ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG NGỌC HÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO RỄ BẤT ĐỊNH TỪ CÂY ĐẢNG SÂM NAM (CODONOPSIS JAVANICA (BLUME) HOOK F ,) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái N[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - - HOÀNG NGỌC HÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO RỄ BẤT ĐỊNH TỪ CÂY ĐẢNG SÂM NAM (CODONOPSIS JAVANICA (BLUME) HOOK.F.,) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên – 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - - HOÀNG NGỌC HÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO RỄ BẤT ĐỊNH TỪ CÂY ĐẢNG SÂM NAM (CODONOPSIS JAVANICA (BLUME) HOOK.F.,) Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS Vũ Thị Lan Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên Thái Nguyên - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tơi thực hướng dẫn TS.Vũ Thị Lan Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Thái Nguyên, tháng Tác giả Hoàng Ngọc Hà năm 2017 LỜI CẢM ƠN Lời xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thị Lan giảng viên Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học- Đại học Thái Nguyên tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt thời gian thực hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Khoa ho ̣c - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học thầ y cô giáo, cán Khoa, đặc biệt quan tâm, giúp đỡ các anh chi ̣ kỹ th ̣t viên phịng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo anh chi ̣ kỹ thuật viên phịng thí nghiệm ni cấy mơ tế bào thực vật, Viện nghiên cứu phát triển Lâm nghiệp, Trường đại học Đại học Nông Lâm Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình làm luận văn thạc sĩ Tơi xin cảm ơn gia đình bạn bè ln bên cạnh ủng hộ, khuyến khích, động viên tạo động lực để tơi hồn thành luận văn Trong q trình làm luận văn khơng tránh khỏi sai sót, tơi mong nhận đóng góp q báu từ phía thầy bạn bè Xin trân trọng cảm ơn! Thái Nguyên, tháng Tác giả Hoàng Ngọc Hà năm 2017 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Nội dung nghiên cứu TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Đảng Sâm 1.1.1 Phân loại khoa học 1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh thái Đảng Sâm 1.1.3 Giá trị dược liệu Đảng Sâm 1.1.4 Thành phần công dụng Đảng sâm 1.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy mơ tế bào thực vật 1.2.2 Điều kiện nuôi cấy 1.2.3 Môi trường dinh dưỡng 1.2.4 Sự phát sinh hình thái 12 1.3 Tình hình nghiên cứu nhân sinh khối rễ dược liệu phương pháp nuôi cấy mô giới Việt Nam 14 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 14 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 15 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Vật liệu nghiên cứu 18 2.1.1 Vật liệu thực vật 18 2.1.2 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm 18 2.1.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3 Chỉ tiêu theo dõi đánh giá 21 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường đến khả phát triển hệ rễ bất định Đảng sâm 23 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến khả tạo mô sẹo rễ bất định Đảng sâm 25 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng 2,4D lên tạo mô sẹo từ Đảng sâm 25 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng NAA đến khả cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo Đảng sâm 28 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng IBA đến khả cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo Đảng sâm 29 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng số chất hữu tự nhiên, đường đến tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm 32 3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nước dừa đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm 32 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm 34 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ peptone đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm 36 3.