Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định từ cây đảng sâm nam (codonopsis javanica (blume) hook f ,)

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm trên môi trường đặc sau 40 ngày .... 4 Hình 3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

- -

HOÀNG NGỌC HÀ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO RỄ BẤT ĐỊNH TỪ

CÂY ĐẢNG SÂM NAM (CODONOPSIS JAVANICA

(BLUME) HOOK.F.,)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên – 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

- -

HOÀNG NGỌC HÀ

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO RỄ BẤT ĐỊNH TỪ CÂY

ĐẢNG SÂM NAM (CODONOPSIS JAVANICA (BLUME)

HOOK.F.,)

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS Vũ Thị Lan

Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên

Thái Nguyên - 2017

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS.Vũ Thị Lan Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác

Thái Nguyên, tháng năm 2017

Tác giả

Hoàng Ngọc Hà

Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thị Lan giảng viên Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học- Đại học Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học và các thầy cô giáo, cán bộ trong Khoa, đặc biệt là sự quan tâm, giúp đỡ của các anh chi ̣ kỹ thuâ ̣t viên phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học

Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật, Viện nghiên cứu và phát triển Lâm nghiệp, Trường đại học Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn thạc sĩ

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè luôn bên cạnh ủng hộ, khuyến khích, động viên tạo động lực để tôi hoàn thành luận văn này

Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi mong nhận

được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè

Xin trân trọng cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng năm 2017

Tác giả

Hoàng Ngọc Hà

LỜI CAM ĐOAN 3

LỜI CẢM ƠN 4

MỤC LỤC 5

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Nội dung nghiên cứu 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây Đảng Sâm 3

1.1.1 Phân loại khoa học 3

1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh thái của cây Đảng Sâm 3

1.1.3 Giá trị dược liệu của cây Đảng Sâm 5

1.1.4 Thành phần và công dụng của Đảng sâm 5

1.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

1.2.2 Điều kiện nuôi cấy 8

1.2.3 Môi trường dinh dưỡng 8

1.2.4 Sự phát sinh hình thái 12

1.3 Tình hình nghiên cứu nhân sinh khối rễ dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô trên thế giới và Việt Nam 14

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 14

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 15

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Vật liệu nghiên cứu 18

2.1.1 Vật liệu thực vật 18

2.1.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 18

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3 Chỉ tiêu theo dõi và đánh giá 21

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng phát triển hệ rễ bất định cây Đảng sâm 23

sẹo và rễ bất định cây Đảng sâm 25

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D lên sự tạo mô sẹo từ lá cây Đảng sâm 25

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo cây Đảng sâm 28

3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo cây Đảng sâm 29

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên, đường đến sự tăng sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm 32

3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm 32

3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm 34

3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ peptone đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm 36

3.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm 38

3.4 Nghiên cứu sự tăng trưởng của rễ bất định khi nuôi cấy trong môi trường lỏng (bình bioreactor) 40

3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm trong bình bioreactor sục khí liên tục 40

3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến khả năng nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm trong môi trường lỏng 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43

1 Kết luận 43

2 Kiến nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

2,4 D : 2,4 – Dichlophenoxy acetic acid B5 : Gamborg’s

Cs : Cs

CT : Công thức

ĐC : Đối chứng

IBA : Indole butyric acid

MS : Murashige & Skoog (1962)

NAA :  - Naphlene axetic acid

TB : Trung bình

KL : Khối lượng

Bảng 1.2 Các nguyên tố đa lượng và dạng sử dụng chính 9 Bảng 2.1 Danh mục thiết bị sử dụng trong đề tài 18 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát triển hệ rễ bất định cây Đảng sâm sau 4 tuần nuôi cấy 24 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của 2,4 D đến sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá Đảng sâm 26 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến sự hình thành rễ bất định in vitro cây Đảng sâm sau 40 ngày 28 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến sự hình thành rễ bất định in vitro cây Đảng sâm sau 40 ngày 29 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định

Đảng sâm 32 Bảng 3.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm trên môi trường đặc sau 40 ngày 34 Bảng 3.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ peptone đến khả năng sinh trưởng

và phát triển rễ bất định Đảng sâm trên môi trường đặc sau 40 ngày 36 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm sau 40 ngày 39 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm trong bình bioreactor sục khí liên tục 40 Bảng 3.10 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến khả năng nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm trong môi trường lỏng 41

Hình 1.1: Đảng Sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,) 4

Hình 3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và phát triển

hệ rễ bất định Đảng sâm 24 Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến sự hình thành mô sẹo 27 Hình 3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng cảm ứng tạo rễ bất định từ

mô sẹo cây Đảng sâm 29 Hình 3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo cây Đảng sâm 30 Hình 3.5: Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm trên môi trưởng đặc sau 40 ngày 33 Hình 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm trên môi trường đặc sau 40 ngày 35 Hình 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ peptone đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm trên môi trường đặc sau 40 ngày 37 Hình 3.8 Ảnh hưởng một số chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm 38

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Trong nguồn tài nguyên lâm sản ngoài gỗ phong phú của Việt Nam, cây thuốc mọc tự nhiên giữ một vị trí quan trọng về số lượng loài, cũng như về giá trị sử dụng và kinh tế cao Theo kết quả điều tra nghiên cứu của ngành Y tế, hiện đã biết ở Việt Nam

có tới gần 4000 loài thực vật và Nấm có công dụng làm thuốc Trong đó có tới hơn 90% là cây mọc tự nhiên và tập trung chủ yếu trong các quần xã rừng [19] Từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên, hàng năm đã khai thác được một khối lượng lớn các loại dược liệu, sử dụng cho nhu cầu làm thuốc trong nước và xuất khẩu [3] Tuy nhiên, do khai thác liên tục nhiều năm, cùng với nhiều nguyên nhân tác động khác đã làm cho nguồn cây thuốc mọc tự nhiên ở Việt Nam bị giảm sút nghiêm trọng; một số loài thuộc diện quí hiếm đang lâm vào tình trạng có nguy cơ bị tuyệt chủng cao Bởi vậy, vấn đề bảo tồn những cây thuốc bị đe dọa được coi là nhóm đối tượng ưu tiên, trong chiến lược bảo tồn và phát triển bền vững nguồn tài nguyên lâm sản ngoài sỗ của Việt Nam [9]

Đảng Sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,) là loài cây dược liệu có

giá trị kinh tế cao, là loại thuốc quý có tác dụng bồi bổ sức khỏe, nâng cao thể lực, tăng khả năng miễn dịch cho cơ thể, có tác dụng ích huyết, sinh tân dịch, chống mệt mỏi, giảm stress, dùng làm thuốc bổ trong các trường hợp tỳ vị suy yếu, thiếu máu do mới ốm dậy; chữa đau dạ dày, ho, viêm thận, nước tiểu có albumin do rễ củ của cây

có chứa nhiều saponins, triterpenes, steroid Ngoài ra ngọn và lá non làm rau ăn [8]

Ở Việt Nam, Đảng sâm phân bố tương đối rộng rãi ở nhiều tỉnh miền núi, nhưng do có giá trị sử dụng và kinh tế cao, cây thuốc này đã bị khai thác liên tục nhiều năm, thậm chí còn được xuất khẩu không chính thức qua biên giới Hơn nữa, do nạn phá rừng, mở rộng nương rẫy, đã làm cho Đảng sâm mọc tự nhiên ở tất cả các tỉnh trở nên hiếm rõ rệt Đảng sâm đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (1996) và Danh lục Đỏ cây thuốc Việt Nam (1996, 2001, 2006) Đồng thời cũng có tên trong Nghị định số

32/2006/NĐ 9 CP của Chính phủ (30/3/1006) nhằm tăng cường quản lý và bảo vệ [6]

Việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã làm tăng hệ số nhân giống của thực vật chỉ trong một thời gian ngắn, đồng thời việc nuôi cấy tế bào, mô và

cơ quan thực vật đã giúp các nhà nghiên cứu thu nhận được sinh khối hay các hợp chất thứ cấp có giá trị trong y dược với hiệu suất cao khi không thể sản xuất từ tế bào vi

sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hoá học [4]

Đối với cây Đảng sâm, hiện nay nguồn cung cấp dược liệu vẫn chủ yếu bằng thu hái tự nhiên và nuôi trồng truyền thống Tuy nhiên, việc nuôi trồng lại phụ thuộc rất nhiều vào các điều kiện sinh thái và trồng trọt Do cây Đảng sâm có thời gian thu hoạch phải từ 2-3 năm Hơn nữa, việc phòng trừ các loại dịch bệnh, tồn dư của thuốc bảo vệ thực vật cũng là một vấn đề khó khăn [2]

Với các ưu điểm như nâng cao hàm lượng, chủ động quá trình sản xuất, tối ưu hóa quá trình chiết xuất hợp chất mục tiêu, việc nhân nuôi sinh khối cây dược liệu bằng phương pháp công nghệ sinh học để thu hợp chất thứ cấp là một biện pháp triển vọng để khắc phục những hạn chế của phương pháp nuôi trồng truyền thống Phương pháp này có thể tạo ra một lượng sinh khối rễ bất định lớn trong thời gian ngắn nhằm phục vụ nhu cầu dược liệu của con người, rút ngắn thời gian sản xuất, cho hiệu quả kinh tế vô cùng lớn đồng thời góp phần đáp ứng nguồn nguyên liệu dùng chế biến sản phẩm sử dụng trong lĩnh vực y dược [4] Trên đối tượng cây Đảng sâm, hiện nay các nghiên cứu chỉ mới tập trung vào đánh giá tác dụng dược lý, phân tích thành phần hóa

học hay nhân giống in vitro [11] Xuất phát từ thực tiễn này, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định từ cây Đảng Sâm nam (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,)”

Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được môi trường phù hợp để tạo rễ bất định cây Đảng Sâm in vitro và

nhân sinh khối rễ bất định Đảng Sâm trong bình bioreactor

2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát triển hệ rễ bất định cây Đảng sâm

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây Đảng Sâm

1.1.1 Phân loại khoa học

Đảng sâm có tên khoa học là Codonopsis javanica (Blume) Hook f et

Thoms hay còn có tên gọi khác là Sâm leo, Sâm nam, Cây đùi gà, Ngân đằng; Mằn rày cáy (Tày); Co nhả đòi (Thái); Cang hô (H' Mông) Thường mọc ven rừng, nương rẫy bỏ hoang lâu ngày ở độ cao 700m trở lên đối với các tỉnh phía Bắc và độ cao 1300m đối với các tỉnh phía Nam Là loại cây ưa ẩm, ưa sáng, ưa bóng, mọc nơi đất tốt, nhiều mùn [6],[8]

Đảng Sâm mọc rải rác ở các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam, phân bố chủ yếu ở các tỉnh Hà Giang (Vị Xuyên, Đồng Văn, Mèo Vạc, Quản Bạ, Yên Minh ) Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát, Mường Khương, Văn Bàn); Lai Châu (Sìn Hồ, Phong Thổ, Mường Tè, Than Uyên) Yên Bái (Mù Căng Chải, Văn Chấn); Cao Bằng; Lạng Sơn; Hòa Bình; Sơn La; Nghệ An (Kỳ Sơn); Hải Dương (Chí Linh) , ở các tỉnh phía nam trở nên hiếm dần, chỉ thấy tập trung xung quanh núi Ngọc Linh (Quảng Nam, Kon Tum); vùng Đà Lạt và núi LangBiang (Lâm Đồng) Ngoài ra trên thế giới cây còn xuất hiện ở Trung Quốc, Lào, Ấn Độ, Myanma và Nhật Bản [16]

Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm

sắc thể, cây Đảng Sâm được phân loại như sau: [6],[29]

Tên Việt Nam: Đảng sâm nam

Tên khoa học: Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,

Họ: Hoa chuông (Campanulaceae)

Bộ: Hoa chuông (Campanulales)

Lớp (nhóm): Hai lá mầm (Magnoliopsida)

Ngành: Hạt kín (Magnoliophyta)

Giới: Thực vật (Plantae)

1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh thái của cây Đảng Sâm

Theo Sách đỏ Việt Nam [6] và Từ điển cây thuốc Việt Nam [8] đã chỉ ra đặc điểm

sinh lý, sinh thái của cây Đảng sâm như sau:

Dây leo nhỏ, sống nhiều năm, leo bằng thân quấn Có rễ bất định (củ) hình trụ, màu ngà vàng, có thể phân nhánh, nạc Thân leo dài trên 1m, màu xanh hay phớt tím hồng, có lông nhỏ ở ngọn non sau nhẩn Lá mọc đối, ít khi mọc so le, có cuống; phiến lá hình tim, dài 3 - 8cm, rộng 2 - 4cm, gốc lá chia 2 thùy tròn, đầu hơi nhọn, mép hơi lượn sóng hoặc có răng cưa tù; mặt trên lá xanh, mặt dưới màu hơi xám bạc; có lông nhỏ lúc non

Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá, có cuống dài 2 - 3cm; 5 lá đài thuôn hẹp màu xanh hoặc phớt tía; tràng hình chuông, màu trắng, có các gân màu tía, đầu xẻ thành 5 thùy, họng màu tím đen; 5 nhị, chỉ nhị dẹt, bao phấn đính gốc Bầu có 5 ô; núm

nhụy ngắn, tồn tại ở quả

Quả nang, gần hình cầu, đường kính 1 - 1,6cm; vết tràng hoa còn lại thành 5

gờ nông; khi chín màu tím đen Hạt nhiều, màu vàng nâu Toàn cây có nhựa mủ

màu trắng Mùa hoa quả: từ tháng 9 – tháng 12

Cây ưa ẩm, ưa sáng nhưng có thể hơi chịu bóng; thường mọc lẫn với các cây cỏ thấp ở ven rừng, đất sau nương rẫy hoặc trong các hốc đá ở rừng núi đá vôi Độ cao từ 600m (Bắc Sơn - Lạng Sơn) đến 1.600m (Hà Giang, Lào Cai) Đảng sâm sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm Sau khi quả già, phần trên mặt đất thường tàn lụi và sẽ mọc lại (từ đầu củ) vào mùa xuân năm sau Song đối với cây còn nhỏ (chưa ra hoa quả năm đầu tiên) không có hiện tượng lụi mùa đông Cây tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt Do

có củ nằm sâu dưới mặt đất, đảng sâm có thể tồn tại qua đợt cháy rừng hay đốt nương

làm rẫy

Hình 1.1: Đảng Sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,)

(Nguồn: https://botanyvn.com/cay-dang-sam-nam)

1.1.3 Giá trị dược liệu của cây Đảng Sâm

Cây Đảng Sâm có tác dụng và được sử dụng tương tự cây Nhân Sâm trong đời sống nhân dân Việt Nam và được coi là "nhân sâm của người nghèo" [12] Thành phần quan trọng nhất trong cây Đảng Sâm là bộ phận rễ củ của cây Rễ đảng sâm được thu hoạch vào năm thứ 3 hay 4 của đời cây và phơi khô trước khi đem bán Rễ cây Đảng Sâm có chứa các chất như saponin, đường khử, acid amin, chất béo, terpen, hợp chất glycosid, vitamin, các nguyên tố khoáng, alkaloid [11] Hợp chất được ưu tiên quan tâm nhất trong rễ cây Đảng Sâm là saponin Nó có nhiều tác dụng to lớn Đối với các

hệ cơ quan trong cơ thể có tác dụng chống mệt mỏi, tăng cường sự thích nghi của cơ thể với môi trường ở nhiệt độ cao Đối với hệ tiêu hóa, có tác dụng tăng cường trương lực của hối tràng Đối với tim mạch có tác dụng làm tăng cường độ co bóp của tim, tăng lượng máu cho não, chân và nội tạng Đối với máu và hệ thống máu giúp làm tăng lượng hồng cầu, huyết sắc tố, làm giảm số lượng bạch cầu, làm tăng nhanh máu đông khô mà không có tác dụng tán huyết Ngoài ra còn có tác dụng hạ huyết áp, tăng

cường miễn dịch của cơ thể, có tác dụng kháng viêm, giảm ho, kháng khuẩn,…[ 23]

1.1.4 Thành phần và công dụng của Đảng sâm

Thành phần hóa học:

Lá Ðảng sâm non chứa nước 77,5%, protid 4,2%, glucid 13,1%, xơ 3,3%, caroten 3,6mg%, vitamin C 85,5mg% Sơ bộ thấy trong rễ cây có đường, chất béo; không chỉ có saponin là thành phần chính còn có anthraglucosid, iridoid glucoside, các sterol, các chất vô cơ như K, Na, Mg, Fe, Cu, Zn…, tinh bột, đường, acid hữu cơ, tinh

dầu, vitamin C [11]

Theo Y dược học Trung Hoa [1] và Dược điển Việt Nam [7] Đảng sâm có rất

nhiều công dụng và có nhiều bài thuốc được áp dụng trong dân gian như sau:

Công dụng dược lý của Đảng sâm:

+ Tác dụng tăng sức: Thực nghiệm cho thấy Đảng sâm có tác dụng chống mỏi mệt và tăng sự thích nghi của động vật trong môi trường nhiệt độ cao Thực nghiệm trên động vật chứng minh rằng Đảng sâm có tác dụng trên cả 2 mặt hưng phấn và ức chế của vỏ não Thí nghiệm cho thấy dịch chiết xuất thô của Đảng sâm có tác dụng làm tăng sự thích nghi của chuột nhắt trong trạng thái thiếu dưỡng khí (do thiếu dưỡng khí ở tổ chức tế bào, do suy tuần hoàn hoặc do làm tăng sự tiêu hao dưỡng khí…) thuốc đều có tác dụng với mức độ khác nhau [7]

+ Đối với máu và hệ thống tạo máu [7]:

* Nước sắc Đảng sâm có tác dụng làm tăng số lượng hồng cầu, huyết sắc tố Dịch tiêm Đảng sâm tăng nhanh máu đông mà không có tác dụng tán huyết

* Tiêm mạch máu dung dịch Đảng sâm 20% (4ml/1kg thể trọng) hoặc cho uống (mỗi ngày 20g) đều thấy hồng cầu tăng lên, bạch cầu giảm xuống

+ Đối với huyết áp: Tiêm mạch máu dung dịch Đảng sâm 20% (chiết xuất bằng nước và bằng rượu) cho thỏ và chó đã gây mê đều thấy hạ huyết áp Tác giả có tiêm dung dịch 4,8% glucose và đối chứng là dung dịch đảng sâm không chứa glucose thì không thấy hạ huyết áp, do đó tác giả cho rằng hiện tượng hạ huyết áp không liên quan đến thành phần đường trong Đảng sâm Tác giả cho rằng hiện tượng hạ huyết áp là do gĩan mạch ngoại vi Đảng sâm còn có tác dụng ức chế hiện tượng cao huyết áp do Adrenalin gây ra: nếu lượng Adrenalin tiêm thì cao thì hiện tượng ức chế kém, nếu lượng Adrenalin tiêm thấp thì hiện tượng ức chế càng mạnh [7]

+ Tăng khả năng miễn dịch của cơ thể: dùng chế phẩm Đảng sâm tiêm bụng, tiêm bắp hoặc tiêm tĩnh mạch chuột nhắt đều có tác dụng làm tăng số lượng thực bào

rõ rệt, thể tích tế bào tăng giả túc nhiều hơn, khả năng thực bào cüng tăng Các thành phần trong tế bào như DNA, RNA, các enzym, acid được tăng lên rõ rệt [7]

+ Kháng viêm, hóa đàm, chỉ khái (giảm ho)

+ Kháng khuẩn: Trên thực nghiệm ‘In Vitro’ thấy Đảng sâm có tác dụng kháng

khuẩn ở mức độ khác nhau đối với các loại vi khuẩn sau: Não mô cầu khuẩn, Trực khuẩn bạch hầu, Trực khuẩn và Phó trực khuẩn đại tràng, Tụ cầu khuẩn vàng, Trực khuẩn lao ở người [7]

+ Ngoài ra, Đảng sâm còn có tác dụng làm hưng phấn tử cung cô lập của chuột cống, phát triển nội mạc tử cung kiểu Progesteron mức độ nhẹ, gây tăng trương lực cổ

tử cung, tiết sữa ở động vật mẹ cho con bú, nâng cao corticosterone trong huyết tương, nâng cao đường huyết [7]

Một số bài thuốc từ Đảng sâm [1]:

+ Thanh Phế kim, bổ nguyên khí, khai thanh âm, tráng gân cơ: Đảng sâm 640g,

Sa sâm 320g, Quế viên nhục 160g Nấu thành cao, uống

+ Trị thần kinh suy nhược: Đảng sâm 12g, Mạch môn 12g, Ngũ vị tử 8g Sắc uống + Trị trẻ nhỏ miệng bị lở loét: Đảng sâm 40g, Hoàng bá 20g Tán bột, bôi

+ Trị huyết áp thấp: Đảng sâm 16g, Hoàng tinh 12g, Nhục quế 10g, Cam thảo 6g, Đại táo 10 quả, sắc uống ngày 1 thang 15 ngày là 1 liệu trình, dùng 1-2 liệu trình

+ Trị huyết áp cao ở người bị bệnh cơ tim: Đảng sâm 10g, Vỏ con trai (loại cho ngọc) 16g, Sinh địa 10g, Đương quy 10g, Trắc bá tử (hạt) 16g, Táo 16g, Phục linh 16g, Mộc hương 6g, Hoàng liên 6g Sắc với 800ml nước, chia làm 3 lần uống liên tục

+ Trị thần kinh suy nhược: dùng dung dịch tiêm ‘Phức Phương Đảng Sâm’ (mỗi

ml có 1g Đảng sâm, 50mg vitamin B1) tiêm bắp mỗi ngày 1 lần 2ml, liệu trình 15 ngày, có kết quả nhất định

+ Trị tử cung xuất huyết cơ năng: dùng độc vị Đảng sâm, mỗi ngày 30-60g, sắc, chia làm 2 lần uống, liên tục 5 ngày trong thời kì kinh nguyệt

+ Trị hư lao, ho, cơ thể suy nhược: Đảng sâm 16g, Hoài sơn 12g, dĩ nhân 6g, Cam thảo 2g, Khoản đông hoa 6g, Xa tiền tử 6g Sắc, chia làm 3 lần uống

+ Trị Thận suy, hay đau lưng, mỏi gối, đái lắt nhắt, bồi dưỡng cơ thể: Đảng sâm 16g, Cáp giới 6g, Huyết giác 1,2g, Trần bì 0,8g, Tiểu hồi 6g Ngâm với 1 xị (250ml) rượu uống trước khi đi ngủ

+ Trị cơ thể mỏi mệt, ăn không ngon, đại tiện lỏng: sắc 20 – 40g Đảng sâm uống, hoặc kết hợp các vị thuốc khác như: Bạch truật (sao), Đương quy, Ba kích mỗi thứ 12g, sắc uống hoặc tán bột viên với mật, ngày uống 12-20g

+ Trị người già suy yếu lâu ngày, người làm việc nhiều hao sức lao động cüng như trí óc: Đảng sâm 40g, Ngưu tất, Mạch môn, Đương quy, Long nhãn trí óc, mệt tim, ê ẩm: Đảng sâm 40g, Ngưu tất, Mạch môn, Đương quy, Long nhãn 8g

