qua giếng thạch
Nguyên tắc:
Bacteriocin từ mẫu thử trong các giếng khuếch tán vào môi trường thạch cấy vi sinh vật kiểm định và ức chế sự phát triển của các vi sinh vật nhạy cảm tạo ra vòng ức chế [65]. Đo đường kính vòng ức chế tạo thành nếu có và đánh giá.
- Làm hỗn dịch vi khuẩn kiểm định bằng cách thêm 5 ml nước cất vô trùng vào ống giống đặc của vi khuẩn kiểm định, gõ nhẹ thành ống nghiệm vào lòng bàn tay để vi khuẩn trên thạch phân tán vào nước. - Môi trường thạch thường được pha chế theo công thức ở mục 2.1.3 b,
phân phối vào các bình nón, nút kín và tiệt trùng trong nồi hấp ở 121oC trong 20 phút.
- Khi môi trường thạch thường còn ấm (khoảng 45 – 50oC), đổ hỗn dịch vi khuẩn kiểm định vào bình nón đựng môi trường theo tỉ lệ 5 ml hỗn dịch : 100 ml môi trường, lắc tròn nhẹ để vi khuẩn phân tán đều trong môi trường rồi đổ ra các đĩa petri đường kính 9 cm vô trùng (16 ml môi trường/đĩa), để nguội cho thạch đông lại.
- Khi thạch đã đông, dùng thanh kim loại vô trùng (đường kính 7,8mm) khoan tạo các giếng trên môi trường thạch trong đĩa petri.
- Dùng pipet Eppendorf nhỏ 50 μl mẫu thử vào mỗi giếng thạch. - Các đĩa petri đã nhỏ mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở 37o
C trong 24 giờ cho vi khuẩn kiểm định phát triển.
- Sau thời gian ủ, đo đường kính vòng ức chế (nếu có) bằng máy đo đường kính vòng vô khuẩn và đánh giá.
Một thí nghiệm được tiến hành với 3 đĩa thử song song, đường kính vòng ức chế của mỗi mẫu thử là kết quả trung bình đo được từ 3 đĩa thử. Theo Sifour và cộng sự, vùng ức chế nhỏ nhất có ý nghĩa là 1 mm [62]. Do đường kính giếng thạch là 7,8mm, đường kính vòng ức chế tối thiểu được xác định là 8,8mm.