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng đường đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm 38 3.4 Nghiên cứu tăng trưởng rễ bất định nuôi cấy mơi trường lỏng (bình bioreactor) 40 3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng thể tích môi trường đến khả nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm bình bioreactor sục khí liên tục 40 3.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng tốc độ sục khí đến khả nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm môi trường lỏng 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 Kết luận 43 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT 2,4 D : 2,4 – Dichlophenoxy acetic acid B5 : Gamborg’s Cs : Cs CT : Công thức ĐC : Đối chứng IBA : Indole butyric acid MS : Murashige & Skoog (1962) NAA : - Naphlene axetic acid TB : Trung bình KL : Khối lượng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.2 Các nguyên tố đa lượng dạng sử dụng .9 Bảng 2.1 Danh mục thiết bị sử dụng đề tài 18 Bảng 3.1 Ảnh hưởng môi trường đến khả phát triển hệ rễ bất định Đảng sâm sau tuần nuôi cấy 24 Bảng 3.2 Ảnh hưởng 2,4 D đến hình thành mơ sẹo từ mẫu Đảng sâm 26 Bảng 3.3 Ảnh hưởng hàm lượng NAA đến hình thành rễ bất định in vitro Đảng sâm sau 40 ngày 28 Bảng 3.4 Ảnh hưởng hàm lượng IBA đến hình thành rễ bất định in vitro Đảng sâm sau 40 ngày 29 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nước dừa đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm .32 Bảng 3.6 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm môi trường đặc sau 40 ngày 34 Bảng 3.7 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ peptone đến khả sinh trưởng phát triển rễ bất định Đảng sâm môi trường đặc sau 40 ngày 36 Bảng 3.8 Ảnh hưởng hàm lượng đường đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm sau 40 ngày 39 Bảng 3.9 Ảnh hưởng thể tích mơi trường đến khả nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm bình bioreactor sục khí liên tục 40 Bảng 3.10 Kết nghiên cứu ảnh hưởng tốc độ sục khí đến khả nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm môi trường lỏng 41 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Đảng Sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,) Hình 3.1: Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy đến khả sinh trưởng phát triển hệ rễ bất định Đảng sâm 24 Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ 2,4D đến hình thành mơ sẹo .27 Hình 3.3 Ảnh hưởng hàm lượng NAA đến khả cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo Đảng sâm 29 Hình 3.4 Ảnh hưởng hàm lượng IBA đến khả cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo Đảng sâm 30 Hình 3.5: Ảnh hưởng hàm lượng nước dừa đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm môi trưởng đặc sau 40 ngày 33 Hình 3.6: Ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm môi trường đặc sau 40 ngày 35 Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng độ peptone đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm môi trường đặc sau 40 ngày 37 Hình 3.8 Ảnh hưởng số chất hữu tự nhiên đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm 38 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Trong nguồn tài nguyên lâm sản gỗ phong phú Việt Nam, thuốc mọc tự nhiên giữ vị trí quan trọng số lượng loài, giá trị sử dụng kinh tế cao Theo kết điều tra nghiên cứu ngành Y tế, biết Việt Nam có tới gần 4000 lồi thực vật Nấm có cơng dụng làm thuốc Trong có tới 90% mọc tự nhiên tập trung chủ yếu quần xã rừng [19] Từ nguồn thuốc mọc tự nhiên, hàng năm khai thác khối lượng lớn loại dược liệu, sử dụng cho nhu cầu làm thuốc nước xuất [3] Tuy nhiên, khai thác liên tục nhiều năm, với nhiều nguyên nhân tác động khác làm cho nguồn thuốc mọc tự nhiên Việt Nam bị giảm sút nghiêm trọng; số lồi thuộc diện q lâm vào tình trạng có nguy bị tuyệt chủng cao Bởi vậy, vấn đề bảo tồn thuốc bị đe dọa coi nhóm đối tượng ưu tiên, chiến lược bảo tồn phát triển bền vững nguồn tài nguyên lâm sản sỗ Việt Nam [9] Đảng Sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,) lồi dược liệu có giá trị kinh tế cao, loại thuốc quý có tác dụng bồi bổ sức khỏe, nâng cao thể lực, tăng khả miễn dịch cho thể, có tác dụng ích huyết, sinh tân dịch, chống mệt mỏi, giảm stress, dùng làm thuốc bổ trường hợp tỳ vị suy yếu, thiếu máu ốm dậy; chữa đau dày, ho, viêm thận, nước tiểu có albumin rễ củ có chứa nhiều saponins, triterpenes, steroid Ngồi non làm rau ăn [8] Ở Việt Nam, Đảng sâm phân bố tương đối rộng rãi nhiều tỉnh miền núi, có giá trị sử dụng kinh tế cao, thuốc bị khai thác liên tục nhiều năm, chí cịn xuất khơng thức qua biên giới Hơn nữa, nạn phá rừng, mở rộng nương rẫy, làm cho Đảng sâm mọc tự nhiên tất tỉnh trở nên rõ rệt Đảng sâm đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (1996) Danh lục Đỏ thuốc Việt Nam (1996, 2001, 2006) Đồng thời có tên Nghị định số 32/2006/NĐ CP Chính phủ (30/3/1006) nhằm tăng cường quản lý bảo vệ [6] Việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật làm tăng hệ số nhân giống thực vật thời gian ngắn, đồng thời việc nuôi cấy tế bào, mô quan thực vật giúp nhà nghiên cứu thu nhận sinh khối hay hợp chất thứ cấp có giá trị y dược với hiệu suất cao sản xuất từ tế bào vi sinh vật tổng hợp đường hoá học [4] 2 Đối với Đảng sâm, nguồn cung cấp dược liệu chủ yếu thu hái tự nhiên nuôi trồng truyền thống Tuy nhiên, việc nuôi trồng lại phụ thuộc nhiều vào điều kiện sinh thái trồng trọt Do Đảng sâm có thời gian thu hoạch phải từ 2-3 năm Hơn nữa, việc phòng trừ loại dịch bệnh, tồn dư thuốc bảo vệ thực vật vấn đề khó khăn [2] Với ưu điểm nâng cao hàm lượng, chủ động trình sản xuất, tối ưu hóa q trình chiết xuất hợp chất mục tiêu, việc nhân nuôi sinh khối dược liệu phương pháp công nghệ sinh học để thu hợp chất thứ cấp biện pháp triển vọng để khắc phục hạn chế phương pháp nuôi trồng truyền thống Phương pháp tạo lượng sinh khối rễ bất định lớn thời gian ngắn nhằm phục vụ nhu cầu dược liệu người, rút ngắn thời gian sản xuất, cho hiệu kinh tế vô lớn đồng thời góp phần đáp ứng nguồn nguyên liệu dùng chế biến sản phẩm sử dụng lĩnh vực y dược [4] Trên đối tượng Đảng sâm, nghiên cứu tập trung vào đánh giá tác dụng dược lý, phân tích thành phần hóa học hay nhân giống in vitro [11] Xuất phát từ thực tiễn này, thực đề tài: “Nghiên cứu khả tạo rễ bất định từ Đảng Sâm nam (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,)” Mục tiêu nghiên cứu Xác định môi trường phù hợp để tạo rễ bất định Đảng Sâm in vitro nhân sinh khối rễ bất định Đảng Sâm bình bioreactor Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu ảnh hưởng môi trường đến khả phát triển hệ rễ bất định Đảng sâm - Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến khả tạo mô sẹo rễ bất định - Nghiên cứu ảnh hưởng số hợp chất hữu tự nhiên, đường đến tăng trưởng sinh khối rễ bất định Đảng sâm - Nghiên cứu tăng trưởng rễ bất định nuôi cấy môi trường lỏng (bình bioreactor) CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Đảng Sâm 1.1.1 Phân loại khoa học Đảng sâm có tên khoa học Codonopsis javanica (Blume) Hook f et Thoms hay cịn có tên gọi khác Sâm leo, Sâm nam, Cây đùi gà, Ngân đằng; Mằn cáy (Tày); Co nhả đòi (Thái); Cang hô (H' Mông) Thường mọc ven rừng, nương rẫy bỏ hoang lâu ngày độ cao 700m trở lên tỉnh phía Bắc độ cao 1300m tỉnh phía Nam Là loại ưa ẩm, ưa sáng, ưa bóng, mọc nơi đất tốt, nhiều mùn [6],[8] Đảng Sâm mọc rải rác tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam, phân bố chủ yếu tỉnh Hà Giang (Vị Xuyên, Đồng Văn, Mèo Vạc, Quản Bạ, Yên Minh ) Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát, Mường Khương, Văn Bàn); Lai Châu (Sìn Hồ, Phong Thổ, Mường Tè, Than Uyên) Yên Bái (Mù Căng Chải, Văn Chấn); Cao Bằng; Lạng Sơn; Hịa Bình; Sơn La; Nghệ An (Kỳ Sơn); Hải Dương (Chí Linh) , tỉnh phía nam trở nên dần, thấy tập trung xung quanh núi Ngọc Linh (Quảng Nam, Kon Tum); vùng Đà Lạt núi LangBiang (Lâm Đồng) Ngồi giới cịn xuất Trung Quốc, Lào, Ấn Độ, Myanma Nhật Bản [16] Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái, phân bố địa lý số lượng nhiễm sắc thể, Đảng Sâm phân loại sau: [6],[29] Tên Việt Nam: Đảng sâm nam Tên khoa học: Codonopsis javanica (Blume) Hook.f., Họ: Hoa chuông (Campanulaceae) Bộ: Hoa chuông (Campanulales) Lớp (nhóm): Hai mầm (Magnoliopsida) Ngành: Hạt kín (Magnoliophyta) Giới: Thực vật (Plantae) 1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh thái Đảng Sâm Theo Sách đỏ Việt Nam [6] Từ điển thuốc Việt Nam [8] đặc điểm sinh lý, sinh thái Đảng sâm sau: Dây leo nhỏ, sống nhiều năm, leo thân quấn Có rễ bất định (củ) hình trụ, màu ngà vàng, phân nhánh, nạc Thân leo dài 1m, màu xanh hay phớt tím hồng, có lơng nhỏ non sau nhẩn Lá mọc đối, mọc so le, có cuống; phiến hình tim, dài - 8cm, rộng - 4cm, gốc chia thùy tròn, đầu nhọn, mép lượn sóng có cưa tù; mặt xanh, mặt màu xám bạc; có lông nhỏ lúc non Hoa mọc riêng lẻ kẽ lá, có cuống dài - 3cm; đài thn hẹp màu xanh phớt tía; tràng hình chng, màu trắng, có gân màu tía, đầu xẻ thành thùy, họng màu tím đen; nhị, nhị dẹt, bao phấn đính gốc Bầu có ơ; núm nhụy ngắn, tồn Quả nang, gần hình cầu, đường kính - 1,6cm; vết tràng hoa cịn lại thành gờ nơng; chín màu tím đen Hạt nhiều, màu vàng nâu Tồn có nhựa mủ màu trắng Mùa hoa quả: từ tháng – tháng 12 Cây ưa ẩm, ưa sáng chịu bóng; thường mọc lẫn với cỏ thấp ven rừng, đất sau nương rẫy hốc đá rừng núi đá vôi Độ cao từ 600m (Bắc Sơn - Lạng Sơn) đến 1.600m (Hà Giang, Lào Cai) Đảng sâm sinh trưởng mạnh mùa mưa ẩm Sau già, phần mặt đất thường tàn lụi mọc lại (từ đầu củ) vào mùa xuân năm sau Song nhỏ (chưa hoa năm đầu tiên) khơng có tượng lụi mùa đông Cây tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt Do có củ nằm sâu mặt đất, đảng sâm tồn qua đợt cháy rừng hay đốt nương làm rẫy Hình 1.1: Đảng Sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,) (Nguồn: https://botanyvn.com/cay-dang-sam-nam) 1.1.3 Giá trị dược liệu Đảng Sâm Cây Đảng Sâm