ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THU HƢỜNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HOÀNG THẢO PHI ĐIỆP TÍM (DENDROBIUM ASOMUM LINDL ) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN 2016 Đ[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THU HƢỜNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HOÀNG THẢO PHI ĐIỆP TÍM (DENDROBIUM ASOMUM LINDL.) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THU HƢỜNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HOÀNG THẢO PHI ĐIỆP TÍM (DENDROBIUM ASOMUM LINDL.) Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Hải Yến THÁI NGUYÊN - 2016 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thực hướng dẫn TS Nguyễn Thị Hải Yến Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa có cơng bố cơng trình khác Thái Nguyên, tháng 11 năm 2016 Tác giả luận văn Nguyễn Thu Hƣờng ii LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Hải Yến, Giảng viên Khoa Khoa học Sự sống, Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên, người trực tiếp hướng dẫn tận tình chu đáo tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận văn Đồng thời, xin cảm ơn thầy, cô giáo cán kỹ thuật viên Phịng thí nghiệm Sinh học Khoa Khoa học Sự sống tạo điều kiện thời gian sở vật chất cho tơi suốt q trình học tập làm luận văn thạc sĩ Cuối xin cảm ơn gia đình, bạn bè tất thầy ln ln động viên, khuyến khích giúp đỡ tơi tiến trình tơi học tập làm luận văn Trong q trình làm luận văn khơng tránh khỏi sai sót, tơi mong nhận đóng góp q báu từ phía thầy bạn bè để tơi có kết tốt Thái Nguyên, tháng 11 năm 2016 Tác giả luận văn Nguyễn Thu Hƣờng iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung phong lan 1.1.1 Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) 1.1.2 Lan Hồng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) 1.1.3 Các phương pháp nhân giống lan 1.2 Sơ lược nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 1.2.1 Các hướng nghiên cứu ứng dụng ưu kĩ thuật nuôi cấy mô - tế bào 10 1.2.2 Các phương thức nuôi cấy mô tế bào nhân giống vơ tính 11 1.2.3 Các giai đoạn nhân giống in vitro 12 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy mơ 13 1.3 Một số nghiên cứu nhân giống in vitro lan Dendrobium 14 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 15 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 16 Chƣơng 2: 18 2.1 Vật liệu 18 18 2.1.2 Dụng cụ hóa chất 18 iv 2.1.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 19 2.2.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 20 2.2.3 Chuẩn bị số thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy 21 2.2.4 Chuẩn bị giá thể 21 2.2.5 Điều kiện nuôi cấy in vitro 21 2.2.6 Bố trí thí nghiệm 21 2.2.7 Các tiêu theo dõi 24 2.2.8 Xử lý số liệu 24 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Kết khử trùng mẫu đưa vào nuôi cấy 25 3.1.1 Kết khử trùng mẫu hạt phong lan 25 3.2 Kết tái sinh chồi 26 3.2.1 Kết tái sinh chồi từ hạt lan Hồng thảo phi điệp tím 26 3.2.2 Kết nhân chồi từ protocorm lan Hồng thảo phi điệp tím 28 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng số kích thích sinh trưởng nhóm Cytokinin đến nhân nhanh cụm chồi lan Hồng thảo phi điệp tím 29 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng khoai tây chuối xanh đến nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium Anosmum Lindl.) 