Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
Các chủng vi khuẩn sử dụng trong đề tài, bao gồm chủng vi khuẩn thử nghiệm L. acidophilus, các chủng vi khuẩn kiểm định B. subtilis và E. coli được bảo quản bằng phương pháp cấy truyền định kì lên môi trường mới. Các thao tác cấy truyền được thực hiện trong tủ cấy vi sinh. Tủ cấy được tiệt trùng trước khi sử dụng bằng cách lau sạch bằng cồn 70o và bật đèn UV trong 20 phút.
a. Phương pháp cấy truyền L. acidophilus từ môi trường dịch thể
Môi trường MRS lỏng được pha chế theo công thức ở mục 2.1.3 a, phân phối vào các ống nghiệm, mỗi ống 9 ml môi trường, nút kín và tiệt trùng trong nồi hấp ở 115oC trong 20 phút, để nguội. Trộn đều ống giống lỏng của L. acidophilus bằng máy lắc Vortex để có hỗn dịch tế bào đồng nhất. Dùng pipet Eppendorf hút 1 ml hỗn dịch tế bào từ ống giống cấy sang ống môi trường mới. Nuôi trong tủ ấm CO2 5% ở 37oC trong 24 giờ.
Sau thời gian ủ, loại bỏ các ống không đạt yêu cầu nếu có (vi sinh vật không mọc, mọc kém, nghi ngờ bị nhiễm). Các ống giống được gói kĩ, bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 10oC (ngăn mát). Việc cấy truyền được thực hiện 1 – 2 tuần/lần.
b. Phương pháp cấy truyền B. subtilis và E. coli từ môi trường thạch
Môi trường thạch thường được pha chế theo công thức ở mục 2.1.3 b, phân phối vào các ống nghiệm, mỗi ống 10 ml môi trường, nút kín và tiệt trùng trong nồi hấp ở 121oC trong 20 phút. Sau khi tiệt trùng, đặt các ống môi trường nằm nghiêng khoảng 15 – 20o trên mặt bàn sạch để thạch đông lại.
Dùng que cấy vô trùng lấy một vòng vi sinh vật từ ống giống đặc cấy sang ống môi trường mới, lướt que cấy trên bề mặt thạch theo hình zigzag. Cả B.
subtilis và E. coli đều được nuôi trong tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ.
Sau thời gian ủ, loại bỏ các ống không đạt yêu cầu nếu có (vi sinh vật không mọc, mọc kém, nghi ngờ bị nhiễm). Các ống giống được gói kĩ, bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 10oC (ngăn mát). Việc cấy truyền được thực hiện 1 – 2 tháng/lần.
2.3.2. Phương pháp nhân giống L. acidophilus
Phân phối môi trường MRS lỏng vào các bình nón, mỗi bình 100 ml môi trường, nút kín và tiệt trùng trong nồi hấp ở 115oC trong 20 phút, để nguội.
Trong tủ cấy vô trùng, tiến hành cấy 1 ống giống lỏng 10 ml của L.
acidophilus vào mỗi bình nón. Nuôi trong tủ ấm CO2 5% ở 37oC trong 18 giờ [30].
2.3.3. Phương pháp xử lí sinh khối L. acidophilus
Sinh khối L. acidophilus được thu nhận từ dịch nuôi cấy vi khuẩn sau 18 giờ bằng cách li tâm (4.000 vòng/phút, 20 phút [10]). Tách riêng phần dịch nổi, thu được sinh khối ở đáy ống li tâm. Xử lí sinh khối thu được theo các bước sau:
- Rửa sinh khối bằng nước cất (1 lần).
- Trộn sinh khối ướt với cát thủy tinh đã hấp tiệt trùng theo tỉ lệ 1:1, nghiền hỗn hợp tạo thành bằng chày cối sứ để phá vỡ tế bào vi khuẩn.
- Bổ sung NaCl 0,9% vào hỗn hợp thu được theo tỉ lệ 1:1 (1 ml NaCl 0,9% cho 1 g hỗn hợp), khuấy đều để tạo thành hỗn dịch.
- Li tâm hỗn dịch thu được bằng máy li tâm cao tốc ở 18.000 vòng/phút trong 20 phút để thu dịch nổi (dịch phá tế bào).
Kiểm tra mức độ phá vỡ tế bào của phương pháp nghiền bằng cách làm tiêu bản sinh khối trước và sau khi xử lí, nhuộm đơn với thuốc nhuộm xanh methylen rồi soi qua kính hiển vi với vật kính dầu (100x).