có tác dụng sử dụng tương tự Nhân Sâm đời sống nhân dân Việt Nam coi "nhân sâm người nghèo" [12] Thành phần quan trọng Đảng Sâm phận rễ củ Rễ đảng sâm thu hoạch vào năm thứ hay đời phơi khô trước đem bán Rễ Đảng Sâm có chứa chất saponin, đường khử, acid amin, chất béo, terpen, hợp chất glycosid, vitamin, nguyên tố khoáng, alkaloid [11] Hợp chất ưu tiên quan tâm rễ Đảng Sâm saponin Nó có nhiều tác dụng to lớn Đối với hệ quan thể có tác dụng chống mệt mỏi, tăng cường thích nghi thể với mơi trường nhiệt độ cao Đối với hệ tiêu hóa, có tác dụng tăng cường trương lực hối tràng Đối với tim mạch có tác dụng làm tăng cường độ co bóp tim, tăng lượng máu cho não, chân nội tạng Đối với máu hệ thống máu giúp làm tăng lượng hồng cầu, huyết sắc tố, làm giảm số lượng bạch cầu, làm tăng nhanh máu đơng khơ mà khơng có tác dụng tán huyết Ngồi cịn có tác dụng hạ huyết áp, tăng cường miễn dịch thể, có tác dụng kháng viêm, giảm ho, kháng khuẩn,…[ 23] 1.1.4 Thành phần công dụng Đảng sâm Thành phần hóa học: Lá Ðảng sâm non chứa nước 77,5%, protid 4,2%, glucid 13,1%, xơ 3,3%, caroten 3,6mg%, vitamin C 85,5mg% Sơ thấy rễ có đường, chất béo; khơng có saponin thành phần cịn có anthraglucosid, iridoid glucoside, sterol, chất vô K, Na, Mg, Fe, Cu, Zn…, tinh bột, đường, acid hữu cơ, tinh dầu, vitamin C [11] Theo Y dược học Trung Hoa [1] Dược điển Việt Nam [7] Đảng sâm có nhiều cơng dụng có nhiều thuốc áp dụng dân gian sau: Công dụng dược lý Đảng sâm: + Tác dụng tăng sức: Thực nghiệm cho thấy Đảng sâm có tác dụng chống mỏi mệt tăng thích nghi động vật mơi trường nhiệt độ cao Thực nghiệm động vật chứng minh Đảng sâm có tác dụng mặt hưng phấn ức chế vỏ não Thí nghiệm cho thấy dịch chiết xuất thô Đảng sâm có tác dụng làm tăng thích nghi chuột nhắt trạng thái thiếu dưỡng khí (do thiếu dưỡng khí tổ chức tế bào, suy tuần hồn làm tăng tiêu hao dưỡng khí…) thuốc có tác dụng với mức độ khác [7] 6 + Đối với máu hệ thống tạo máu [7]: * Nước sắc Đảng sâm có tác dụng làm tăng số lượng hồng cầu, huyết sắc tố Dịch tiêm Đảng sâm tăng nhanh máu đơng mà khơng có tác dụng tán huyết * Tiêm mạch máu dung dịch Đảng sâm 20% (4ml/1kg thể trọng) cho uống (mỗi ngày 20g) thấy hồng cầu tăng lên, bạch cầu giảm xuống + Đối với huyết áp: Tiêm mạch máu dung dịch Đảng sâm 20% (chiết xuất nước rượu) cho thỏ chó gây mê thấy hạ huyết áp Tác giả có tiêm dung dịch 4,8% glucose đối chứng dung dịch đảng sâm không chứa glucose khơng thấy hạ huyết áp, tác giả cho tượng hạ huyết áp không liên quan đến thành phần đường Đảng sâm Tác giả cho tượng hạ huyết áp gĩan mạch ngoại vi Đảng sâm cịn có tác dụng ức chế tượng cao huyết áp Adrenalin gây ra: lượng Adrenalin tiêm cao tượng ức chế kém, lượng Adrenalin tiêm thấp tượng ức chế mạnh [7] + Tăng khả miễn dịch thể: dùng chế phẩm Đảng sâm tiêm bụng, tiêm bắp tiêm tĩnh mạch chuột nhắt có tác dụng làm tăng số lượng thực bào rõ rệt, thể tích tế bào tăng giả túc nhiều hơn, khả thực bào cüng tăng Các thành phần tế bào DNA, RNA, enzym, acid tăng lên rõ rệt [7] + Kháng viêm, hóa đàm, khái (giảm ho) + Kháng khuẩn: Trên thực nghiệm ‘In Vitro’ thấy Đảng sâm có tác dụng kháng khuẩn mức độ khác loại vi khuẩn sau: Não mô cầu khuẩn, Trực khuẩn bạch hầu, Trực khuẩn Phó trực khuẩn đại tràng, Tụ cầu khuẩn vàng, Trực khuẩn lao người [7] + Ngoài ra, Đảng sâm cịn có tác dụng làm hưng phấn tử cung cô lập chuột cống, phát triển nội mạc tử cung kiểu Progesteron mức độ nhẹ, gây tăng trương lực cổ tử cung, tiết sữa động vật mẹ cho bú, nâng