Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định từ cây đảng sâm nam (codonopsis javanica (blume) hook f ,)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC  - - HOÀNG NGỌC HÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO RỄ BẤT ĐỊNH TỪ CÂY ĐẢNG SÂM NAM (CODONOPSIS JAVANICA (BLUME) HOOK.F.,) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên – 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC  - - HOÀNG NGỌC HÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO RỄ BẤT ĐỊNH TỪ CÂY ĐẢNG SÂM NAM (CODONOPSIS JAVANICA (BLUME) HOOK.F.,) Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS Vũ Thị Lan Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên Thái Nguyên - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực hướng dẫn TS.Vũ Thị Lan Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Thái Ngun, tháng Tác giả Hoàng Ngọc Hà năm 2017 LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thị Lan giảng viên Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học- Đại học Thái Nguyên tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ suốt thời gian thực hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Khoa hocc̣ - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học thầy cô giáo, cán Khoa, đặc biệt quan tâm, giúp đỡ anh chi c̣ kỹthṭviên phịng thí nghiệm Khoa Cơng nghệ sinh học Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo anh chi c̣kỹ thuật viên phịng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật, Viện nghiên cứu phát triển Lâm nghiệp, Trường đại học Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình làm luận văn thạc sĩ Tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè ln bên cạnh ủng hộ, khuyến khích, động viên tạo động lực để tơi hồn thành luận văn Trong q trình làm luận văn khơng tránh khỏi sai sót, tơi mong nhận đóng góp q báu từ phía thầy bạn bè Xin trân trọng cảm ơn! Thái Nguyên, 2017 tháng Tác giả Hoàng Ngọc Hà năm MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Nội dung nghiên cứu TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Đảng Sâm 1.1.1 Phân loại khoa học 1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh thái Đảng Sâm 1.1.3 Giá trị dược liệu Đảng Sâm 1.1.4 Thành phần công dụng Đảng sâm 1.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy mơ tế bào thực vật 1.2.2 Điều kiện nuôi cấy 1.2.3 Môi trường dinh dưỡng 1.2.4 Sự phát sinh hình thái 12 1.3 Tình hình nghiên cứu nhân sinh khối rễ dược liệu phương pháp nuôi cấy mô giới Việt Nam 14 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 14 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 15 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Vật liệu nghiên cứu 18 2.1.1 Vật liệu thực vật 18 2.1.2 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 18 2.1.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3 Chỉ tiêu theo dõi đánh giá 21 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường đến khả phát triển hệ rễ bất định Đảng sâm 23 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến khả tạo mô sẹo rễ bất định Đảng sâm 25 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng 2,4D lên tạo mô sẹo từ Đảng sâm .25 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng NAA đến khả cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo Đảng sâm 28 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng IBA đến khả cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo Đảng sâm 29 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng số chất hữu tự nhiên, đường đến tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm 32 3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nước dừa đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm 32 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm 34 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ peptone đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm 36 3.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng đường đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm 38 3.4 Nghiên cứu tăng trưởng rễ bất định ni cấy mơi trường lỏng (bình bioreactor) 40 3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng thể tích mơi trường đến khả nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm bình bioreactor sục khí liên tục 40 3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng tốc độ sục khí đến khả nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm môi trường lỏng 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 Kết luận 43 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT 2,4 D : 2,4 – Dichlophenoxy acetic acid B5 : Gamborg’s Cs : Cs CT : Công thức ĐC : Đối chứng IBA : Indole butyric acid MS : Murashige & Skoog (1962) NAA :  - Naphlene axetic acid TB : Trung bình KL : Khối lượng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.2 Các nguyên tố đa lượng dạng sử dụng Bảng 2.1 Danh mục thiết bị sử dụng đề tài 18 Bảng 3.1 Ảnh hưởng môi trường đến khả phát triển hệ rễ bất định Đảng sâm sau tuần nuôi cấy 24 Bảng 3.2 Ảnh hưởng 2,4 D đến hình thành mô sẹo từ mẫu Đảng sâm 26 Bảng 3.3 Ảnh hưởng hàm lượng NAA đến hình thành rễ bất định in vitro Đảng sâm sau 40 ngày 28 Bảng 3.4 Ảnh hưởng hàm lượng IBA đến hình thành rễ bất định in vitro Đảng sâm sau 40 ngày 29 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nước dừa đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm 32 Bảng 3.6 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm môi trường đặc sau 40 ngày 34 Bảng 3.7 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ peptone đến khả sinh trưởng phát triển rễ bất định Đảng sâm môi trường đặc sau 40 ngày 36 Bảng 3.8 Ảnh hưởng hàm lượng đường đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm sau 40 ngày 39 Bảng 3.9 Ảnh hưởng thể tích mơi trường đến khả nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm bình bioreactor sục khí liên tục 40 Bảng 3.10 Kết nghiên cứu ảnh hưởng tốc độ sục khí đến khả nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm môi trường lỏng 41 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Đảng Sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,) Hình 3.1: Ảnh hưởng mơi trường ni cấy đến khả sinh trưởng phát triển hệ rễ bất định Đảng sâm 24 Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ 2,4D đến hình thành mơ sẹo 27 Hình 3.3 Ảnh hưởng hàm lượng NAA đến khả cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo Đảng sâm 29 Hình 3.4 Ảnh hưởng hàm lượng IBA đến khả cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo Đảng sâm 30 Hình 3.5: Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm môi trưởng đặc sau 40 ngày 33 Hình 3.6: Ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm môi trường đặc sau 40 ngày 35 Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng độ peptone đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm môi trường đặc sau 40 ngày 37 Hình 3.8 Ảnh hưởng số chất hữu tự nhiên đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm 38 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Trong nguồn tài nguyên lâm sản gỗ phong phú Việt Nam, thuốc mọc tự nhiên giữ vị trí quan trọng số lượng loài, giá trị sử dụng kinh tế cao Theo kết điều tra nghiên cứu ngành Y tế, biết Việt Nam có tới gần 4000 lồi thực vật Nấm có cơng dụng làm thuốc Trong có tới 90% mọc tự nhiên tập trung chủ yếu quần xã rừng [19] Từ nguồn thuốc mọc tự nhiên, hàng năm khai thác khối lượng lớn loại dược liệu, sử dụng cho nhu cầu làm thuốc nước xuất [3] Tuy nhiên, khai thác liên tục nhiều năm, với nhiều nguyên nhân tác động khác làm cho nguồn thuốc mọc tự nhiên Việt Nam bị giảm sút nghiêm trọng; số lồi thuộc diện q lâm vào tình trạng có nguy bị tuyệt chủng cao Bởi vậy, vấn đề bảo tồn thuốc bị đe dọa coi nhóm đối tượng ưu tiên, chiến lược bảo tồn phát triển bền vững nguồn tài nguyên lâm sản sỗ Việt Nam [9] Đảng Sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,) lồi dược liệu có giá trị kinh tế cao, loại thuốc quý có tác dụng bồi bổ sức khỏe, nâng cao thể lực, tăng khả miễn dịch cho thể, có tác dụng ích huyết, sinh tân dịch, chống mệt mỏi, giảm stress, dùng làm thuốc bổ trường hợp tỳ vị suy yếu, thiếu máu ốm dậy; chữa đau dày, ho, viêm thận, nước tiểu có albumin rễ củ có chứa nhiều saponins, triterpenes, steroid Ngoài non làm rau ăn [8] Ở núi, Việt Nam, Đảng sâm phân bố tương đối rộng rãi nhiều tỉnh miền có giá trị sử dụng kinh tế cao, thuốc bị khai thác liên tục nhiều năm, chí cịn xuất khơng thức qua biên giới Hơn nữa, nạn phá rừng, mở rộng nương rẫy, làm cho Đảng sâm mọc tự nhiên tất tỉnh trở nên rõ rệt Đảng sâm đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (1996) Danh lục Đỏ thuốc Việt Nam (1996, 2001, 2006) Đồng thời có tên Nghị định số 32/2006/NĐ CP Chính phủ (30/3/1006) nhằm tăng cường quản lý bảo vệ [6] Việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật làm tăng hệ số nhân giống thực vật thời gian ngắn, đồng thời việc nuôi cấy tế bào, mô quan thực vật giúp nhà nghiên cứu thu nhận sinh khối hay hợp chất thứ cấp có giá trị y dược với hiệu suất cao sản xuất từ tế bào vi sinh vật tổng hợp đường hố học [4] PHỤ LỤC 1: MƠI TRƯỜNG NI CẤY Bảng 1.1: Mơi trường MS Murashige and Skoog’s MS thành phần I II III IV V Vitamin Sucrose Agar pH Bảng 1.2: Môi trường B5 B5 thành phần Inositol Vitamins Sucrose Agar pH PHỤ LỤC 02 XỬ LÝ SỐ LIỆU Bảng 1: Kết nghiên cứu ảnh hưởng môi trường đến khả phát triển hệ rễ bất định Đảng sâm Ảnh hưởng môi trường đến khả phát triển hệ rễ bất định Đảng sâm VARIATE V003 KL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ NL * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE ND1 12/09/** 15: PAGE Ảnh hưởng môi trường đến khả phát triển hệ rễ bất định Đảng sâm MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ KL 1 SE(N= 5%LSD ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE ND1 12/09/** 15: Ảnh hưởng môi trường đến khả phát triển hệ rễ bất định Đảng sâm F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - 4) 6DF Bảng 2: Kết nghiên cứu ảnh hưởng 2,4D lên hình thành mơ sẹo từ mẫu Đảng sâm BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLRT FILE MS 12/ 09/** 15:30 PAGE Anh huong cua 2,4D lens u hinh mo seo tu mau la Dang sam VARIATE V003 KLRT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MS -Anh huong cua 2,4D lens u hinh mo seo tu mau la Dang sam MEANS FOR EFFECT CT - CT SE(N= 5%LSD 3) 8DF - ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE Anh huong cua F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE KLRT GRAND ME (N= NO OBS 12 Bảng 3: Kết nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng NAA đến khả cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo Đảng sâm BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLRT FILE NAA 12/ 09/** 15:12 PAGE VARIATE V003 KLRT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NAA -MEANS FOR EFFECT CT - CT SE(N= 5%LSD - ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - Bảng 4: Ảnh hưởng hàm lượng IBA đến khả cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo Đảng sâm BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLRT FILE IBA 12/ 09/** 5:59 PAGE VARIATE V003 KLRT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE IBA -MEANS FOR EFFECT CT - CT SE(N= 5%LSD - ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE IBA Bảng 5: Ảnh hưởng hàm lượng đường đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLRT FILE DUONG 12/ 09/** 9:11 PAGE VARIATE V003 KLRT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE DUONG -MEANS FOR EFFECT CT - SE(N= 5%LSD - ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - Bảng 6: Ảnh hưởng nước dừa đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLRT FILE NUOCDUA 12/ 09/** 17:49 PAGE VARIATE V003 KLRT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NUOCDUA -MEANS FOR EFFECT CT - SE(N= 5%LSD - ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NUOCDUA Bảng 7: Ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đén khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLRT FILE NAMMEN1 12/ 09/** 22:31 PAGE VARIATE V003 KLRT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NAMMEN1 12/ 09/** 22:31 PAGE MEANS FOR EFFECT CT - CT SE(N= 5%LSD - ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NAMMEN1 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - Bảng 8: Ảnh hưởng nồng độ peptone đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLRT FILE PEPTONE 12/ 09/** 5:59 PAGE VARIATE V003 KLRT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE PEPTONE 12/ 09/** 5:59 PAGE MEANS FOR EFFECT CT - CT SE(N= 5%LSD - ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE PEPTONE Bảng 9: Ảnh hưởng thể tích mơi trường đến khả nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm môi trường lỏng ALANCED ANOVA FOR VARIATE KLRT FILE THETICH 12/ 09/** 16:34 PAGE VARIATE V003 KLRT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THETICH MEANS FOR EFFECT CT - CT SE(N= 5%LSD 2) 6DF - ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THETICH Bảng 10: Ảnh hưởng tốc độ sục khí đến khả nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm môi trường lỏng BALANCED ANOVA FOR VARIATE KLRT FILE SUCKHI2 12/ 09/** 18: PAGE Anh huong cua toc suc VARIATE V003 KLRT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF SQUARES MEAN SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT * RESIDUAL * TOTAL (CORRECTED) TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SUCKHI2 12/ 09/** 18: PAGE Anh huong cua toc suc MEANS FOR EFFECT CT - SE(N= 5%LSD - ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SUCKHI2 ... bất định từ Đảng Sâm nam (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f. ,)? ?? Mục tiêu nghiên cứu Xác định môi trường phù hợp để tạo rễ bất định Đảng Sâm in vitro nhân sinh khối rễ bất định Đảng Sâm bình... 28 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng NAA đến khả cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo Đảng sâm Kết nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng NAA đến khả cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo Đảng sâm trình... Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường đến khả phát triển hệ rễ bất định Đảng sâm - Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến khả tạo mơ sẹo rễ bất định - Nghiên cứu ảnh