2.3.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính bacteriocin theo cơ chế khuếch tán qua giếng thạch
Nguyên tắc:
Bacteriocin từ mẫu thử trong các giếng khuếch tán vào môi trường thạch cấy vi sinh vật kiểm định và ức chế sự phát triển của các vi sinh vật nhạy cảm tạo ra vòng ức chế [65]. Đo đường kính vòng ức chế tạo thành nếu có và đánh giá.
Tiến hành:
- Làm hỗn dịch vi khuẩn kiểm định bằng cách thêm 5 ml nước cất vô trùng vào ống giống đặc của vi khuẩn kiểm định, gõ nhẹ thành ống nghiệm vào lòng bàn tay để vi khuẩn trên thạch phân tán vào nước.
- Môi trường thạch thường được pha chế theo công thức ở mục 2.1.3 b, phân phối vào các bình nón, nút kín và tiệt trùng trong nồi hấp ở 121oC trong 20 phút.
- Khi môi trường thạch thường còn ấm (khoảng 45 – 50oC), đổ hỗn dịch vi khuẩn kiểm định vào bình nón đựng môi trường theo tỉ lệ 5 ml hỗn dịch : 100 ml môi trường, lắc tròn nhẹ để vi khuẩn phân tán đều trong môi trường rồi đổ ra các đĩa petri đường kính 9 cm vô trùng (16 ml môi trường/đĩa), để nguội cho thạch đông lại.
- Khi thạch đã đông, dùng thanh kim loại vô trùng (đường kính 7,8mm) khoan tạo các giếng trên môi trường thạch trong đĩa petri.
- Dùng pipet Eppendorf nhỏ 50 μl mẫu thử vào mỗi giếng thạch.
- Các đĩa petri đã nhỏ mẫu thử được ủ trong tủ ấm ở 37oC trong 24 giờ cho vi khuẩn kiểm định phát triển.
- Sau thời gian ủ, đo đường kính vòng ức chế (nếu có) bằng máy đo đường kính vòng vô khuẩn và đánh giá.
Một thí nghiệm được tiến hành với 3 đĩa thử song song, đường kính vòng ức chế của mỗi mẫu thử là kết quả trung bình đo được từ 3 đĩa thử. Theo Sifour và cộng sự, vùng ức chế nhỏ nhất có ý nghĩa là 1 mm [62]. Do đường kính giếng thạch là 7,8mm, đường kính vòng ức chế tối thiểu được xác định là 8,8mm.
2.3.5. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính bacteriocin Lấy 10 ml dịch bacteriocin cho mỗi mẫu thử, xác định pH bằng chỉ thị màu, từ đó chỉnh pH về các giá trị pH nghiên cứu bằng NaOH 1N hoặc HCl 1N đã tiệt trùng [44]. Để 2 giờ [1] ở nhiệt độ phòng [62]. Đánh giá hoạt tính
của dịch bacteriocin đã chỉnh pH theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.4, so sánh giữa các mẫu và rút ra nhận xét.
2.3.6.Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin
Lấy 10 ml dịch bacteriocin cho mỗi mẫu thử, đun trên bếp cách thủy ở các giá trị nhiệt độ nghiên cứu trong 30 phút [44]. Để nguội ở nhiệt độ phòng.
Đánh giá hoạt tính của dịch bacteriocin đã xử lí nhiệt theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.4, so sánh với mẫu chuẩn đối chiếu là dịch bacteriocin không xử lí nhiệt và rút ra nhận xét.
2.3.7. Phương pháp khảo sát khả năng chiết bacteriocin bằng (NH4)2SO4
Nguyên tắc:
Bacteriocin có bản chất protein nên tạo kết tủa khi nồng độ (NH4)2SO4
đủ lớn [56]. Tách riêng phần tủa bacteriocin và phần dịch, đánh giá hoạt tính bacteriocin của mỗi phần. Bacteriocin kết tủa càng nhiều thì hoạt tính của phần tủa càng lớn, hoạt tính của phần dịch càng nhỏ.
Tiến hành:
- Làm lạnh dịch bacteriocin bằng cách để trong tủ lạnh ở 4oC [1] trong khoảng 1 giờ.
- Thêm dần (NH4)2SO4 theo các nồng độ muối nghiên cứu, có kết hợp khuấy từ [1].
- Li tâm dịch bacteriocin đã hòa tan muối bằng máy li tâm cao tốc ở 10.000 vòng/phút trong 20 phút để phân riêng phần tủa và phần dịch [56].
- Hòa tan phần tủa trong đệm phosphat pH 7,0 [56] theo tỉ lệ khoảng 1 ml đệm cho phần tủa của 30 ml dịch bacteriocin ban đầu [46].
- Đánh giá hoạt tính bacteriocin của phần tủa và phần dịch theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.4, so sánh giữa các mẫu và rút ra nhận xét.