+ Trị trung khí suy nhược, vị bất hòa: nấu Đảng sâm với đường cát thành cao lỏng Đảng sâm, uống

+ Trị khí huyết đều suy: Đảng sâm, Chích hoàng, Bạch truật, Long nhãn, Đường cát, nấu thành cao uống

1.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những kỹ thuật được sử dụng để duy

trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng với những thành phần đã xác định [5]

Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên cơ sở tính toàn năng và sự phân hóa, phản phân hóa tế bào Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào

mô chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị:

phân hóa tế bào

tế bào phôi sinh tế bào dãn tế bào chuyên hóa

phản phân hóa tế bào

1.2.1 Vật liệu nuôi cấy

Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực vật Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô-tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay

bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá,…), các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ

lá mầm…), các cơ quan dự trữ (củ, thân rễ…) [5],[26]

Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và khả năng nuôi cấy [26]

1.2.2 Điều kiện nuôi cấy

- Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, các thao tác với mẫu cấy được tiến hành trong buồng cấy vô trùng

- Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn định về ánh sáng và nhiệt độ

1.2.3 Môi trường dinh dưỡng

Môi trường dinh dưỡng là điều kiện cần thiết cho mẫu nuôi cấy sinh trưởng và phát sinh hình thái, quyết định đến thành công của quá trình nuôi cấy [10] Thành phần

và nồng độ các chất trong môi trường dinh dưỡng đa dạng tùy thuộc loại mẫu và mục đích nuôi cấy nhưng đều gồm các thành phần chính sau:

- Nguồn cacbon

Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị

dưỡng mặc dù chúng có thể sống bán dị dưỡng trong điều kiện ánh sánh nhân tạo và

lục lạp vẫn có khả năng quang hợp Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc Nguồn cacbon thông dụng nhất hiện nay là saccharose, ngoài ra có thể sử dụng glucose, maltose [5]

- Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng

Nguyên tố đa lượng: Quan trọng nhất là các nguyên tố N, P, K, Mg, Ca, Na, S [5]

Bảng 1.2 Các nguyên tố đa lượng và dạng sử dụng chính

Nitơ

Thường được sử dụng ở dạng NO3- hoặc NH4+ , hầu hết các loại thực vật sẽ sử dụng nguồn nitơ này để đồng hóa và tổng hợp nên các sản phẩm hữu cơ

Phospho Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P có tác dụng

như hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường Kali Thường dùng ở dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O

Canxi Sử dụng chủ yếu là CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O

Magie Sử dụng chủ yếu là MgSO4

Lưu huỳnh Chủ yếu là SO4

-Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni… các nguyên tố vi lượng tuy bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng đối với quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô, tế bào nuôi cấy [5]

Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp

Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hydratcacbon

- Các chất hữu cơ tự nhiên

Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid, đường,

các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin…

Dịch thủy phân casein: Chứa nhiều amino acid

Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B

Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuối xanh…

- Các thành phần khác

Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm có một số chất hữu cơ như acid hữu cơ, acid béo; cùng 1 số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn… Ngoài tác dụng tạo gel cho môi trường agar cũng cung cấp 1 số chất dinh dưỡng cho tế bào, mô

nuôi cấy

Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chất thứ cấp gây ức chế sự sinh trưởng của mẫu nuôi cấy Ngoài ra, có thể sử dụng 1 số chất chống oxy hóa khác

như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascobic

- pH của môi trường

Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận chất dinh dưỡng của mẫu từ môi trường nuôi cấy Đa số pH của môi trường được điều chỉnh trong khoảng

từ 5,5-6,0 Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm do mẫu nuôi cấy sản sinh ra các acid hữu cơ

- Các chất điều hòa sinh trưởng

Theo Nguyễn Như Khanh trong tài liệu về chất điều hòa sinh trưởng thực vật

đã chỉ ra [20] : các chất điều hòa sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật Hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính của chất

điều hòa sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy

Dựa vào hoạt tính sinh lý phân chất điều hòa sinh trưởng thành 2 nhóm: Nhóm chất kích thích sinh trường và nhóm chất ức chế sinh trưởng Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử dụng [10]

Nhóm Auxin: Được phát hiện lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con trai là Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch Sau đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất này Auxin trong cơ thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảy mầm, trong phấn hoa Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên cơ thể thực vật Cụ thể

như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động của thực vật, tiêu biểu là tính hướng sáng và hướng đất Auxin gây ra hiện tượng ưu thế đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh

sẽ ức chế chồi nách) Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễ phụ do auxin kích thích sự phân chia của tế bào trụ bì, nơi rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ và biểu bì Ngoài ra, auxin còn có tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển của quả và làm chậm sự rụng lá

Các auxin thường được sử dụng là NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân tạo), IAA (auxin tự nhiên) Hoạt tính của các chất này được xếp theo thứ tự từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA và 2,4D IAA nhạy cảm với nhiệt độ và dễ phân hủy trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong môi trường nuôi cấy mô NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ cao Tuy nhiên chất 2,4D là chất dễ gây độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus

Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX, chất đầu tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích Tiếp đó, đến zeatin tách từ nội nhũ của hạt ngô non Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo, tảo silic, rêu, dương xỉ, cây lá kim Zeatin có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi khuẩn Trong thực vật, cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh Cytokinin kích thích hoặc

ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đổi chất Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ, ngược lại sẽ hình thành chồi Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ức chế ưu thế đỉnh Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin Ngoài ra, cytokinin còn làm chậm sự già hóa

Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì kinetin và BAP được sử dụng phổ biến

vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin với tỷ lệ thích hợp có khả năng kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền với nhiệt), ngoài ra có thể sử dụng TDZ, Diphenylurea…

Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần đầu tiên từ dịch tiết của nấm bởi các nhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938 Gibberellin được tổng hợp trong các

mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển Gibberellin có tác dụng chính trong việc hoạt hóa phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kích thước của chồi nuôi cấy GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất

1.2.4 Sự phát sinh hình thái

1.2.4.1 Định nghĩa

Phát sinh hình thái là thuật ngữ được dùng để chỉ những thay đổi của cơ thể thực vật theo thời gian để hoàn thành chu trình phát triển [20]

Phát sinh hình thái ở thực vật bao gồm các quá trình:

- Phát sinh mô ( Histogenesis )

- Phát sinh cơ quan (Organogenesis)

- Phát sinh phôi ( Embryogenesis )

Phát sinh hình thái thực vật tùy thuộc hai quá trình cơ bản: sự điều hòa hướng kéo dài tế bào và sự kiểm soát vị trí và hướng mặt phẳng phân chia của tế bào Chính kiểu tăng trưởng của mọi tế bào riêng rẽ quyết đinh hình thái của cơ quan và cơ thể thực vật [20]

1.2.4.2 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sự phát sinh hình thái in vitro dẫn tới nhiều ứng dụng của sinh học thực vật cho các nghiên cứu về thực vật học, sinh hóa học, vi nhân giống và phát triển cây trồng chuyển gen ( transgenic crops ) [39],[44]

Phát sinh hình thái là một trong những vấn đề căn bản và phức tạp nhất của sinh học Nhiều nhà sinh học thực vật cho rằng không thể chỉ mô tả hình thái và cấu trúc thực vật mà cần phải tìm hiểu nguồn gốc phát sinh và các yếu tố liên quan trong các biến đổi hình thái và cấu trúc Do đó, không có một kỹ thuật hay phương pháp riêng rẽ nào có thể chứng minh được tất cả mọi khía cạnh của nó Những kĩ thuật từ nhiều lĩnh vực khác nhau như mô học, giải phẫu học, sinh lý học, tế bào học và di truyền học đều

có thể giúp ta tìm hiểu hiện tượng phát sinh hình thái [20]

Trong số các phương pháp thực nghiệm, hai phương pháp thường được dùng nhất là:

- Cắt bỏ một vùng lân cận của mô phân sinh và theo dõi các biến đổi phát triển sau đó

- Nuôi cấy in vitro trong điều kiện vô trùng và có kiểm soát các phần tách rời của một cơ thể thực vật

1.2.4.3 Sự phát sinh rễ

Rễ mầm được phát triển từ sinh mô chóp (tiền sinh mô) Sinh mô này có một hoạt tính đặc biệt có thể riêng cho từng loài thực vật Về nguồn gốc của rễ có thể có hai cách giải thích:

- Do ba tế bào nguyên thủy tạo ra: một sẽ tạo ra vùng trục trung tâm, một sẽ tạo

ra vùng vỏ, một sẽ tạo ra vùng chóp Có thể mỗi vùng có tế bào nguyên thủy riêng

- Chóp rễ và vỏ tạo thành một nhóm không phân biệt có thể vì tế bào nguyên thủy chung cho cả ba vùng

Vì rễ thường khởi đầu từ trong trụ nên rễ thường được cho là có nguồn gốc nội sinh Tuy nhiên, ở Cardamine pratensis, các thay đổi xảy ra ở vùng tế bào nằm phía ngoài vùng trụ Đây là trường hợp rễ có nguồn gốc ngoại sinh

Sau khi thoát ra khỏi vỏ hạt và tăng trưởng, rễ sẽ phát triển và tạo rễ nhánh và

rễ phụ Sự phát triển đó gồm một loại phản ứng phân hóa Rễ nhánh xuất hiện trên rễ chính, cơ chế giống rễ bất định Sự tạo rễ bất định là một bước ngoặc quan trọng sự nhân giống vô tính những cây gỗ quý, những cây lương thực, thực phẩm

Rễ bất định là những rễ thông thường ở thực vật có mạch và được tạo ra ở nhiều vùng trên cơ thể thực vật như đốt, nhánh phụ, lá, thực vật cấp thấp nhưng có mạch; đơn tử diệp hay song tử diệp nhân giống bằng giò, dây leo hay thủy thực vật hoặc những thực vật sống bám vào cây chủ Hiện tượng hình thái giải phẫu thực vật có thể chung cho hai cơ quan rễ nhánh hoặc rễ bất định [48]

Rễ bất định có thể mọc ra từ mô của thân trong điều kiên môi trường stress hay

bị vết thương cơ học hoặc trong môi trường tái sinh chồi Có ít nhất hai con đường hình thành rễ bất định: từ những tế bào có khả năng tạo cơ quan như tế bào tượng tầng hay từ mô sẹo [54]

Sự hình thành rễ bất định được điều hòa bởi nhiều nhân tố môi trường và các yếu tố nội sinh [39] Các tác giả cho rằng sự cân bằng chất hoạt hóa và chất ức chế phiên mã Auxin Response Factor ( ARF ) điều khiển sự tượng rễ bất định [50] Auxin

và etilen được xem là hormon kích thích sự hình thành rễ bất định trong khi cytokinin

và gibberelin thì ngược lại [54]

Sự hình thành rễ bất định của cành chiết, cành giâm chia làm ba giai đoạn:

+ Giai đoạn đầu là sự tái phân chia của mô phân sinh bên (tầng phát sinh) tức là một số tế bào xảy ra sự phản phân hóa mạnh ở vùng xuất hiện rễ tạo nên một đám tế bào lộn xộn đó là mầm mống của rễ [22]

Giai đoạn khử phân hóa tế bào xảy ra như sau: lúc ban đầu không bào còn to, lạp thể và ti thể phân cắt mạnh, càng lúc càng nhỏ, tế bào trở nên giống như tế bào mô phân sinh cấp hai; sau đó tế bào chất đậm đặc dần, không bào phân chia, nhân và hạch nhân to ra Sau giai đoạn hoạt hóa này, tế bào có đặc tính của tế bào vùng mô phân sinh cấp một có khả năng sinh cơ quan Tiếp theo, các tế bào có sự phát triển mạnh hoạt tính phân chia tế bào để tạo thành khối mô phân sinh nhỏ Sự phân chia tăng lên tạo thành mô sẹo hay vùng phát sinh hình thái chứa các tế bào mô phân sinh cấp một [20]

+ Giai đoạn tiếp theo là giai đoạn xuất hiện mầm rễ

+ Giai đoạn cuối cùng là sự sinh trưởng và kéo dài của rễ, rễ thoát khỏi vỏ ra ngoài tạo nên rễ bất định [22]

1.3 Tình hình nghiên cứu nhân sinh khối rễ dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô trên thế giới và Việt Nam

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Tại Hàn Quốc và một số nước khác, Nhân sâm (Panax ginseng) đã được

nuôi cấy tạo rễ bất định thành công và được ứng dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp [39] [33]

Gao và cs (2006) đã nghiên cứu nuôi cấy rễ bất định trên đối tượng (Panax

notoginseng) Kết quả cho thấy rễ bất định đã được hình thành bằng ba phương

pháp Trong đó mô sẹo là nguyên liệu tốt cho việc cảm ứng hình thành rễ bất định 2,4D là hợp chất thích hợp nhất cho cảm ứng hình thành rễ bất định từ mô sẹo Việc tăng sinh khối rễ bất định tốt nhất là nuôi cấy trong môi trường lỏng [42]

Lee và cs (2011) đã nghiên cứu ảnh hưởng của auxin, cytokinin và nitơ đến sự

sản xuất rutin từ mô sẹo và rễ bất định của cây Dâu tằm (Morus Alba L.) Mô sẹo và rễ bất định được hình thành từ ba loài Dâu (Morus) Trong số ba loài dâu thử nghiệm cho sản xuất rutin, rễ bất định Sugye (M.alba L.) có mức cao nhất (242,2 mg/g mô tươi) của rutin Ngoài ra, các lá trưởng thành của loại cây này phát huy cao hơn của rutin so

với các lá non Thêm auxin như indole-3-acetic acid (IAA), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và naphthalene-1-acetic acid (NAA) không chỉ tăng cường sự phát triển của mô sẹo và rễ bất định, mà còn tăng protein và rutin Ngược lại, thêm cytokinin như

6-benzyladenine (BA) và kinetin (KIN) mô sẹo chậm phát triển và rễ bất định chậm phát triển [46]

Theo Reis (2011) và Amoo (2013), nhiều nghiên cứu đã cho thấy các chất điều tiết sinh trưởng, đặc biệt là nhóm auxin có ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển rễ bất định trong điều kiện in vitro Các loại auxin khác nhau ảnh hưởng khác nhau đến sự hình thành rễ bất định và chất mục tiêu [38],[47]

Verstraeten và cs (2013) khi nghiên cứu sự tạo rễ bất định ở cây Arabidopsis

thaliana đã bổ sung 5 auxin khác nhau gồm IAA, IBA, -NAA, 2,4 D và picloram vào

môi trường nuôi cấy để cảm ứng tạo rễ bất định từ đoạn thân cây Arabidopsis và nhận

thấy, ở cùng nồng độ, trong khi IAA, IBA, -NAA cảm ứng tạo rễ bất định thì 2,4 D

và picloram hoàn toàn không cảm ứng tạo rễ mà chỉ cảm ứng tạo callus từ mẫu cấy Trong đó, - NAA cho hiệu quả cảm ứng tạo rễ bất định cao hơn so với IAA và IBA [51]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Nguyễn Trung Thành và Paek Kee (2008) đã nghiên cứu ở củ Nhân Sâm Hàn Quốc và cho kết quả thu được 2,4 D là thích hợp cho sự hình thành và phát triển của

mô sẹo, còn IBA là thích hợp cho sự hình thành và tăng trưởng của rễ bất định Số rễ bất định được hình thành trên môi trường được bổ sung IBA nhiều hơn rất nhiều so với NAA Nồng độ đường sucrose ban đầu đã ảnh hưởng đến sự tăng trưởng sinh khối tế bào và sản phẩm saponin [33]

Trần Thanh Hương và cs (2009) đã nghiên cứu quá trình hình thành rễ bất định

ở chuối bao gồm 4 giai đoạn: tạo tế bào hoạt hóa, hình thành vùng tế bào mô phân sinh, hình thành sơ khởi rễ và kéo dài rễ Quá trình này chịu ảnh hưởng phần nào bởi kiểu gen, bản chất và nồng độ auxin được áp dụng Ở chuối Cau mẵn, 2,4D 0,1 mg/l kích thích sự hoạt hóa tế bào rễ tạo mô phân sinh rễ trong khi NAA 0,4 mg/l kích thích

sự tăng trưởng của các tế bào mô phân sinh ñể hình thành rễ thật sự [18]

Nguyễn Thị Liễu và cs (2010) đã nuôi cấy mẫu từ củ sâm Ngọc Linh (Panax

vietnamensis) tươi có kích thước 1cm x 1cm x 0,25cm trên môi trường MS có bổ

sung sucrose 50g/l, agar 8g/l, 2,4D 1mg/l đã cho kết quả hình thành mô sẹo và rễ bất định tốt nhất sau 2 tháng nuôi cấy Những đoạn cắt dài 1cm của những mẫu rễ bất định này sau đó được chuyển sang môi trường Gamborg (B5) được bổ sung sucrose 50g/l, agar 8 g/l, IBA 5mg/l đã cho kết quả hình thành và phát triển rễ bất định cũng như sự tăng sinh khối rất khả quan [21]

Nguyễn Thị Quỳnh và cs (2013) đã nghiên cứu sự hình thành và tăng trưởng rễ

bất định cây đương quy Nhật Bản Phiến lá ở ba vị trí khác nhau của chồi in vitro được

nuôi cấy trên môi trường khoáng MS kết hợp với vitamin Morel hay khoáng và vitamin Gamborg’s B5 Tỷ lệ mẫu tạo rễ đạt 100% cũng như khối lượng tươi của rễ (132,7 mg/mẫu) lớn nhất khi phiến lá ở vị trí thứ hai tính từ chồi ngọn được nuôi cấy trên môi trường Gamborg’s B5 Khi phiến lá được nuôi cấy trên môi trường Gamborg’s B5 có bổ sung các cytokinin bao gồm BA, Kinetin hoặc TDZ ở các nồng

độ 0,1; 0,5 hay 1 mg/l, tỷ lệ mẫu tạo rễ, số rễ/mẫu, khối lượng tươi của rễ cũng như tỷ

lệ khối lượng tươi rễ/khối lượng tươi mẫu lớn nhất ở nồng độ 0,1 mg/l BA Trong môi trường lỏng gồm khoáng MS, vitamin Morel, và bổ sung IBA ở các nồng độ 0,2; 0,5

hay 1 mg/l, rễ bất định của cây Đương quy Nhật Bản in vitro khi được nuôi trên máy

lắc ở tốc độ 100 vòng/phút đã gia tăng sinh khối theo sự gia tăng nồng độ IBA và theo thời gian nuôi cấy [28]

Trương Thị Quỳnh Như và cs, (2015) đã khảo sát ảnh hưởng của auxin lên sự

hình thành và tăng sinh của rễ bất định dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don)

Kết quả cho thấy sự cảm ứng tạo rễ xảy ra tốt nhất từ vật liệu lá mầm trên môi trường

có IBA 0,7 mg/l hoặc NAA 0,5 mg/l Nồng độ auxin thích hợp cho sự tăng sinh của rễ thấp hơn nồng độ auxin sử dụng trong giai đoạn cảm ứng tạo rễ từ mẫu cấy Môi trường MS lỏng kết hợp với IBA 0,3 mg/l hoặc NAA 0,1 mg/l thích hợp cho sự tăng sinh rễ bất định Các nồng độ cao hơn dẫn đến sự phát triển mạnh và chiếm ưu thế của

mô sẹo Sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường lỏng, sinh khối thu nhận được xác định khả năng tích lũy ajmalicine với hàm lượng cao [27]

Nguyễn Trung Hậu và cs (2015) đã nghiên cứu nuôi cấy mô lá Đinh lăng

(Polyscias fruticosa L Harms) tạo rễ tơ và nhận biết hoạt tính saponin tích lũy Kết

quả cho thấy môi trường MS có bổ sung NAA 1mg/l thích hợp cho nuôi cấy phát sinh

rễ tơ đạt 0,322 g/cụm Rễ tơ tăng sinh mạnh trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l Hàm lượng oleanolic acid và saponin tích tụ được xác định bằng HPLC Kết quả cho thấy qua nuôi cấy tích tụ trong rễ 40,1 µg/g và saponin 396,2 µg/g [15]

Ninh Thị Thảo và cs (2016) đã tiến hành nghiên cứu cảm ứng và nuôi cấy rễ bất định cây Ba Kích Nghiên cứu này được tiến hành nhằm tạo nguồn rễ bất định cây ba kích in vitro và bước đầu khảo sát một số yếu tố đến sự tăng trưởng rễ bất định Đoạn thân và lá cây ba kích được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung NAA, IAA và IBA

với 5 nồng độ khác nhau (0,1-1,0 mg/l) để cảm ứng tạo rễ bất định Kết quả cho thấy,

-NAA thể hiện hiệu quả tạo rễ bất định từ đoạn thân cây ba kích tốt hơn so với IAA

và IBA Tỉ lệ đoạn thân tạo rễ đạt cao nhất (100%) trên môi trường bổ sung 0,75 mg/l

-NAA Khác với vật liệu đoạn thân, mô lá cây ba kích hoàn toàn không cảm ứng tạo

rễ bất định trên môi trường MS + 0,75 mg/l -NAA sau 4 tuần nuôi cấy Khả năng tăng trưởng của rễ bất định cây ba kích trên môi trường nền B5 cao hơn so với môi trường nền MS Bổ sung -NAA, IAA và IBA vào môi trường nuôi cấy có tác dụng thúc đẩy sự tăng sinh khối rễ bất định ba kích Môi trường B5 + 1,0 mg/l -NAA là thích hợp nhất cho nuôi cấy rễ bất định ba kích, cho khối lượng rễ tươi đạt được cao

nhất (1,264 g) sau 12 tuần nuôi cấy [34]

Đối với cây Đảng sâm hiện nay các nghiên cứu tập trung chủ yếu về nhân giống

in vitro trong phòng thí nghiệm và phân tích thành phần hóa học, tác dụng dược lý của

cây Đảng sâm Cụ thể:

Tác giả Tống Xuân Hòa (2014) đã nghiên cứu nhân giống Sâm dây bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Bùi Minh Thắng và cs (2016) đã nhân giống thành công cây Đảng sâm bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào tại trường Đại học Lâm nghiệp

Cả 2 tác giả đều nhận định môi trường nền MS là thích hợp cho cây Đảng sâm sinh trưởng và phát triển đồng thời để phát sinh hình thái chồi sử dụng BA, phát sinh hình thái rễ sử dụng IBA trong môi trường nuôi cấy [22],[30]

Ngoài ra, những nghiên cứu trên Đảng sâm còn chủ yếu về phân tích thành phần hóa học, tác dụng dược lý

Năm 2002, Hoàng Minh Chung và cs đã bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của vị thuốc Đảng sâm Việt Nam [11] và cho thấy:

-Trong rễ Đảng sâm sống và chế biến có đường, saponin, acid amin và chất béo

- Bằng sắc kí lớp mỏng, bước đầu đã xác định được 5 vết trong saponin của Đảng sâm sống và chưng 2 giờ thấy hàm lượng saponin trong mẫu chế (1,47%) thấp hơn trong mẫu sống,

- Rễ Đảng sâm có 17 acid amin tuy hàm lượng không cao nhưng có đầy đủ acid amin cần thiết cho cơ thể

Tuy nhiên, theo tìm hiểu của tác giả các nghiên cứu về rễ bất định ở cây Đảng sâm hiện tại vẫn chưa có một công bố nào hay một công trình nào được đưa ra

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Lá lấy từ chồi in vitro cây Đảng sâm thuộc phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào

thực vật – Viện nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

2.1.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm

a) Hóa chất

Các thí nghiệm được tiến hành trên nền môi trường cơ bản MS gồm khoáng đa lượng, vi lượng và vitamin (Murashige và Skoog, 1962)

- Chất điều hòa sinh trưởng: 2,4 D, NAA, IBA (Sigma, Đức)

- Hợp chất hữu cơ: Cao nấm men, peptone (Phytech, USA), nước dừa

- Hóa chất khác: Đường sucrose, agar (Hạ Long, Việt Nam)

b) Thiết bị

Bảng 2.1 Danh mục thiết bị sử dụng trong đề tài

1 Cân phân tích PA 214 Ohaus Mỹ

2 Cân kỹ thuật KB2000-2N Kern Đức

3 Nồi hấp khử trùng HV110 Hirayama Nhật Bản

4 Tủ sấy ED 240 Binder Đức

5 Tủ cấy vô trùng AHC-3D1 Esco Singapore

6 Máy đo pH HI2211 Hanna Italia

7 Lò vi sóng NNCD997SYTE Pansonic Nhật Bản

8 Bộ micro- pipette 1 kênh EMC Đức

9 Bình bioreactor (2l) sục khí liên tục Việt Nam

Ngoài ra còn một số thiết bị khác của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của Viện nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Các thí nghiệm được thực hiện từ tháng 9/2016 – 9/2017 tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Lâm nghiệp – Đại học Nông lâm Thái Nguyên

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Thí nghiệm 1: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền đến

khả năng phát triển hệ rễ bất định cây Đảng sâm

- Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 4 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình 3 mẫu Trên môi trường lần lượt: CT1: MS, CT2: ½ MS, CT3: B5, CT4: ½ B5 không bổ sung chất kích thích sinh trưởng và sử dụng mẫu lá làm vật liệu nghiên cứu

Chỉ tiêu theo dõi: Khối lượng rễ tươi TB, Khối lượng rễ tăng, chất lượng rễ

Thí nghiệm 2: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến sự

hình thành mô sẹo từ mẫu lá cây Đảng sâm

Giả sử chọn được môi trường tốt nhất đã được chọn ở thí nghiệm 1 là A Mẫu lá

từ chồi cây Đảng sâm in vitro được cắt thành những mảnh có kích thước 2 x 4 mm

được tạo vết thương ở hai đầu Mẫu cấy được đặt trên môi trường A đặc có bổ sung 2,4 D với nồng độ: 0,0; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 mg/l để tạo mô sẹo tương ứng với các công thức từ 1 đến 5

Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình 3 mẫu

Chỉ tiêu theo dõi: Ngày hình thành mô sẹo, Khối lượng mô sẹo TB, Khối lượng

mô sẹo tăng, hình thái mô sẹo

Thí nghiệm 3, thí nghiệm 4: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của hàm

lượng IBA, NAA đến khả năng cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo cây Đảng sâm

Khối mô sẹo thu được từ thí nghiệm 2 được cấy chuyển sang môi trường A đặc

có bổ sung NAA, IBA với lần lượt các công thức: CT1: 0 mg/L, CT2: 0,5 mg/L, CT3:

Chỉ tiêu theo dõi: Số rễ trung bình/mẫu, hình thái rễ

Thí nghiệm 5: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng nước dừa đến

khả năng tăng sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm trên môi trường đặc

Giả sử chọn được môi trường tốt nhất đã được chọn ở thí nghiệm 1 và nội dung 3

là B, kết hợp với các hàm lượng nước dừa khác nhau với các thể thích: CT1: 0 ml/L, CT2: 50 ml/L, CT3: 100 ml/L, CT4: 150ml/L, CT5: 200 ml/L

Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 mẫu

Chỉ tiêu theo dõi: Khối lượng rễ tươi TB, Khối lượng rễ tăng, chất lượng rễ

Thí nghiệm 6: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến

khả năng tăng sinh khối củ cây Đảng sâm trên môi trường đặc

Giả sử chọn ra được môi trường tốt nhất ở thí nghiệm 1 và nội dung 2 làm môi

trường nền (B), kết hợp với các hàm lượng cao nấm men khác nhau

Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 mẫu Trong đó nồng độ cao nấm men thay đổi lần lượt với CT1: 0 g/L, CT2: 0,5 g/L, CT3: 1 g/L, CT4: 2 g/L

Chỉ tiêu theo dõi: Khối lượng rễ tươi TB, Khối lượng rễ tăng, chất lượng rễ

Thí nghiệm 7: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng pepton đến khả

năng tăng sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm trên môi trường đặc

Giả sử dụng chọn ra được môi trường tốt nhất ở thí nghiệm 1 và nội dung 2 là B làm môi trường nền, kết hợp với các hàm lượng peptone (g/L) khác nhau từ 0; 0,5; 1; 2

lần lượt là các công thức từ 1 đến 5

Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, gồm 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 mẫu

Chỉ tiêu theo dõi: Khối lượng rễ tươi TB, Khối lượng rễ tăng, chất lượng rễ

*Từ các thí nghiệm 5, thí nghiệm 6, thí nghiệm 7 tìm được chất hữu cơ ảnh hưởng đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm trên môi trường đặc và hàm lượng cho kết quả tốt nhất

Thí nghiệm 8: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường đến

khả năng tăng rễ bất định cây Đảng sâm

Giả sử chọn được môi trường tốt nhất ở các nội dung 1,2,3,4 làm môi trường nền

là C, kết hợp với các hàm lượng đường khác nhau

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 6 CT, mỗi CT nhắc lại 3 lần, mỗi lần 30 mẫu CT1: 0 g/L, CT2: 10 g/L, CT3: 20 g/L, CT4: 30 g/L, CT5:

40 g/L, CT6: 50 g/L

- Thời gian theo dõi: 40 ngày

- Chỉ tiêu đánh giá: chất lượng rễ, khối lượng rễ tăng

Thí nghiệm 9: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thể tích môi trường đến

khả năng nhân nhanh sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm trong môi trường lỏng

Giả sử chọn được môi trường tốt nhất ở tất cả các thí nghiệm trên làm thí nghiệm

9 nhưng trên môi trường lỏng ta không bổ sung agar là E Thí nghiệm được thực hiện nuôi lỏng trong bình 5000ml

Chọn những mẫu sống, không nhiễm để tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 2 CT, mỗi CT nhắc lại 3 lần, mỗi bình 20 mẫu Trong đó: CT1: 1000 ml, CT2: 2000 ml

- Thời gian theo dõi: 40 ngày

- Chỉ tiêu đánh giá: chất lượng rễ, khối lượng rễ tươi trung bình, khối lượng rễ tăng

Thí nghiệm 10: Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến khả

năng nhân nhanh sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm trong môi trường lỏng

Giả sử chọn được môi trường tốt nhất ở tất cả các thí nghiệm trên làm thí nghiệm

10 nhưng trên môi trường lỏng ta không bổ sung agar là E Thí nghiệm được thực hiện nuôi lỏng trong bình 5000ml

Chọn những mẫu sống, không nhiễm để tiến hành thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn với 2 CT: CT1: 1 ống sục khí, CT2: 2 ống sục khí, mỗi CT nhắc lại 3 lần, mỗi lần 2 bình, mỗi bình 20 mẫu

- Thời gian theo dõi: 40 ngày

- Chỉ tiêu đánh giá: chất lượng rễ, khối lượng rễ tươi trung bình, khối lượng rễ tăng

2.3 Chỉ tiêu theo dõi và đánh giá

Khối lượng mô sẹo:

Khối lượng mô sẹo TB (g) =

Khối lượng mô sẹo tăng = Khối lượng mô sẹo TB – Khối lượng mẫu ban đầu

Tổng khối lượng mô sẹo tạo ra Tổng số lần nhắc lại

Khối lượng rễ:

Khối lượng rễ tươi TB (g) =

Khối lượng rễ tăng (g) = Khối lượng rễ tươi TB – Khối lượng rễ ban đầu

Chất lượng rễ:

+ Rễ tốt : Rễ khỏe, mập, vàng + Rễ trung bình: Rễ khỏe, vàng + Rễ kém: Rễ yếu, nhỏ

- Thu thập và xử lý kết quả bằng phần mềm thống kê toán học Microsoft Excel

2010 và phần mềm IRRISTAT 4.0

Tổng khối lượng rễ tươi tạo ra Tổng số lần nhắc lại

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng phát triển hệ rễ bất định cây Đảng sâm

Môi trường là một trong những yếu tố quan trong nhất quyết định đến sự thành công cho sinh trưởng và phát triển hệ thực vật Khi tiến hành nuôi cấy mô tế bào đối với một số đói tượng nhất định, vấn đề đặt ra là chọn môi trường nào và trên cơ sở nào

để phối hợp tỷ lệ các chất dinh dưỡng Cách thường làm là qua các tài liệu đã xuất bản, các công trình đã nghiên cứu về đối tượng đó hoặc cùng họ tương đương xem các tác tác giả đã sử dụng môi trường loại nào Bước đầu có thể giữ nguyên môi trường của tác giả đó hoặc trên cơ sở đó mà cải tiến cho phù hợp qua các thí nghiệm thăm dò

Trong hằng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác nhau, nhiều mục đích nuôi cấy khác nhau Về cơ bản có thể chia ra làm 3 loại: Môi trường nghèo dinh dưỡng, môi trường có hàm lượng chất dinh dưỡng trung bình: B5 của Gamborg, môi trường giàu dinh dưỡng: Điển hình là môi trường MS (Murashige-Skoog)

Đảng sâm là một loài cây có một số đặc điểm khá tương đồng với sâm Ngọc Linh do vậy kế thừa các nghiên cứu về rễ bất định của Sâm Ngọc Linh tiến hành thử nghiệm trên 2 môi trường giàu dinh dưỡng MS và môi trường có hàm lượng dinh dưỡng trung bình là B5 Do đó môi trường sử dụng trong thí nghiệm là môi trường MS

và B5, đây cũng là những môi trường được sử dụng phổ biến để nuôi cấy rễ in vitro

nhiều đối tượng khác nhau như cây cà rốt [36], cây Nhân sâm [33], cây Nhàu [17],…

Kết hợp với mẫu sử dụng là lá cây Đảng sâm in vitro

Kết quả thí nghiệm thể hiện trong bảng 3.1

Môi trường MS cho Khối lượng rễ tươi TB cao nhất (3,29g), khối lượng rễ tăng 2,71 g cho chất lượng rễ tốt ½ B5 cho Khối lượng rễ tươi TB thấp nhất (2,14g), khối lượng rễ tăng 1,4 g chất lượng chồi kém (Hình 3.1) Các môi trường ½ MS (CT2), B5 (CT3) cho tỷ lệ lần lượt là 2,54g; 2,35g

Từ bảng kết quả trên ta thấy:

Ở chỉ tiêu khối lượng TB rễ tươi giá trị CV = 4,8% và LSD.05 = 0,25 thì công thức 1 sử dụng môi trường MS cho kết quả cao nhất có sự sai khác có ý nghĩa với các công thức còn lại ở mức độ tin cậy 95%

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát triển hệ rễ bất định cây

Đảng sâm sau 4 tuần nuôi cấy

Môi

trường

Số mẫu nuôi cấy

Khối lượng TB

rễ ban đầu (g)

Khối lượng

rễ tăng (g)

½ MS 30 0,66 2,54 1,88 Trung bình B5 30 0,65 2,35 1,7 Trung bình

½ B5 30 0,74 2,14 1,4 Kém

CV (%) LSD 05

4,8 0,25

Rễ tốt: khỏe, mập,vàng; Rễ trung bình: Rễ khỏe, vàng; Rễ kém: yếu, nhỏ

Hình 3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và phát

triển hệ rễ bất định Đảng sâm (sau 30 ngày)

Kết quả thu được sau khi nuôi cấy trên các môi trường khác nhau là ½ B5, B5,

½ MS, MS được thể hiện như sau: Khối lượng rễ tươi TB tăng dao động từ 2,14 g đến 3,29g, khối lượng rễ tăng sau 4 tuần nuôi cấy từ 1,4 g đến 2,71 g chất lượng rễ cũng cải thiện từ rễ kém lên tốt (Hình 3.1)

Kết quả thu được có thể giải thích như sau: Hai môi trường này ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng ở thực vật, mẫu sạch được đưa vào các môi trường nuôi cấy, sau đó theo dõi khả năng phát triển hệ rễ trong 4 tuần Các môi trường thí nghiệm đều chứa hầu hết các chất dinh dưỡng cần thiết, chủ yếu là các chất khoáng cho sự sinh trưởng của rễ, tuy nhiên, hàm lượng khoáng trong các môi trường là khác nhau Đồng thời, MS là một môi trường giàu dinh dưỡng, có thành phần dinh dưỡng cao, hoạt tính mạnh cung cấp chất dinh dưỡng cho thực vật, nhờ đó có tác dụng cung cấp chất dinh dưỡng cho rễ sinh trưởng và phát triển nên khi cho rễ bất định Đảng sâm nuôi trên môi trường giàu dinh dưỡng MS cho Khối lượng rễ tươi TB cao nhất với 3,29g , khối lượng rễ tăng 2,71 g chất lượng rễ tốt Môi trường nghèo dinh dưỡng và bị giảm đi một nửa (1/2 MS, B5, ½ B5) cho kết quả không tốt mà có xu hướng giảm, điều này có thể giải thích là đối với đối tượng này môi trường nghèo dinh dưỡng cung cấp ít chất dinh dưỡng hơn cho thực vật

Theo Bùi Đình Thạch (2016), trong môi trường MS, rễ tơ cây Bạch hoa xà tăng trưởng tốt hơn so với trong môi trường SH và B5 [30] Đồng thời kết quả nghiên cứu

cũng cho thấy phù hợp với kết luận trong nghiên cứu nuôi cấy in vitro rễ bất định cây

Tam thất vũ diệp của Bùi Đình Thạch và cs [40] Tuy nhiên, theo ghi nhận của Xu và

cs (2009) thì rễ tơ cây Angelica gigas phát triển tốt hơn trong môi trường SH so với

MS và B5 [53] Theo Ninh Thị Thảo và cs (2015), hàm lượng amonium trong môi trường MS cao hơn 12 lần so với hàm lượng ammonium trong môi trường B5 đã làm

giảm sự phát triển sinh khỗi rễ tơ cây Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) [35] Điều

này cho thấy thành phần môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của rễ nhưng còn phụ thuộc vào đặc điểm loài thực vật cá thể

Từ các kết quả thu được chúng tôi kết luận công thức 1 với môi trường MS cho kết quả tốt nhất

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo

mô sẹo và rễ bất định cây Đảng sâm

3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D lên sự tạo mô sẹo từ lá cây Đảng sâm

Từ kết quả nghiên cứu thí nghiệm 1 chúng tôi nhận thấy môi trường nền MS là tốt nhất cho sự hình thành rễ bất định cây Đảng sâm Chính vì vậy, chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D lên sự hình thành mô sẹo từ lá cây Đảng sâm trên nền môi trường MS có bổ sung 2,4 D ở các nồng độ từ 0,0 – 4,0 mg/l