N Mean Std Std 95% Confidence Deviation Error Interval for Mean 1.91526 04794 Lower Upper Bound Bound 532.0062 532.1943 Minimu Maximu m 529.74 m DC 1596 532.1002 B9 7758 2607.6554 235.00595 2.66805 2602.4253 2612.8855 2297.11 2875.13 KLRT B10 16796 5607.2426 221.76272 1.71115 5603.8886 5610.5966 5378.04 5898.58 B11 11081 3714.8924 281.91287 2.67809 3709.6429 3720.1420 3377.37 4058.18 Total 37231 4201.3794 1458.07414 7.55657 4186.5683 4216.1904 529.74 5898.58 DC 1596 24.2926 1.44053 03606 24.2219 24.3633 23.01 26.31 B9 7758 292.9407 25.13843 28540 292.3812 293.5001 263.17 322.93 KLRK B10 16796 422.1898 86.04735 66395 420.8884 423.4912 355.12 539.07 B11 11081 277.6541 51.72276 49135 276.6910 278.6172 215.92 340.74 Total 37231 335.1796 114.82183 59507 334.0133 336.3460 23.01 539.07 Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic df1 df2 Sig KLRT 2616.569 37227 000 KLRK 17797.853 37227 000 534.43 ANOVA Sum of Squares Between Groups KLRT Mean Square 77016305273.395 2134957443.092 37227 79151262716.487 37230 Between Groups 331949972.757 110649990.919 Within Groups 158898639.030 37227 4268.371 Total 490848611.787 37230 Within Groups Total KLRK df F Sig 25672101757.798 447641.397 000 57349.704 25923.238 000 PHỤ BIỂU 05: ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯỢNG AGAR ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN NHANH RỄ TỤC ĐOẠN TỪ RỄ Descriptives N B12 KL RT KL RK 2491 Mean Std Std Deviation Error 70389 95% Confidence Interval Minimu for Mean m Maximu m Lower Upper Bound Bound 830.4891 833.2496 804.03 879.38 831.8694 35.13311 B13 10146 3390.9043 170.09997 1.68871 3387.5941 3394.2145 3138.19 3525.86 B14 15778 5268.0721 211.68742 1.68527 5264.7688 5271.3754 4964.76 5467.87 B15 6983 2341.0183 171.06686 2.04708 2337.0054 2345.0312 2083.40 2488.47 Total 35399 3840.3877 1442.60150 7.66748 3825.3592 3855.4162 804.03 5467.87 B12 2491 61.1519 1.45029 02906 61.0949 61.2089 59.39 62.91 B13 10146 235.1844 17.84495 17716 234.8371 235.5316 212.34 256.42 B14 15778 434.9504 48.98955 39001 434.1859 435.7149 366.65 473.95 B15 6983 308.8171 48.17746 57652 307.6869 309.9472 263.62 372.53 Total 35399 326.5029 119.45138 63489 325.2585 327.7473 59.39 473.95 Test of Homogeneity of Variances Levene Statistic df1 df2 Sig KLRT 2990.056 35395 000 KLRK 16609.068 35395 000 ANOVA Sum of Squares Between Groups KLRT Within Groups Total Between Groups KLRK Within Groups Total df Mean Square 72458124906.069 24152708302.023 1207933965.727 35394 34128.213 73666058871.796 35397 447769601.774 149256533.925 57306766.980 35394 1619.110 505076368.754 35397 F Sig 707705.042 000 92184.327 000 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG, BIỂU, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Giới thiệu Tục đoạn 1.1.1 Sơ lược họ Dipsacaceae 1.1.2 Vị trí phân loại Tục đoạn 1.1.3 Đặc điểm sinh học Tục đoạn 1.1.3.1 Đặc điểm hình thái 1.1.3.2 Sinh thái, sinh trưởng, phát triển phân bố 1.1.3.3 Bộ phận dùng 1.1.3.4 Thành phần hóa học 1.1.3.5 Tác dụng dược lý 1.2.Tình hình nghiên cứu tạo rễ bất định in vitro 1.2.1.Trên giới 1.2.2 Ở Việt Nam PHẦN MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Mục tiêu 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.3 Đối tượng, địa điểm nghiên cứu 13 2.4 Phương pháp nghiên cứu 14 2.4.1 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật tạo rễ bất định Tục đoạntừ 14 2.4.2 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh rễ bất định Tục đoạn 15 2.4.2.1 Ảnh hưởng IBA NAA đến khả nhân nhanh rễ Tục đoạn 15 2.4.2.2 Ảnh hưởng hàm lượng đường sucrose đến khả nhân nhanh rễ Tục đoạn 17 2.4.2.3 Ảnh hưởng hàm lượng agar đến khả nhân nhanh rễ Tục đoạn 18 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Kết cảm ứng rễ bất định in vitro Tục đoạn từ 20 3.2 Kết ảnh hưởng IBA NAA đến khả nhân nhanh rễ Tục đoạn 23 3.3 Kết ảnh hưởng hàm lượng đường sucrose đến khả nhân nhanh rễ Tục Đoạn 26 3.4 Kết ảnh hưởng hàm lượng agar đến khả nhân nhanh rễ Tục đoạn 28 PHẦN KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 31 4.1 Kết luận 31 4.2 Tồn 31 4.3 Kiến nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ BIỂU