33 3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng α - NAA đến khả rễ Hồng thảo phi điệp tím 35 3.6 Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng đến sinh trưởng phát triển lan sau chai trồng bầu 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 Kết luận 40 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đủ ABA Abscisic acid ADN Acid deoxyribonucleic APG III Angiosperm Phylogeny Group III B1 Thiamine B2 Riboflavin BAP - Benzyl adenin purine ĐC Đối chứng EAC Ehrlich ascites cells GA3 Gibberellic acid IAA Indol - - acetic acid IBA Indol - - butyric acid Kinetin - furfurryl - aminopurin KTST Kích thích sinh trưởng MS Murashige and Skoog PM Phytamax RE Robert Ernst THT Than hoạt tính VW Vacin Went USA United States of America 2,4 - D α - NAA 2,4 - Dichlorophenoxy acetic acid α - Naphthalene acetic acid CT Công thức TG Thời gian KT Khử trùng vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết khử trùng hạt lan Hồng thảo phi điệp tím HgCl2 0,1% 25 Bảng 3.2 Kết protocorm phát sinh từ hạt Hồng thảo phi điệp tím 27 Bảng 3.3 Kết nhân chồi từ protocorm loài lan Hồng thảo phi điệp tím sau 50 ngày cấy chuyển 29 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhóm Cytokinin đến nhân nhanh chồi lan Hồng thảo phi điệp tím 30 Bảng 3.5 Ảnh hưởng hàm lượng chuối xanh khoai tây nghiền đến nhân nhanh cụm chồi lan Hoàng thảo phi điệp tím sau 30 ngày 34 Bảng 3.6 Ảnh hưởng α - NAA đến khả tạo rễ lan Hồng thảo phi điệp tím 36 Bảng 3.7 Ảnh hưởng chế phẩm dinh dưỡng đến sinh trưởng phát triển 38 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hoa phong lan Hoàng thảo phi điệp tím Hình 2.1 Quả lồi lan Hồng thảo phi điệp tím 20 Hình 3.1 Hạt Hồng thảo phi điệp tím nảy mầm mơi trường MS chứa 2,0 mg/l BAP sau 30 ngày nuôi cấy 26 Hình 3.2 Protocorm lan Hồng thảo phi điệp tím tạo thành từ hạt mơi trường MS chứa 2,0 mg/l BAP 27 Hình 3.3 Chồi phát sinh từ protocorm mơi trường MS chứa 1,5 mg/l BAP 29 Hình 3.4 Ảnh hưởng BAP kinetin tới nhân nhanh cụm chồi lan Hồng thảo phi điệp tím sau 60 ngày 33 Hình 3.5 Ảnh hưởng chuối xanh khoai tây lên nhân nhanh cụm chồi lan Hồng thảo phi điệp tím sau 60 ngày 35 Hình 3.6 Ảnh hưởng α - NAA đến khả tạo rễ lan sau 30 ngày 37 Hình 3.7 So sánh ảnh hưởng từ chế độ tưới ½ MS tới sinh trưởng phát triển lan so với đối chứng sau 60 ngày 38 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Ngày nay, hoa cảnh đóng vai trị quan trọng đời sống tinh thần mà ảnh hưởng sâu sắc đến tâm hồn người làm đẹp cho cảnh quan môi trường Do đó, quan tâm phát triển hoa cảnh vấn đề cần thiết Hoa lan loại hoa ưa chuộng hình dáng, màu sắc, kích thước phong phú, đa dạng nên chúng trồng, sản xuất phổ biến trở thành mặt hàng có giá trị kinh doanh, xuất giới Các nước có ngành ni trồng hoa lan phát triển, hàng năm kim ngạch xuất lên đến hàng trăm triệu USD [15] Việt Nam quốc gia thuộc vùng khí hậu nhiệt đới thích hợp cho phát triển loài phong lan Theo Phong lan Việt Nam Trần Hợp nước ta có 137 - 140 chi với 1000 lồi phong lan, lồi lan đẹp riêng Lan rừng không rực rỡ màu sắc giống lan ngoại nhập lại đẹp tự nhiên phần lớn có hương thơm người chơi lan ưa chuộng Thế giới lan rừng phong phú với nhiều chủng loại, chi phổ biến chi Hoàng thảo (Dendrobium) Hiện nay, Dendrobium trồng nhiều có giá trị kinh tế cao bên cạnh giá trị thẩm mỹ mà Dendrobium đem lại Dendrobium cịn tách chiết để phục vụ cho số ngành công nghiệp mỹ phẩm, y học Với giá trị hoa lan Dendrobium hứa hẹn mang lại nguồn doanh thu to lớn cho ngành sản xuất, kinh doanh mặt hàng Trên thị trường nay, phong lan chủ yếu cung cấp dạng giống khai thác từ rừng, cịn hạt lan khó nảy mầm điều kiện tự nhiên số lượng mọc không nhiều Ngày nay, với công nghệ nhân giống in vitro, người ta tạo từ vài nghìn đến hàng triệu ổn định mặt di truyền từ lan, từ góp phần bảo tồn phát triển nguồn gen loài lan Việt Nam Nhờ ứng dụng nhân giống in vitro vào chi Dendrobium làm cho trở thành loài hoa cắt cành hiệu 2 Từ lý trên, tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.)” nhằm mục đích góp phần bảo tồn nhân nhanh giống lan rừng phương pháp in vitro Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống lồi lan rừng Dendrobium anosmum Lindl (Hồng thảo phi điệp tím) nhằm bảo tồn nguồn gene quý nhân giống lan rừng Việt Nam kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đưa mẫu lan Hoàng thảo phi điệp tím vào ni cấy in vitro - Nghiên cứu ảnh hưởng số chất kích thích sinh trưởng thực vật lên trình tái sinh chồi từ phơi hạt lồi lan Hồng thảo phi điệp tím - Nghiên cứu ảnh hưởng số chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin lên q trình nhân nhanh lan Hồng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) - Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng khoai tây chuối xanh đến nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium Anosmum Lindl.) - Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin lên q trình hình thành rễ lan Hồng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) - Tìm hiểu tác dụng số chế phẩm lên sinh trưởng phát triển lan Hồng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) sau trồng bầu Đề tài thực phịng thí nghiệm sinh học thuộc Khoa Khoa học Sự sống, trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên 3 Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung phong lan Họ Lan, hay họ Phong lan (Orchidaceae) họ thực vật có hoa, thuộc ngành thực vật hạt kín, lớp mầm (Monocotylendons), phân lớp hành (Liliidae), họ Lan (Orchidaceae) Họ phong lan biết khoảng 850 chi (APG III, 2009) có 25000 lồi chiếm khoảng 10% lồi thực vật có hoa (Dressler, 1993) [12] Bên cạnh cịn có 30000 lồi lan lai Ngày nay, dựa vào đặc tính di truyền nhà khoa học chia họ lan thành họ phụ: Apostasioideae, Cypridioideae, Neottioideae, Orchidioideae, Epidendroideae, Vandoideae Họ Lan họ thực vật lớn phân bố gần toàn giới (ngoại trừ châu Nam Cực) Danh sách liệt kê gần phân bố họ [18] Nhiệt đới châu Mỹ: 250 - 270 chi Nhiệt đới châu Á: 260 - 300 chi Nhiệt đới châu Phi: 230 - 270 chi Châu Đại Dương: 50 - 70 chi Châu Âu ôn đới châu Á: 40 - 60 chi Bắc Mỹ: 20 - 25 chi Ở Việt Nam có 137-140 chi gồm 1000 loài lan rừng, bao gồm địa lan, thạch lan phong lan, phân bố rộng khắp nước, hầu hết có hoa đẹp nên trồng làm cảnh [3] Dựa theo đặc điểm thân cây, phong lan chia làm hai nhóm nhóm đơn thân (monopodial) nhóm đa thân (sympodial) Nhóm đơn thân: mầm từ đỉnh mọc thêm hàng năm kéo theo thân phát triển dài đạt kích thước tối đa đến vài mét Ví dụ chi lan Vanda, Vanilla Nhóm đa thân thân mầm phát triển đến kích thước định, sau ngừng phát triển có thân mầm khác phát triển thay Thân mầm phát triển từ thân gốc gọi “mắt” Các mắt phát triển đến kích thước phát triển thêm rễ tạo nên thân Thân phát triển theo cách tạo nên tập hợp phân nhánh thân mọc từ gốc ban đầu gọi đa thân, ví dụ chi lan Cattleya, Dendrobium…[4], [17] Dựa theo khả thích nghi với điều kiện mơi trường họ lan chia thành nhóm chính: Phong lan (Epiphyte): Là loài sống ký gửi nhờ vào thân cao ẩm mục rừng núi cao, rễ bám vào to, thân rủ xuống Địa lan (Terrestrial): Là lồi có thân giả dạng củ, rễ chùm sống nhờ đất sườn núi, bờ suối hay tán rừng ẩm ướt Địa lan có nhiều lồi với hình dáng, màu sắc phong phú đẹp mắt Hoại lan (Saprophyte): Gồm loại mọc rêu gỗ mục Thạch lan (Lithophyte): Gồm số loại mọc đá 1.1.1 Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) 1.1.1.1 Phân loại chi lan Hoàng thảo Chi lan Hoàng thảo (Dendrobium) chi lan lớn thứ họ hoa lan đứng sau lan lọng Lan Hoàng thảo phong phú đa dạng với 1600 loài, phân bố vùng Châu Úc, Châu Á tập trung nhiều Đơng Nam Á Lan Hồng thảo đa dạng cấu tạo sinh học, hình thái phong phú dạng cây, dạng hoa Vì nhà khoa học chia thành 40 nhóm nhỏ để tiện cho việc nghiên cứu trồng trọt Trong tiêu biểu nhóm: Nhóm thứ có đặc điểm xanh quanh năm, hoa thường mọc gần có nhiều màu sắc sặc sỡ như: Dendrobium bigibbum, Dendrobium phalaenopsis…[17] Nhóm thứ hai có đặc điểm giả hành buông thõng xuống, mang nhiều xanh hai bên, hoa mọc thành chùm hoa như: Dendrobium anosmum, Dendrobium aphyllum… Nhóm thứ ba có đặc điểm hoa mọc đỉnh, bng thõng xuống có mùi thơm như: Dendrobium farmeri, Dendrobium chrysotoxum… Nhóm thứ tư có đặc điểm chùm hoa mọc thẳng đứng, màu xanh màu vàng như: Dendrobium atroviolaceum, Dendrobium spetabile… Nhóm thứ năm có đặc điểm giả hành mọc thẳng đứng có lớp lơng bao phủ như: Dendrobium draconis, Dendrobium formosum…[17] Bên cạnh đó, vào đặc điểm sinh trưởng dạng thân, lan Dendrobium chia thành nhóm chính: Nhóm thân mềm: Có đặc điểm giả hành buông lõng rủ xuống, thường thấy vùng khí hậu lạnh, gồm giống lấy vùng cao nguyên Việt Nam, Miến Điện…, độ cao 1000 m Nhóm thân cứng: Mọc thẳng đứng thường vùng nóng (Malaysia, Indonexia…) Ngồi cịn nhóm Dendrobium trung gian sống vùng nóng lạnh như: Dendrobium primulimun, Dendrobium farmeri… [17] 1.1.1.2 Các điều kiện để nuôi trồng lan Dendrobium Ánh sáng: Lan cần nhiều ánh sáng gần để ngồi trời cần phải có lưới che phịng non bị cháy nắng Khi thấy quặt quẹo, dấu hiệu thiếu nắng, thiếu nắng khó hoa Nhiệt độ: Lan cần nuôi nhiệt độ từ - 25°C nhiên lan chịu nóng tới 38°C chịu lạnh tới 3,3°C Ngồi vào mùa đơng lạnh 15,6°C vịng - tuần lan khó nụ Độ ẩm thống gió: Lan mọc mạnh độ ẩm từ 60 - 70% Nếu độ ẩm thấp non không lớn bị teo Cây không mọc mạnh khơng thống gió thời kỳ lan nụ khơng thống gió nụ Giá thể: Với số lồi lan trồng khơng cần dùng đến giá thể sinh trưởng tốt, mơi trường sống có giá thể tốt Giá thể lan gồm thứ dễ kiếm, có sẵn tự nhiên Những chất liệu vùng giống chúng chọn tùy theo điều kiện ngoại cảnh, nhân lực, loài lan quy mô sản xuất Những loại giá thể thường sử dụng vỏ thông, vỏ dừa, rêu Tưới nước: Vào mùa hè lan mầm non mọc mạnh, tưới - lần tuần Vào mùa thu, ngừng tăng trưởng nên tưới nước thưa đi, tuần cần tưới lần cho thân khỏi bị teo lại Vào mùa đông, thời gian lan chuẩn bị để hoa, ngưng hẳn việc tưới nước Nếu độ ẩm thấp nên phun sương tháng - lần [19] 1.1.1.3 Sâu bệnh vấn đề khác Vì lan Dendrobium cần bón nhiều loại phân hữu khác môi trường giá thể mục nát sau thời gian trồng nên tạo điều kiện cho nhiều loài sâu bệnh gây hại, số bệnh thường gặp cách điều trị: Bệnh đen thân lan: Do nấm Fusarium gây nên, cách phòng trị tách bị bệnh để riêng dùng thuốc phòng trừ hay nhúng vào thuốc trị nấm Với lớn cắt bỏ phần thối phun thuốc diệt nấm Carboxin 1/2000; Zineb 3/2000; Benlat 1/2000 [18] Bệnh đốm lá: Do nấm Cercospora gây nên, bệnh thường phát sinh mạnh lan Dendrobium, gây hại mùa mưa vườn lan có độ ẩm cao, phòng trừ thuốc diệt nấm Carboxin 1/2000; Zineb 3/2000; Benlat 1/2000 [18] Bệnh thán thư: Do nấm Collectotrichicum gây Bệnh phát triển mạnh vào mùa mưa nên phải phòng trừ trước, thường cắt bỏ vàng phun thuốc diệt nấm - ngày/lần [18] Bệnh thối mềm vi khuẩn: Do vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây Vết bệnh có hình dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thường lan rộng theo chiều rộng Gặp thời tiết ẩm ướt mô bệnh bị thối úng, thời tiết khô hanh mô bệnh khô tóp có màu trắng xám [18] Để phịng trừ bệnh nấm, trước hết cần bảo đảm cho đủ dinh dưỡng tỷ lệ N:P:K cân đối Dư N thiếu K thường làm cho mềm, dễ nhiễm bệnh Ánh sáng phải đầy đủ để giữ độ cứng cho Lá bị gãy dư N, thiếu K hay thiếu ánh sáng Không tưới dư nước dễ làm cho rễ úng thối Phun thuốc phòng ngừa thường xuyên tháng - lần Nếu thấy bệnh xuất cần phun nhiều (2 - lần/tuần) triệu chứng bệnh giảm trở lại phun theo cách phịng ngừa [18] Sâu hại lan: Rệp vảy thường bám thân giả hành non, phòng trị cách dùng bàn chải chà xát phun dung dịch thuốc Malathion 50 pha loãng; Bọ trĩ gây hại chủ yếu mùa nắng, dùng Malathion mg/bình lít nước, phun 1lần / tuần, phun liên tiếp liên tục tuần [19] 1.1.2 Lan Hồng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) 1.1.2.1 Phân loại Có nhiều cách phân loại cho Hồng thảo phi điệp tím, theo hệ thống APG III lan phân loại sau: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Thực vật hạt kín (Angiospermae) Lớp: Một mầm (Monocotylendons) Bộ: Măng tây (Asparagales) Họ: Phong lan (Orchidaceae) Phân họ: Lan biểu sinh (Epidendroideae) Chi: Hoàng thảo (Dendrobium) Lồi: Phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) Tên khoa học lan Hồng thảo phi điệp tím nhiều nhà khoa học công nhận Dendrobium anosmum Lindl.[3] 1.1.2.2 Đặc điểm sinh học - Rễ Hoàng thảo phi điệp tím thuộc loại rễ bì sinh, xung quanh rễ thật bao bọc lớp mô xốp giúp dễ dàng hút nước, muối khoáng ngăn chặn ánh sáng mặt trời gay gắt Chóp rễ có màu xanh cây, phần rễ có sắc lạp khơng bị ngăn mơ xốp nên giúp quang hợp - Thân Hoàng thảo phi điệp tím thuộc nhóm lan thân có giả hành Giả hành chứa diệp lục, dự trữ nước chất dinh dưỡng cần thiết cho phát triển giả hành Cấu tạo giả hành gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngồi có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ để tránh nước mặt trời hun nóng Củ giả hành có màu xanh bóng nên với làm nhiệm vụ quang hợp [4] - Lá quan dinh dưỡng hoa lan, xưởng chế tạo chất dinh dưỡng quang hợp Xếp thành hai dãy đối thân (lá đối), có hình xoang, gân chạy song song khe lõm xuống, rụng tạo thành giả hành - Hoa mọc giả hành mà mọc giả hành cũ Trên cánh có phủ lơng mịn có ánh kim, lưỡi thường có hai mặt tím đậm, hương thơm ngào ngạt Bên hoa có cột nhị nhụy nằm hoa mang phần đực phía phần phía trước mặt Nhị gồm hai phần bao phấn hốc phấn Bao phấn nằm cột nhị nhụy cịn hốc phấn lõm lại mang khối phấn thường song song với bao phấn Khối phấn gồm toàn hạt phấn dính lại với nhau, cứng - Quả Hồng thảo phi điệp tím thuộc loại nang nở theo - đường nứt dọc, chín nở ra, mảnh vỏ cịn dính lại với phía đỉnh phía gốc Bên chứa nhiều hạt, chín hạt có màu vàng Hạt cấu tạo phơi chưa phân hóa, máng lưới nhỏ, xốp chứa đầy khơng khí Hạt nhiều nhỏ, toàn hạt nặng phần mười mg, nhẹ nên dễ phát tán nhờ gió [4], [5] 1.1.2.3 Phân bố Hồng thảo phi điệp tím có nguồn gốc rộng lớn khắp châu Á, từ miền Nam Nhật Bản đến chân đồi phía Himalaya, bán đảo Đơng Dương, Malaysia, Indonexia… Ở Việt Nam, loài phân bố khắp núi rừng từ Bắc tới Nam: Đô Lương, Đà Lạt, Đắk Lắc, Hịa Bình… [16] Hình 1.1 Hoa phong lan Hồng thảo phi điệp tím 1.1.3 Các phương pháp nhân giống lan 1.1.3.1 Các phương pháp nhân giống truyền thống Nhân giống vơ tính Tách bụi: Phương pháp dùng để tách chậu lan đầy, đồng thời làm tăng số lượng Các giả hành già tách hoa tàn tách trồng từ - năm Giả hành già ươm lại giá thể ẩm để tạo chồi con, chồi nuôi với giả hành lúc tạo rễ mới, đủ sức phát triển tách lần thứ hai, từ giả hành cho đợt - [5] Chiết cành: Ở Dendrobium thường tạo giả hành cách tự nhiên Khi phát triển mạnh, có rễ tốt tách khỏi giả hành để trồng Phương pháp chiết tách đảm bảo tính chất di truyền bố mẹ lại cho hệ sinh trưởng không đồng nên khó cung cấp số lượng lớn để phục vụ cho nuôi trồng với quy mơ lớn 10 Nhân giống hữu tính: Trong thiên nhiên thụ phấn lan côn trùng thực cấu trúc hoa lan hoàn toàn để thích nghi cho thụ phấn Có phương pháp thụ phấn: Sự tự thụ phấn: Khi phấn hoa hoa rơi núm nhụy hoa Điều xảy tự nhiên hoa lan cấu trúc phận sinh dục đực hoa lan Sự thụ phấn chéo: Khi phấn hoa hoa rơi vào núm nhụy hoa hác hay loài khác loài, khác giống Nếu thụ phấn có kết ngày hay sang ngày hôm sau, phiến hoa co lại không rụng để tránh thụ phấn khác côn trùng người ta dùng bao nilon trùm lại khơng buộc kín miệng hầm làm hư trái Sau thụ phấn, bầu noãn từ từ trương, phình to thành trái, trái chứa hàng ngàn đến triệu hạt Khi trái từ màu xanh lục chuyển sang màu vàng lục nên hái trái Trong thiên nhiên muốn hạt lan nảy mầm hạt lan phải nhiễm số loại nấm cộng sinh Người ta khám phá số loài nấm giúp hạt lan nảy mầm, loài giúp nảy mầm số giống lan như: Rhizoctonia repens giúp nảy mầm Cattleya, Cypripedium, Dendrobium; Rhizoctonia mucoroudes giúp nảy mầm Vanda, Phalaenopsis; Rhizoctonia lanugiosa giúp cho hạt nảy mầm Oncidium [3] Nhân giống in vitro Ngày với công nghệ nhân giống in vitro, từ lan tạo từ vài nghìn đến hàng triệu ổn định mặt di truyền, đồng thời có chất lượng tốt đáp ứng nhu cầu ngày cao thị trường 1.2 Sơ lƣợc nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.1 Các hướng nghiên cứu ứng dụng ưu kĩ thuật nuôi cấy mô - tế bào Nhân giống in vitro ứng dụng cơng nghệ tế bào thực vật, sử dụng môi trường nhân tạo để nhân đỉnh sinh trưởng mô phân sinh cây[1] 11 Mục đích kĩ thuật nhân nhanh giống là: (1) Duy trì nhân nhanh kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác chọn giống; (2) Duy trì nhân nhanh cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống trồng khác nhau; (3) Nhân nhanh với điều kiện vô trùng cách ly tái nhiễm kết hợp với việc làm bệnh cho cây; (4) Rút ngắn thời gian đưa lai lồi tự nhiên có đặc điểm tốt vào sản xuất nhân nhanh bố mẹ cặp lai sản xuất; (5) Bảo quản tốt tập đồn giống vơ tính lồi giao phấn ngân hàng gen [1] Vì vậy, nuôi cấy mô - tế bào mang lại hiệu to lớn nhờ có ưu thế, là: (1) Hệ số nhân giống cao rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất Trong phần lớn trường hợp công nghệ nuôi cấy mô tế bào đảm bảo tốc độ nhân nhanh, từ vịng - năm tạo thành hàng triệu cây; (2) Nhân số lượng lớn diện tích nhỏ; (3) Làm bệnh trồng cách ly chúng với nguồn bệnh; (4) Thuận tiện việc vận chuyển bảo quản; (5) Sản xuất quanh năm, quy trình sản xuất vận hành thời gian ngày, mùa năm 1.2.2 Các phương thức nuôi cấy mơ tế bào nhân giống vơ tính Ni cấy mô phân sinh đỉnh sinh trưởng: Ở lan có phát triển lúc đỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocrom sau tiếp tục phân chia cho protocrom hay chồi tạo thành hoàn chỉnh Tái sinh hoàn chỉnh từ phận khác cây: Ngồi mơ phân sinh đỉnh sinh trưởng phận dễ nuôi cấy thành cơng, phận cịn lại thể thực vật ứng dụng cho ni cấy mô - tế bào đoạn thân, cuống lá, phận hoa, nhánh củ Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo: Trong khuôn khổ mục đích nhân giống vơ tính, tái sinh hồn chỉnh trực tiếp từ mẫu cấy ban đầu khơng nhanh chóng thu mà đồng mặt di truyền ... cytokinin lên q trình nhân nhanh lan Hồng thảo phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl. ) - Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng khoai tây chuối xanh đến nhân nhanh lan Hoàng thảo phi điệp tím (Dendrobium. .. anosmum Lindl. ) Tên khoa học lan Hồng thảo phi điệp tím nhiều nhà khoa học công nhận Dendrobium anosmum Lindl. [3] 1.1.2.2 Đặc điểm sinh học - Rễ Hoàng thảo phi điệp tím thuộc loại rễ bì sinh, xung...ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THU HƢỜNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN HOÀNG THẢO PHI ĐIỆP TÍM (DENDROBIUM ASOMUM LINDL. ) Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học Mã số: