ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM THÙY DUNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY HƯƠNG THẢO (Rosmarinus officinalis L ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thá[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM THÙY DUNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY HƯƠNG THẢO (Rosmarinus officinalis L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên, tháng 12 - 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM THÙY DUNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY HƯƠNG THẢO (Rosmarinus officinalis L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MƠ THỰC VẬT Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên, tháng 12 - 2016 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn GS.TS Chu Hồng Mậu Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố Tác giả Phạm Thùy Dung ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hồng Mậu tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ chị Trần Thị Hồng - Kỹ thuật viên Phịng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Trong thời gian thực luận văn thạc sĩ Trung tâm Thực nghiệm thực hành chuyển giao khoa học công nghệ - Đại học Tân Trào, nhận giúp đỡ Ban lãnh đạo Trung tâm, kỹ thuật viên phịng Ni cấy mơ giúp đỡ tạo điều kiện để thực thí nghiệm luận văn thạc sĩ Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm khoa, thầy cô giáo, cán khoa Khoa học sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên giúp đỡ trình học tập hồn thành khoa học Tác giả Phạm Thùy Dung iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CỤM TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Hương thảo 1.1.1 Đặc điểm phân loại sinh học Hương thảo 1.1.2 Thành phần hóa học có hoạt tính dược học Hương thảo 1.1.3 Đặc điểm sinh thái, trồng trọt Hương thảo 1.1.4 Tình hình sử dụng Hương thảo Việt Nam 1.2 Ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật nhân giống in vitro 1.2.1 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.2 Điều kiện môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 1.2.3 Các công đoạn nuôi mô tế bào 10 1.3 Nghiên cứu nhân giống in vitro dược liệu Hương thảo 11 1.3.1 Tình hình nhân giống dược liệu phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nước 12 iv 1.3.2 Nghiên cứu nhân giống in vitro Hương thảo phương pháp nuôi cấy mô thực vật 14 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu 15 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 15 2.1.2 Hoá chất, thiết bị 15 2.1.3 Điạ điể m và thời gian nghiên cứu 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Phương pháp khử trùng mẫu 16 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro 16 2.2.3 Đưa môi trường tự nhiên 19 2.2.4 Điều kiện thí nghiệm 20 2.2.5 Phương pháp xử lí tính tốn số liệu 21 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Kết khử trùng hạt tạo mẫu 22 3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ chất kích thích sinh trưởng đến hiệu phát sinh chồi sinh trưởng chồi Hương thảo ống nghiệm 24 3.2.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên Hương thảo 24 3.2.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến phát sinh sinh trưởng chồi từ nách mầm Hương thảo 27 3.2.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp BAP IBA đến phát sinh sinh trưởng chồi tái sinh từ mắt chồi bên Hương thảo 29 3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ chồi Hương thảo in vitro 32 v 3.4 Kết nghiên cứu ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng in vitro vườn ươm 34 3.5 Quy trình nhân giống in vitro Hương thảo 36 3.5.1 Quy trình nhân giống in vitro Hương thảo từ đoạn thân mang mắt chồi bên 38 3.5.2 Quy trình nhân giống in vitro Hương thảo từ nách mầm 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 Kết luận 40 Đề nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CỤM TỪ VIẾT TẮT BA: 6-Benzyladenine BAP: 6-Benzylaminopurine Cs: Cộng CT: Công thức DNA: Deoxyribonucleic acid ĐC: Đối chứng IAA: Indole-3-acetic acid IBA: Indole-3-butyric acid Kinetin: 6-furfurylaminopurine MS: Murashige Skoog, 1962 NAA: Naphthalene acetic acid 2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid PLBs: Protocorm like bodies (thể tiền củ) SH: Schenk Hildebrandt, 1972 vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết khử trùng hạt Hương thảo khí clo sau 20 ngày 22 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BAP đến sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên Hương thảo 25 Bảng 3.3 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh sinh trưởng chồi từ nách mầm Hương thảo .28 Bảng 3.4 Ảnh hưởng kết hợp BAP IBA đến phát sinh sinh trưởng chồi tái sinh từ mắt chồi bên Hương thảo 30 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ chồi Hương thảo sau tuần 32 Bảng 3.6 Ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng phát triển in vitro vườn ươm sau 60 ngày 34 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây Hương thảo ngồi tự nhiên Hình 2.1 Hạt Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) có nguồn gốc từ Nga 15 Hình 3.1 Kết khử trùng hạt Hương thảo khí clo 23 Hình 3.2 Ảnh hưởng thời gian khử trùng khí clo đến khả nảy mầm hạt Hương thảo 24 Hình 3.3: Ảnh hưởng BAP đến sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên Hương thảo sau tuần 26 Hình 3.4 Ảnh hưởng BAP 1,5 mg/l đến phát sinh sinh trưởng chồi từ nách mầm Hương thảo 29 Hình 3.5 Ảnh hưởng hàm lượng BAP kết hợp với IBA đến phát sinh sinh trưởng chồi tái sinh từ mắt chồi bên Hương thảo sau tuần 31 Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ NAA đến khả rễ chồi Hương thảo 33 Hình 3.7 Cây Hương thảo in vitro trồng giá thể khác sau 60 ngày36 Hình 3.8: Sơ đồ Quy trình nhân giống in vitro Hương thảo từ đoạn thân từ nách mầm 37 Hình 3.9 Hình ảnh quy trình nhân giống in vitro Hương Thảo 39 từ đoạn thân mang mắt chồi bên 39 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây Hương thảo có tên khoa học Rosmarinus officinalis L., lồi thực vật có hoa thuô ̣c họ Hoa môi Hương thảo địa vùng Địa Trung Hải, trồng nhiều Nam Âu, Tây Á Bắc Phi Tại Việt Nam nhập trồng số tỉnh miền Trung miền Nam [26] Hương thảo sử dụng để làm gia vị, đuổi muỗi, trị liệu xoa bóp, sản xuất mỹ phẩm dược phẩm Các hợp chất Hương thảo bổ sung vào kem dưỡng da, xà phòng thơm…[25] Hương thảo tỏa mùi hương nồng ngào ngạt, tươi hay khô thơm Lá Hương thảo sử dụng chủ yếu Lá tươi hay khô dùng làm gia vị ẩm thực chiết xuất tinh dầu, ứng dụng y tế, mỹ phẩm Hương thảo có vị chát, nóng, mùi thơm nồng, giúp loại bỏ căng thẳng, tăng cường trí nhớ, giúp tinh thần sảng khối [26] Tinh dầu Hương thảo hỗ trợ việc tuần hoàn máu, giúp máu lưu thông tốt hơn, giúp cải thiện trí nhớ, giúp tinh thầ n thư giañ , giảm stress Mặc dù tinh dầu Hương thảo có nhiều công dụng tốt, nước ta chưa cung cấp đủ nguyên liệu nên phải nhập hoàn toàn từ nước [25] Các thành phần quan trọng Hương thảo axit caffeic dẫn xuất axit rosmarinic axit carnosic Những hợp chất có tác dụng kháng nấm kháng khuẩn, làm trẻ hóa da cách cải thiện lưu thông máu, chống viêm kích ứng da hữu ích điều trị mụn trứng cá, viêm da, eczema bệnh da khác…[23],[25] Hiện nay, Hương thảo nhập trồng Việt Nam, sinh trưởng phát triển tốt, thích hợp với điều kiện khí hậu nhiệt đới, thường nhân giống cách gieo hạt giâm cành [25] Tuy nhiên trồng hạt tỉ lệ nảy mầm thấp, hạt giống phải nhập khẩ u nên giá thành cao Nhân giống giâm cành cho hệ số nhân thấp, tỉ lệ thành công không cao Xuất phát từ giá trị to lớn Hương thảo thực trạng nhu cầu giống Hương thảo nước ta, việc ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm tạo số lượng lớn giống bệnh, đáp ứng nhu cầu phát triển sản xuấ t ở nước ta cần thiết, chúng xây dựng đề tài luâ ̣n văn tha ̣c si ̃ là: “Nghiên cứu nhân giống Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) phương pháp nuôi cấy mô thực vật” Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng đươ ̣c quy trình tái sinh in vitro Hương thảo kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu điề u kiêṇ khử trùng hạt để ta ̣o mẫu ống nghiệm; 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP kết hợp BAP IBA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên và từ nách lá mầm; 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng NAA đến khả rễ chồi in vitro; 3.4 Nghiên cứu giá thể thích hơ ̣p đưa môi trường tự nhiên 3.5 Đề xuất quy trình nhân giống in vitro Hương thảo Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu xác định mơi trường thích hợp cho nhân giống Hương thảo phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, đánh giá ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng, thành phần môi trường nuôi cấy thời gian khử trùng mẫu cấy, đánh giá tác động giá thể đến sinh trưởng giai đoạn vườn ươm, sở bổ sung thêm liệu cho việc nghiên cứu loại dược liệu khác 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Tạo có chất lượng cao, đồng bệnh không phụ thuộc vào mùa vụ, sở cung cấp nguồn giống theo nhu cầu thực tiễn Quy trình nhân giống in vitro Hương thảo sử dụng cho phịng thí nghiệm cơng nghệ tế bào để nhân giống phục vụ phát triển Hương thảo đáp ứng nhu cầu thực tiễn 4 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây Hương thảo 1.1.1 Đặc điểm phân loại sinh học Hương thảo Cây Hương thảo cịn có tên gọi khác Mê điệt, tên tiếng Anh Rosemary Cây Hương thảo thuộc chi Rosmarinus, họ Hoa môi (Lamiaceae), Hoa môi (Lamiales), lớp Hai mầm (Magnoliopsida), ngành Hạt kín (Magnoliophyta), giới thực vật (Plantae) [26] Hương thảo da ̣ng bụi nhỏ, thẳng cứng, cao từ 80 đến 150 cm, hoa có mùi thơm Thân thẳng đứng có nhiều nhánh dài Hương thảo có đơn, mọc đối, dày, có mép gập xuống, khơng cuống, mặt có màu xanh đậm bóng, mặt có màu trắng có lơng tơ Những bơng hoa mọc từ nách Hoa hình mơi, có màu xanh dương dài cm, đài hoa hình chng, có lơng mịn, tràng hoa mơi, mơi chẻ sâu môi số hoa lan Mùa hoa từ tháng đến tháng Quả Hương thảo giống hầu hết thuộc họ Lamiaceae, chùm gồm khơ hợp lại, màu nâu Tồn có mùi thơm Bộ phận sử dụng có hoa [26] 1.1.2 Thành phần hóa học có hoạt tính dược học Hương thảo Cây Hương thảo có chứa số hoạt chất sinh học bao gồm chất chống oxy hóa axit carnosic axit rosmarinic Các hợp chất hoạt tính sinh học khác bao gồm long não (lên đến 20% Hương thảo khô), axit caffeic, axit ursolic, axit betulinic, rosmaridiphenol, rosmanol [25],[26],[23] Axit rosmarinic este axit caffeic axit 3,4- dihydroxyphenyllactic xác định rộng rãi loài thực vật khác Axit rosmarinic hợp chất có chất polyphenol có khả kháng khuẩn, chống viêm, kháng virus, chống oxy hóa, chống dị ứng, viêm khớp, hen suyễn…và số nghiên cứu bước đầu cho thấy có tác dụng điều trị bệnh Alzheimer Trong công nghiệp thực phẩm, axit rosmarinic thành phần có vai trị ngăn ngừa hỗ trợ chữa dị ứng, viêm loét dày, chất bảo quản tự nhiên, chất chống oxi hóa kéo dài thời gian bảo quản hải sản tươi sống, số sản phẩm lên men, gia vị cần thiết nhiều ăn [12], [23] Hoạt động chống oxy hóa axit rosmarinic mạnh so với vitamin E Hình 1.1 Cây Hương thảo tự nhiên Axit carnosic chất chống oxy hóa tự nhiên, sử dụng rộng rãi thực phẩm, y sinh học ngành công nghiệp, ngành công nghiệp mỹ phẩm Là phụ gia thực phẩm, chất tạo màu tự nhiên tạo màu xanh Lipton S A Cs thuộc Viện Nghiên cứu Y học Sanford-Burnham cho axit carnosic - thành phần có Hương thảo - axit carnosic có ứng dụng lâm sàng cho bệnh ảnh hưởng đến võng mạc, bao gồm thối hóa điểm vàng liên quan đến tuổi, bệnh mắt Axit carnosic bảo vệ võng mạc khỏi thối hóa tổn thương ánh sáng gây nuôi cấy tế bào mơ hình động vật gặm nhấm Trong vài năm, nhóm