cao corticosterone huyết tương, nâng cao đường huyết [7] Một số thuốc từ Đảng sâm [1]: + Thanh Phế kim, bổ nguyên khí, khai âm, tráng gân cơ: Đảng sâm 640g, Sa sâm 320g, Quế viên nhục 160g Nấu thành cao, uống + Trị thần kinh suy nhược: Đảng sâm 12g, Mạch môn 12g, Ngũ vị tử 8g Sắc uống + Trị trẻ nhỏ miệng bị lở loét: Đảng sâm 40g, Hoàng bá 20g Tán bột, bôi 7 + Trị huyết áp thấp: Đảng sâm 16g, Hoàng tinh 12g, Nhục quế 10g, Cam thảo 6g, Đại táo 10 quả, sắc uống ngày thang 15 ngày liệu trình, dùng 1-2 liệu trình + Trị huyết áp cao người bị bệnh tim: Đảng sâm 10g, Vỏ trai (loại cho ngọc) 16g, Sinh địa 10g, Đương quy 10g, Trắc bá tử (hạt) 16g, Táo 16g, Phục linh 16g, Mộc hương 6g, Hoàng liên 6g Sắc với 800ml nước, chia làm lần uống liên tục – 2,5 tháng + Trị Phế quản viêm mạn (thể khí hư huyết ứ): Đảng sâm, Ngũ linh chi, Thương truật, Sinh khương, thứ 10g, sắc uống Đã trị 32 trường hợp, năm uống thuốc từ tháng 11 đến tháng năm sau, lần 20-30ml (những lúc sốt,cảm, không uống), uống liên tục 1-2 tháng, có kết quả: 93,75% kết tốt 53,13%, khơng có phản ứng phụ + Trị thần kinh suy nhược: dùng dung dịch tiêm ‘Phức Phương Đảng Sâm’ (mỗi ml có 1g Đảng sâm, 50mg vitamin B1) tiêm bắp ngày lần 2ml, liệu trình 15 ngày, có kết định + Trị tử cung xuất huyết năng: dùng độc vị Đảng sâm, ngày 30-60g, sắc, chia làm lần uống, liên tục ngày thời kì kinh nguyệt + Trị hư lao, ho, thể suy nhược: Đảng sâm 16g, Hoài sơn 12g, dĩ nhân 6g, Cam thảo 2g, Khoản đông hoa 6g, Xa tiền tử 6g Sắc, chia làm lần uống + Trị Thận suy, hay đau lưng, mỏi gối, đái lắt nhắt, bồi dưỡng thể: Đảng sâm 16g, Cáp giới 6g, Huyết giác 1,2g, Trần bì 0,8g, Tiểu hồi 6g Ngâm với xị (250ml) rượu uống trước ngủ + Trị thể mỏi mệt, ăn không ngon, đại tiện lỏng: sắc 20 – 40g Đảng sâm uống, kết hợp vị thuốc khác như: Bạch truật (sao), Đương quy, Ba kích thứ 12g, sắc uống tán bột viên với mật, ngày uống 12-20g + Trị người già suy yếu lâu ngày, người làm việc nhiều hao sức lao động cüng trí óc: Đảng sâm 40g, Ngưu tất, Mạch mơn, Đương quy, Long nhãn trí óc, mệt tim, ê ẩm: Đảng sâm 40g, Ngưu tất, Mạch môn, Đương quy, Long nhãn 8g + Trị trung khí suy nhược, vị bất hòa: nấu Đảng sâm với đường cát thành cao lỏng Đảng sâm, uống + Trị khí huyết suy: Đảng sâm, Chích hồng, Bạch truật, Long nhãn, Đường cát, nấu thành cao uống 1.2 Một số yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy mơ tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật tổng hợp kỹ thuật sử dụng để trì ni cấy tế bào, mơ quan thực vật điều kiện vô trùng môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng với thành phần xác định [5] Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa sở tính tồn phân hóa, phản phân hóa tế bào Sự phân hóa tế bào chuyển tế bào phôi sinh thành tế bào mơ chun hóa, đảm bảo chức khác Q trình phân hóa tế bào biểu thị: phân hóa tế bào tế bào phơi sinh tế bào dãn tế bào chun hóa phản phân hóa tế bào 1.2.1 Vật liệu ni cấy Vật liệu nuôi cấy nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực vật Vật liệu dùng cho ni cấy mơ-tế bào thực vật hầu hết quan hay phận (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá,…), cấu trúc phôi (lá mầm, trụ mầm…), quan dự trữ (củ, thân rễ…) [5],[26] Tuy mang lượng thông tin di truyền cấu trúc mô khác phát sinh hình thái khác q trình ni cấy, việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải vào trạng thái sinh lý tuổi mẫu, chất lượng lấy mẫu, kích thước vị trí lấy mẫu, mục đích khả ni cấy [26] 1.2.2 Điều kiện nuôi cấy - Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, thao tác với mẫu cấy tiến hành buồng cấy vô trùng - Ánh sáng nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường đặt phòng ổn định ánh sáng nhiệt độ 1.2.3 Môi trường dinh dưỡng Môi trường dinh dưỡng điều kiện cần thiết cho mẫu nuôi cấy sinh trưởng phát sinh hình thái, định đến thành cơng q trình ni cấy [10] Thành phần nồng độ chất môi trường dinh dưỡng đa dạng tùy thuộc loại mẫu mục đích ni cấy gồm thành phần sau: - Nguồn cacbon Mô tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng chúng sống bán dị dưỡng điều kiện ánh sánh nhân tạo lục lạp có khả quang hợp Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu điều kiện bắt buộc Nguồn cacbon thông dụng saccharose, ngồi sử dụng glucose, maltose [5] - Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng Nguyên tố đa lượng: Quan trọng nguyên tố N, P, K, Mg, Ca, Na, S [5] Bảng 1.2 Các nguyên tố đa lượng dạng sử dụng Nguyên tố Dạng sử dụng Thường sử dụng dạng NO3- NH4+ , hầu hết loại thực Nitơ vật sử dụng nguồn nitơ để đồng hóa tổng hợp nên sản phẩm hữu Phospho Nhu cầu phospho mô tế bào ni cấy cao, P có tác dụng hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường Kali Thường dùng dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O Canxi Sử dụng chủ yếu CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O Magie Sử dụng chủ yếu MgSO4 Lưu huỳnh Chủ yếu SO4- Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni… nguyên tố vi lượng bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường có vai trị quan trọng q trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào mô, tế bào nuôi cấy [5] - Vitamin Hầu hết tế bào ni cấy có khả tổng hợp vitamin không đủ lượng nên cần bổ sung, nhóm vitamin B [5] Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung cần thiết cho mơi trường ni cấy, có vai trị trao đổi hydratcacbon sinh tổng hợp amino acid Vitamin B6 (Pyridocine): Là coenzyme quan trọng nhiều phản ứng trao đổi chất Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme chuỗi hơ hấp Myo-inositol: Có vai trị sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham gia vận chuyển đường, nguyên tố khoáng, trao đổi hydratcacbon - Các chất hữu tự nhiên 10 Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng inositol, amino acid, đường, chất thuộc nhóm cytokinin, chất có hoạt tính auxin… Dịch thủy phân casein: Chứa nhiều amino acid Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng cao vitamin nhóm B Nước ép loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuối xanh… - Các thành phần khác Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần agar gồm có số chất hữu acid hữu cơ, acid béo; số nguyên tố vơ Cu, Fe, Zn… Ngồi tác dụng tạo gel cho môi trường agar cung cấp số chất dinh dưỡng cho tế bào, mô nuôi cấy Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, hợp chất thứ cấp gây ức chế sinh trưởng mẫu ni cấy Ngồi ra, sử dụng số chất chống oxy hóa khác polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascobic - pH môi trường Độ pH môi trường ảnh hưởng đến khả tiếp nhận chất dinh dưỡng mẫu từ môi trường nuôi cấy Đa số pH môi trường điều chỉnh khoảng từ 5,5-6,0 Trong q trình ni cấy, pH mơi trường giảm mẫu ni cấy sản sinh acid hữu - Các chất điều hòa sinh trưởng Theo Nguyễn Như Khanh tài liệu chất điều hòa sinh trưởng thực vật [20] : chất điều hòa sinh trưởng thành phần thiếu môi trường nuôi cấy, có vai trị quan trọng q trình phát sinh hình thái thực vật Hiệu chất điều hịa sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng yếu tố nội sinh mẫu cấy Dựa vào hoạt tính sinh lý phân chất điều hịa sinh trưởng thành nhóm: Nhóm chất kích thích sinh trường nhóm chất ức chế sinh trưởng Trong ni cấy mơ, tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng nhóm thường sử dụng [10] Nhóm Auxin: Được phát lần Charles Darwin trai Francis Darwin thử nghiệm tính hướng sáng yến mạch Sau đó, nhiều nhà khoa học nghiên cứu dần mở rộng hiểu biết nhóm chất Auxin thể thực vật tập trung nhiều chồi, non, hạt nảy mầm, phấn hoa Auxin có nhiều tác động tới hiệu ứng sinh trưởng phát triển thể thực vật Cụ thể 11 sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động thực vật, tiêu biểu tính hướng sáng hướng đất Auxin gây tượng ưu đỉnh (sự sinh trưởng chồi đỉnh ức chế chồi nách) Auxin khởi động việc hình thành rễ bên rễ phụ auxin kích thích phân chia tế bào trụ bì, nơi rễ sinh trưởng xun qua vỏ biểu bì Ngồi ra, auxin cịn có tác động đến việc hình thành chồi hoa, phát triển làm chậm rụng Các auxin thường sử dụng NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân tạo), IAA (auxin tự nhiên) Hoạt tính chất xếp theo thứ tự từ yếu đến mạnh sau: IAA, IBA, NAA 2,4D IAA nhạy cảm với nhiệt độ dễ phân hủy q trình hấp khử trùng khơng ổn định môi trường nuôi cấy mô NAA 2,4D khơng bị biến tính nhiệt độ cao Tuy nhiên chất 2,4D chất dễ gây độc có tác dụng nhạy đến phân chia tế bào hình thành callus Nhóm Cytokinin: Được phát từ năm 50 kỷ XX, chất Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích Tiếp đó, đến zeatin tách từ nội nhũ hạt ngô non Đã phát cytokinin vi sinh vật, tảo, tảo silic, rêu, dương xỉ, kim Zeatin có nhiều thực vật bậc cao số vi khuẩn Trong thực vật, cytokinin có nhiều hạt, lớn, mơ phân sinh Cytokinin kích thích ức chế nhiều trình sinh lý, trao đổi chất Cùng với auxin, cytokinin điều khiển phát sinh hình thái ni cấy mơ Tỷ lệ auxin/cytokinin cao kích thích tạo rễ, ngược lại hình thành chồi Cytokinin cảm ứng hình thành chồi bên ức chế ưu đỉnh Quá trình sinh trưởng dãn dài tế bào chịu ảnh hưởng cytokinin Ngoài ra, cytokinin cịn làm chậm già hóa Trong chất thuộc nhóm cytokinin kinetin BAP sử dụng phổ biến hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp auxin với tỷ lệ thích hợp có khả kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền với nhiệt), ngồi sử dụng TDZ, Diphenylurea… Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần từ dịch tiết nấm nhà khoa học Nhật Bản vào năm 1935-1938 Gibberellin tổng hợp mô đỉnh, tồn hạt non phát triển Gibberellin có tác dụng việc hoạt hóa phân bào mơ phân sinh lóng, kéo dài lóng Nó kích thích kéo dài tế bào, tăng kích thước chồi ni cấy GA3 loại gibberellin sử dụng nhiều ... bất định từ Đảng Sâm nam (Codonopsis javanica (Blume) Hook. f. ,)? ?? Mục tiêu nghiên cứu Xác định môi trường phù hợp để tạo rễ bất định Đảng Sâm in vitro nhân sinh khối rễ bất định Đảng Sâm bình... HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - - HOÀNG NGỌC HÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO RỄ BẤT ĐỊNH TỪ CÂY ĐẢNG SÂM NAM (CODONOPSIS JAVANICA (BLUME) HOOK. F. ,) Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học. .. tạo mô sẹo từ Đảng sâm 25 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng NAA đến khả cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo Đảng sâm 28 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng IBA đến khả cảm ứng tạo