Lipton phát axit carnosic chống tổn thương gốc tự não Lipton đồng nghiệp thử nghiệm axit carnosic mô hình động vật bị tổn thương thụ thể cảm nhận ánh sáng - phần mắt chuyển ánh sáng thành tín hiệu điện tử, cho phép nhìn vật Nghiên cứu cho thấy loài gặm nhấm điều trị trước axit carnosic lưu giữ lớp võng mạc mắt dày hơn, chứng tỏ thụ thể cảm nhận ánh sáng bảo vệ [28] Axit ursolic triterpenoid pentacyclic, có loại trái rau khác Nhiều nghiên cứu gần cho thấy axit ursolic có tác động chống ung thư, tác dụng chống viêm, cảm ứng apoptosis số tế bào ung thư người Đặc biệt, axit ursolic ức chế phát triển ung thư vú cách gây di động G1/G2 bắt giữ điều chỉnh biểu protein quan trọng đường truyền tín hiệu [20] Hương thảo sử dụng theo thuốc dân gian nước ta [29] Bài thuốc số 1: Dùng 200g Hương thảo khô ngâm với lít rượu trắng 40 độ, bảo quản chai thủy tinh khử trùng, cất nơi khô tránh ánh nắng Ngày uống lần, lần 2ml rượu thuốc pha với nước sôi để nguội, giúp tăng cường sức khỏe, chữa căng thẳng thần kinh, tiêu hóa Bài thuốc số 2: Dùng 2-3 Hương thảo khô hãm tách nước sôi làm liều Ngày uống 4-5 liều Hoặc dùng 20g khô (30g tươi) hãm với 500ml nước sôi, chia 4-5 lần để uống ngày Xoa nhẹ nước hãm thuốc lên da đầu để tăng cường mọc tóc, dùng để rửa vết thương nhiễm trùng lâu khô, rửa mắt 3-4 ngày lần ngày bị viêm giác mạc nhẹ Bài thuốc số 3: Tinh dầu Hương thảo pha vào nước tắm 3-4 giọt giúp tinh thần sảng khoái, thư giãn thể, giảm stress 1.1.3 Đặc điểm sinh thái, trồng trọt Hương thảo Cây Hương thảo phát triển tốt Địa Trung Hải hay nơi có khí hậu tương tự Hương thảo chịu hạn tốt, thích hợp với đất mùn bở ẩm, khơng thích hợp với đất sét Cây Hương thảo cần thoát nước tốt, nên trồng mơi trường khơng có sương giá có ánh nắng mặt trời chiếu 6-8 để phát triển tốt Nếu trồng hạt nên trồng vào mùa xuân Các hạt giống bắt đầu nảy mầm khoảng 14-21 ngày sau trồng Đối với nhân giống giâm hom, chọn nhánh khỏe mạnh mẹ, cắt hom dài 5-10cm, tỉa sát gốc Có số lồi sâu bệnh ảnh hưởng đến Hương thảo Nó dễ bị bệnh phấn trắng Cây dễ mắc bệnh trồng môi trường có khơng khí ẩm Nhện, ruồi trắng số lồi trùng sử dụng Hương thảo làm thức ăn [27] 1.1.4 Tình hình sử dụng Hương thảo Việt Nam Hương thảo du nhập Việt Nam thời gian ngắn nhận quan tâm nhiều người Đặc biệt người yêu thiên nhiên, thích khám phá Do Hương thảo có mùi thơm nên người ngửi qua mùi hương khó quên được, cần chạm nhẹ tay vào cảm nhận mùi hương Cây ưu chuộng tìm mua nhiều, người ta mua làm cảnh, trang trí nhà, giúp xua đuổi muỗi Gần đây, Hương thảo trở thành gia vị mẻ người nội trợ Nó khơng bị hương thơm nấu nướng Trong nấu ăn, Hương thảo thường sử dụng tươi, sấy khơ, có vị đắng nhẹ quyến rũ, mùi Hương thảo át mùi thịt cá, tạo thêm vị đặc biệt làm nướng pizza, gà nướng, tôm nướng Hương thảo chứa nhiều canxi, sắt ,vitamin A C [23] 1.2 Ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật nhân giống in vitro 1.2.1 Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật phạm trù khái niệm chung cho tất loại ni cấy ngun liệu thực vật hồn tồn vi sinh vật, mơi trường dinh dưỡng nhân tạo, điều kiện vô trùng [9] Cơ sở khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật tính tồn (Totipotence) tế bào Trong tế bào chứa hệ gen, gồm tất gen mã hóa cho protein liên quan đến đặc tính, tính trạng chức sinh học thực vật Hiện nay, người ta hoàn toàn chứng minh khả tái sinh thể thực vật hoàn chỉnh từ tế bào riêng rẽ [5] Theo Nguyễn Quang Thạch Cs [9] tất loại tế bào bắt nguồn từ tế bào hợp tử Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử phân chia hình thành nhiều tế bào phơi sinh sau biến đổi thành tế bào chun hóa Sự phân hố tế bào chuyển tế bào phôi sinh thành tế bào mô chuyên hoá, đảm nhận chức khác Mặc dù tế bào phân hoá thành tế bào có chức riêng chúng khơng khả biến đổi Trong điều kiện thích hợp, tế bào lại trở dạng tế bào phôi sinh phân chia mạnh mẽ Q trình gọi phản phân hố tế bào phân hóa tế bào tế bào phơi sinh tế bào dãn phản phân hóa tế bào tế bào chun hóa 1.2.2 Điều kiện mơi trường ni cấy mô tế bào thực vật Môi trường nuôi cấy điều kiện tối cần thiết, yếu tố định cho phân hoá tế bào quan nuôi cấy Theo Nguyễn Quang Thạch Cs [9], nuôi cấy in vitro nuôi cấy điều kiện vô trùng Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng mẫu nuôi cấy môi trường bị nhiễm, mô ni cấy bị chết Điều kiện vơ trùng có ý nghĩa đến thành bại của nuôi cấy mô in vitro Phương pháp vô trùng vật liệu thơng dụng dùng chất hóa học, tia cực tím có khả diệt nấm vi khuẩn Vô trùng ban đầu thao tác khó khâu có ý nghĩa định Tuy vậy, tìm nồng độ thời gian xử lý thích hợp cho tỷ lệ sống cao, thơng thường hay sử dụng số hóa chất HgCl2 0.1%, NaHCl 10%, cồn 70º, clorox,…để khử trùng Phương tiện khử trùng: Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng bàn cấy vơ trùng, phịng ni [5] Ánh sáng nhiệt độ hai yếu tố có ảnh hưởng đến q trình sinh trưởng mơ ni cấy Sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ yếu tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng tác động đến q trình phát triển mơ ni cấy Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số lồi 12 – 18 giờ/ngày Cường độ ánh sáng tác động đến phát sinh hình thái mơ nuôi cấy [5] Theo Dương Tấn Nhựt (2011) ánh sáng yếu tố ảnh hưởng lên trình tạo rễ mẫu cấy Quá trình tạo rễ cần cường độ ánh sáng thấp, cường độ ánh sáng cao ngăn cản trình tạo rễ Chất lượng ánh sáng ảnh hưởng tới rễ, ánh sáng đỏ cam thích hợp cho rễ ánh sáng xanh da trời [2] Hiện phịng thí nghiệm ni cấy mơ để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000 - 2500 lux người 10 ta sử dụng dàn đèn huỳnh quang [7] Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới phân chia tế bào q trình sinh hóa Tùy thuộc vào xuất xứ mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Nhiệt độ buồng nuôi cần đảm bảo nhiệt độ ổn định khoảng 25ºC [7] Môi trường nuôi cấy mơ tế bào thực vật phải có đầy đủ chất dinh dưỡng, chất cần thiết cho phân chia, phân hoá tế bào sinh trưởng bình thường Thành phần hóa học mơi trường đóng vai trị định đến thành cơng hay thất bại nuôi cấy tế bào mô thực vật Từ năm 1933, Tukey nghiên cứu tạo môi trường nuôi cấy thực vật, có nhiều loại mơi trường khác sử dụng cho mục đích này, mơi trường sử dụng phổ biến MS (Murashige & Skoog, 1962), mơi trường thích hợp cho thực vật mầm, hai mầm Mơi trường Gramborg (1965) cịn gọi B5 dùng thử nghiệm đậu tương, sử dụng tách ni tế bào trần Tuy có nhiều loại mơi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm số thành phần sau [3]: Các muối khoáng đa lượng vi lượng, nguồn cacbon, vitamin aminoaxit, chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái mơi trường, chất điều hịa sinh trưởng 1.2.3 Các công đoạn nuôi mô tế bào Theo Ngơ Xn Bình Cs [7], ni cấy mơ tế bào thực vật thực theo giai đoạn sau: (1) Giai đoạn chuẩn bị nhằm tạo nguyên liệu thực vật để đưa vào nuôi cấy (2) Tái sinh mẫu nuôi cấy điều khiển chủ yếu chất điều hòa sinh trưởng (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy (3) Giai đoạn nhân nhanh chồi thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin …), chất bổ sung khác nước dừa, dịch chiết nấm ...ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM THÙY DUNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY HƯƠNG THẢO (Rosmarinus officinalis L. ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Chuyên ngành: Công nghệ sinh học. .. đề tài luâ ̣n văn tha ̣c si ̃ là: ? ?Nghiên cứu nhân giống Hương thảo (Rosmarinus officinalis L. ) phương pháp nuôi cấy mô thực vật? ?? Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng đươ ̣c quy trình tái sinh in... Nghiên cứu nhân giống in vitro Hương thảo phương pháp nuôi cấy mô thực vật 14 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu