Xét nghiệm protease amylase và lipase trong máu của bệnh nhân viêm tụy mãn

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về mối liên quan giữa hoạt độ các enzym tiêu hóa của tuyến tụy trong máu với tình trạng của bệnh VTM.. Tại Việt Nam mới chỉ có một số nghi

Bộ môn Hóa sình Trường Đại Học Dươc Hà Nội

HÀ NỘI - 2010

LM cảm ơn

Nhân dịp khóa luận được hoàn thành, cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân

thành, lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Nguyễn Văn Rư, ThS NCS Phạm

Hoàng Hà và DS Nguyễn Xuân Bẳc - 3 thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực

hiện và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên đang giảng dạy, làm việc tại bộ môn Hóa Sinh đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm

Tôi cũng xin gửi lời cảm on tới Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy giáo,

cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, những người đã giúp đỡ và ủng

hộ tôi để có kết quả như hôm nay

Tôi xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, ngày 16 tháng 5 năm 2010

Sinh viên Trần Thị Thúy An

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỰC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐÈ 1

CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN 2

1.1 Sinh lý tuyến tụy 2

1.1.1 Giải phẫu 2

1.1.2 Chức năng tụy nội tiết 2

1.1.3 Chức năng tụy ngoại tiết 3

1.2 Bệnh lý viêm tụy mãn 5

1.3 Các phương pháp xác định hoạt độ enzym tụy trong máu 9

1.3.1 Xác định hoạt độ protease 9

1.3.2 Xác định hoạt độ lipase 12

1.3.3 Xác định hoạt độ amylase 15

CHƯOnVG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 18

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 18

2.1.1 Mau nghiên cứu 18

2.1.2 Hóa chất và thuốc thử 18

2.1.3 Dụng cụ mảy móc 18

2.2 Nội dung nghiên c ử u 19

2.3 Phương pháp thực nghiệm 19

2.3.1 Xác định hoạt độ protease 19

2.3.2 Xác định hoạt độ amylase 21

2.3.3 Xác định hoạt độ lipase 23

MỤC LỤC

2.3.4 Các phương pháp xử lý kết quả 24

CHƯƠNG 3 THựC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Hoạt độ protease trong máu của BN VTM 25

3.2 Hoạt độ lipase trong máu của BN VTM 27

3.3 Hoạt độ amylase trong máu của BN VTM 29

3.4 BÀN LUẬN 31

3.4.1 về việc định lượng protease, lipase, amylase trong máu của BN VTM 31

3.4.2 về lựa chọn phương pháp xác định HđE tụy trong máu 33

3.4.3 về kết quả HđP, HđL và HđẢ trong máu của BN VTM 36

3.4.4 về ý nghĩa tiến hành nghiên cứu 37

KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 39

DANH MỤC CÁC BẢNG

số tham chiếu

28

chỉ số tham chiếu

31

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

2 Hình 3.1 Biêu đô thê hiện hoạt độ protease ừong máu của BN

ĐẶT VẤN ĐẺ

Viêm tụy mãn được đặc trưng bởi quá trình phá hủy nhu mô tụy tiến triển, không hồi phục, dẫn tới xơ hóa nhu mô gây giảm cả chức năng tụy nội tiết và ngoại tiết Viêm tụy mãn (VTM) là một bệnh lý khá phổ biến tại các nước Châu Âu, Châu

Mỹ Theo thống kê tại Mỹ năm 1962 tỷ lệ mắc VTM/100.000 người dân là 4, ở Thụy Điển năm 1970 là 6,9 người cho đến năm 1975 đã gia tăng lên 10/100.000 người [11] Một nghiên cứu trên toàn quốc ở Nhật Bản đã phát hiện sự gia tăng tổng

số bệnh nhân được điều trị VTM tnừ 32.000 năm 1994 lên 42.000 năm 1999 trong

đó tỷ lệ hiện mắc và mới mắc cũng tăng [27] ở Việt Nam chưa thấy có các nghiên cứu về dịch tễ học bệnh VTM trong cộng đồng [11]

Hiện nay, vẫn còn nhiều khó khăn trong việc chẩn đoán, theo dõi tiến triển của VTM Việc chẩn đoán, theo dõi tiến triển của VTM đòi hỏi sự kết hợp của nhiều phương pháp khác nhau như: khám lâm sàng, chẩn đoán hình ảnh, sinh thiết, xét nghiệm hóa sinh enzym của tuyến tụy trong máu, phân, dịch tụy [21] Trong đó, việc xét nghiệm các enzym tiêu hóa của tuyến tụy trong máu là việc khá đơn giản Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về mối liên quan giữa hoạt độ các enzym tiêu hóa của tuyến tụy trong máu với tình trạng của bệnh VTM Tại Việt Nam mới chỉ có một số nghiên cứu mô tả về hoạt độ các enzym tiêu hóa của tuyến tụy ở một số ít đối tượng bệnh nhân VTM

Với mục đích góp phần làm sáng tỏ mối liên quan giữa hoạt độ các enzym tiêu hóa của tuyén tụy trong máu với tình trạng VTM, chúng tôi tiến hành thực hiện

đề tài: “Xét nghiệm protease, amylase và lipase trong máu của bệnh nhân viêm

tụy mãn” với mục tiêu:

Xác định được hoạt độ các enzym protease, amylase và lipase trong máu của bệnh nhân viêm tụy mãn.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 SINH LÝ TƯYÉN TỤY

1.1.1 Giải phẫu

Tụy là một cơ quan sau phúc mạc, nằm sau dạ dày, sát thành sau của ổ bụng Tụy là tuyến thuộc bộ máy tiêu hóa vừa có chức năng nội tiết vừa có chức năng ngoại tiết [12]

ống nang V '

ống mật chủ

Tuyến tụy ống tụy phụ ông tụy chính

Tá tràng

Nang khối sòi mật

M

Núm tá ừàĩig to

Illustration by Myriam Kiĩkman-Oh

Hình 1.1 Giải phẫu tuyến tụy 1.1.2 Chức năng tụy nội tiết

Tuyến tụy tiết ra 3 hormon quan ữọng là insulin, glucagon, và somatostatin

đổ vào máu giúp cho điều hòa nhiều hoạt động của cơ thể Các tiểu đảo tụy chứa ba loại tế bào chính là: tế bào alpha, tế bào beta, và tế bào delta Trong ba loại này thì

tế bào beta chiếm số lượng nhiều nhất và sản xuất insulin Các tế bào alpha sản xuất glucagon và tế bào delta sản xuất somatostatin

* Tác dụng của insulin;

Chuyển hóa glucid: tăng hoạt hóa glucose ở cơ; tăng dự trữ glycogen ở

gan; tăng thu nhập, dự trữ và sử dụng glucose ở tế bào gan; ức chế quá trình

tân tạo đường

Chuyển hóa lipid: tăng tổng hợp acid béo và vận chuyển acid béo đến mô mỡ;

tăng tổng hợp triglycerid tìr acid béo để tăng dự ứữ lipid ở mô mỡ

Chuyển hóa protein và sự tăng trưởng: tăng sinh tổng hợp và dự trữ protein

ở mô; làm cơ thể phát triển

* Glucagon: có nhiều tác dụng ngược insulin:

Chuyển hóa glucid: tăng phân giải glycogen ở gan; tăng tân tạo đưòmg ở tế

bào gan

Các tác dụng khác: tăng phân giải lipid ở mô mỡ dự trữ; ức chế tổng hợp

triglycerid ở gan và ức chế vận chuyển acid béo từ máu vào gan; có thể làm

tăng cưòng độ tim, tăng bài tiết mật, ức chế bài tiết HCl của dịch vị

* Somatostatin: hoạt động như một hormon tại chỗ:

ứ c chế hoạt động của tế bào tiểu đảo Langerhans, do đó làm giảm bài tiết

cả insulin và glucagon

Làm giảm nhu động dạ dày, tá tràng, co bóp túi mật

Làm giảm bài tiết dịch và hấp thu ở đường tiêu hóa

ứ c chế bài tiết gastrin, secretin, cholecystokinin [2], [14],

1.1.3 Chức năng tụy ngoại tiết

❖ S ự bài tiết enzytn tiêu hóa

Các tuyến nang của tụy bài tiết ra dịch tụy trong đó có các enzym trypsin,

C h y m o t r y p s i n , elastase, amylase, lipase

> Các enzym tiêu hóa protein gồm: trypsin, Chymotrypsin, carboxy- polypeptidase Trypsin và Chymotrypsin phân hủy protein, pepton và các chuỗi

polypeptid nhỏ hơn và carboxypeptidase sẽ phân cắt các acid amin tận cùng của các chuỗi polypeptid Dưới tác dụng của enzym tiêu protein của dịch tụy, chỉ một lượng nhỏ protein được tiêu hóa hoàn toàn thành các acid amin, phần còn lại ở dạng dipeptid, tripeptid, và một số ít poỉypeptid.

> Các enzym tiêu hóa glucid: enzym amylase tiêu hóa cả tinh bột chín và sống thành đường maltose và một số ít polyme của glucose như maltosetrypose và dextrin

> Các enzym tiêu hóa lipid:

- lipase là enzym tiêu hóa lipid trung tính quan trọng nhất Dưới tác dụng của lipase, lipid trung tính được phân giải thành các acid béo, monoglycerid và một lượng nhỏ diglycerid, dịch tụy có đủ một lượng lớn lipase để tiêu hóa toàn

bộ lipid trung tính

- Enzym thủy phân (cholesterol-este hydrolase): thủy phân cholesterol-este

để giải phóng các acid béo, enzym phospholipase A (được hoạt hóa dưới tác dụng của trypsin) thủy phân lecithin (là phospholipid có trong mật) thành lysolecithin và acid béo, lysolecithin gây tổn thương cho tế bào Do đó một trong những nguyên nhân gây viêm túi mật là do sự hoạt hóa enzym phospholipase A Trong ống tụy, enzym này thủy phân lecithin thành lysolecithin phá vỡ các mô tụy gây hoại tử các mô xung quanh

<♦ S ự bài tiết các chất ức chế trypsin

Trypsin và các enzym khác nhau có thể tiêu hóa chính bản thân tuyến tụy, nên các enzym tiêu protein của dịch tụy chỉ trở nên hoạt động khi chúng đã được bài tiết vào ruột non

Ngoài ra các tế bào bài tiết enzym tiêu protein vào các nang tụy cũng đồng thời bài tiết các chất ức chế trypsin, chất này chứa trong các bào tương, xung quanh các hạt zymogen Như vậy có sự ngăn cản hoạt hóa của trypsin ở bên trong các tế

bào bài tiết ở trong các tuyến nang và các ống tuyến tụy, vì trypsin hoạt hóa tiếp theo của các enzym này.

<♦ S ự bài tiết ion H C O i và nước

Nước và ion HCOs' là do các tế bào biểu mô của ống tuyến tụy bài tiết Sự bài tiết diễn ra như sau; CO2 khuếch tán từ máu vào tế bào biểu mô, tại đây dưới tác dụng của enzym CA, CO2 kết hợp với nước tạo thành H2CO3 H2CO3 phân ly thành

và HCOs’ , rồi HCO3' được vận chuyển tích cực vào lòng ống tuyến còn ion

từ tế bào vào máu để trao đổi với ion Na"^ từ máu vào tế bào theo cơ chế vận chuyển tích cực, sau đó Na^ được khuếch tán từ tế bào vào lòng ống, sự vận chuyển của HCOs' và Na^ từ máu vào lòng ống sinh ra một bậc thang thẩm thấu để kéo nước vào lòng ống tụy, kết quả tạo ra dung dịch bicarbonat ở tuyến tụy

1.2 BỆNH LÝ VIÊM TỤY MÃN

1.2.1 Định nghĩa : VTM là bệnh viêm đặc trưng bởi quá trình phá hủy nhu mô tụy

tiến triển, không hồi phục, dần dần dẫn tới xơ hóa nhu mô tụy gây suy giảm chức năng nội tiết và ngoại tiết

1.2.2 Phân loại: Theo Marseilles-Rome năm 1988 chia VTM thành 2 loại chính:

> VTM tắc nghẽn thứ phát sau một tắc nghẽn mạn tính của các ống tụy Sự

ứ trệ gây giãn ống tụy, teo nhu mô Sự tắc nghẽn lưu thông của dịch tụy do viêm nhiễm, dị dạng, xơ hóa hay u, đều có thể tạo ra các tổn thương như vậy

> VTM vôi hóa thường gặp nhất (95%) Nguyên nhân có thể do rượu (hay gặp ở Châu Âu), do gia đình, tăng canxi máu, bệnh vùng nhiệt đới và không rõ căn nguyên [23]

1.2.3 Nguyên nhân:

ỉ' Các nguyên nhân thường gặp:

> ở phương Tây VTM thường đi kèm với việc lạm dụng rượu, ngoài ra còn

do bệnh nang xơ tuyến tụy

> ở Việt Nam ngoài các nguyên nhân trên còn một nguyên nhân khác cũng khá phổ biến là do sỏi và giun chui vào ống tụy.

> Trong những năm gần đây, các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng những bất thưòng trong chất liệu di truyền cũng có thể đẫn đến VTM Gen điều hòa

sự hoạt động và bất hoạt trypsinogen và chức năng điều hòa vận chyển qua màng túi chất xơ đang được chú ý đặc biệt Những đột biến trong những gen này ngày nay được nhận thấy nhiều hơn với vai trò biến đổi bệnh lý tiềm tàng trong những dạng nhất định của VTM bao gồm VTM do rượu, nhiệt đới

và tự phát [19]

* Ngoài ra theo hệ thống phân loại TIGAR-0 liệt kê các nguyên nhân gây VTM bao gồm [23]:

T (toxic): VTM do nhiễm độc rượu, thuốc, do suy thận, tăng canxi máu

I (idiopathic): VTM vô căn, VTM nhiệt đới

G (genetic): VTM di truyền do đột biến gen trypsinogen, đột biến hoặc thay đổi gen ức chế tiết trypsin (SPINK-1), gen xơ hóa dạng nang (CFTR)

^ A (autoimmune): VTM tự miễn

R (recuưent): Viêm tụy cấp nặng tái diễn

o (obstructive): VTM tắc nghẽn.

1.2.4 Cơ chê sinh bệnh:

Triệu chứng điển hình của VTM là các đợt đau bụng tái diễn Nguyên nhân đau được giải thích là tăng áp lực trong ống tụy và trong nhu mô tụy, tăng tiết dịch tụy do suy chức năng tụy ngoại tiết, thiếu máu nhu mô tụy và viêm nhiễm quanh thần kinh Các biến chứng tại chỗ của VTM gây các triệu chứng khác nhau Nang giả hoặc khối viêm ở đầu tụy gây chèn ép tại chỗ như hẹp đưòng mật (gây vàng da, tắc mật hoặc nhiễm trùng đường mật); chèn ép tá tràng gây nôn, tắc ống tụy chính;

chèn ép tĩnh mạch cửa, tĩnh mạch lách gây huyết khối, tăng áp lực tĩnh mạch cửa từng phần.

1.2.5 Chẩn đoán:

> Biểu hiện lâm sàng [12]:

Đau bụng; Đau bụng là triệu chứng hay gặp nhất trong đa số các trường

hợp VTM Bệnh nhân đau vùng trên rốn lan sang phải, sang trái và xuyên ra sau lưng Đau không thường xuyên có khi vài ngày, có khi kéo dài lâu hơn rồi triệu chứng biến mất trong một thời gian khá lâu, có khi vài tháng Triệu chứng thường xuất hiện sau một bữa ăn có nhiều lipid, uống nhiều rượu Đôi khi bệnh xảy ra sau khi lao động mệt nhọc hoặc có cảm xúc mãnh liệt Triệu chứng đau lúc đầu chỉ âm

ỉ, tức bụng, nóng rát vùng trên rốn sau đó đau quặn, cơn đau tăng dần lên dữ dội và

có nhiều cơn đau nối tiếp nhau Cơn đau có thể kéo dài trong nhiều giờ Ngoài đau bệnh nhân có thể gặp triệu chứng buồn nôn hoặc nôn Do đau nhiều và thành mạn tính nên bệnh nhân không dám ăn nhiều thức ăn, thêm vào đó do VTM nên các enzym tiêu hóa của tuyến tụy tiết ra thiếu, làm việc hấp thu chất dinh dưỡng bị hạn chế vì vậy càng làm bệnh nhân dễ gầy và sút cân

Vàng da: Vàng da do VTM chỉ là vàng nhẹ và trong một thời gian ngắn

Vàng da có thể xuất hiện sau ccm đau vài giờ, nhưng thưòng không có sốt (khác với vàng da trong sỏi mật, lần lượt có các triệu chứng điển hình như: đau, sốt, vàng da)

Cũng có thể định lượng lactofeưin trong dịch tụy, nếu tăng cao rất có ý nghĩa trong chẩn đoán VTM

Siêu âm nội soi: tăng giá trị và độ chính xác pp này cho phép thăm khám

tỉ mỉ các thương tổn dạng nang và khối và cho thấy những sỏi nhỏ Tuy nhiên những nghiên cứu gần đây gợi ý rằng siêu âm nội soi dẫn đến chẩn đoán quá mức VTM, thậm chí ngay cả khi áp dụng những tiêu chuẩn được công nhận, và không thể chẩn đoán bệnh sớm

Chụp cộng hưởng từ mật tụy (MRCP) cung cấp thông tin về hệ thống ống tiết, mạch máu và chức năng Có thể MRCP ít nhậy cảm hơn chụp mật tụy ngược dòng (ERCP) khi chẩn đoán những thể nhẹ của VTM, nhưng MRCP an toàn hơn (cũng như CT xoắn ốc) MRCP cũng rất tốt với những bệnh nhân bị kén giả hay stent kèm theo

Chụp mật tụy ngược dòng (ERCP) là pp được sử dụng nhiều trong chẩn đoán VTM ERCP chính xác hơn siêu âm, CT và MRCP (đặc biệt khi giải thích các bất thường về giải phẫu ống tiết hoặc liên quan với các thương tổn dạng nang), cung cấp hình ảnh đường mật có chất lượng và có thể can thiệp điều trị [21]

> Điều trị: Đòi hỏi phải có sự kết hçfp giữa nội khoa và ngoại khoa.

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT Đ ộ ENZYM TỤY TRONG MÁU

1.3.1 Xác định hoạt độ protease

> Phương pháp đo màu cải tiến của Ilya Raskin: Năm 2004, Ilya Raskin đã cải

tiến phưcmg pháp đo màu để định lượng Protease

Nguyên tắc: dùng cơ chất là N-Acetyl-DL-Phenylalanine Íỉ-Naphthylester (APNE)

và O-Dianisidine tetrazotized (oD) là chất màu, sau đó đem đo độ hấp thụ ở 530 nm, xây dựng đường cong chuẩn về mức tăng nồng độ enzym và độ hấp thụ đo được Phản ứng được kết thúc bằng cách cho 1% acid acetic [28]

> Phương pháp cân: Định lượng protease theo pp cân của FLEURY [15].

Nguyên tắc: làm đông vón protein bằng acol cao độ ở pH thích hợp và nhiệt độ sôi

Rửa tủa bằng nước sôi, tráng bằng acol, ete, sấy khô 100°c rồi cân

Tiến hành:

Trong một cốc có mỏ ( dung tích 50ml) cho:

Huyết thanh 2ml

Đỏ metyl 1 - 2 giọt

Rỏ vài giọt acid acetic để dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt

Đun cách thủy sôi 5 phút Khi acol bắt đầu sôi tiếp tục đun 5 phút

Cân thăng bằng: 2 giấy lọc đã sấy khô ở 100°c trong 10 phút Đổ từ từ hỗn họp acol sôi và tủa protein lên trên 2 giấy lọc đặt trên cùng 1 phễu Dùng đũa thủy tinh bịt đầu bằng cao su để vét hết tủa protein dính vào cốc Dùng nước cất đun sôi để chuyển hết tủa protein sang giấy lọc rồi rửa cho đến khi nước rửa thật trong (độ 60

- 70 ml nước) Rửa tráng thật cẩn thận toàn bộ tủa protein trên giấy lọc bằng 20ml

acol tuyệt đối đun sôi Cuối cùng tráng đều trên tủa 15-20ml ete sấy khô 100°c -

105“c cho đến khi trọng lượng không đổi

> Kĩ thuật miễn dịch liên kết men ELISA :

Nguyên tắc: sử dụng 2 kháng thể đơn tính đặc hiệu gắn với enzym Kháng

thể kết hợp với kháng nguyên tạo phức họp kháng nguyên - kháng thể đồng thời có

mặt của enzym gắn trên đó Sau đó thêm một cơ chất thích hợp và enzym tác động lên cơ chất làm thay đổi màu môi trường [18]

> Phương pháp khác [5], [10], [13];

Nguyên tắc: dùng một protein đã xác định làm cơ chất (casein, albumin,

hemoglobin biến tính), kết tủa protein bằng acid tricloroacetic, đo độ hấp thụ quang trực tiếp ở bước sóng 280nm hoặc với thuốc thử Biuret Một số pp xác định protease thưòng dùng là pp Anson, Anson cải tiến, pp Biuret hoặc Lowry Cũng có thế có một số pp riêng cho mỗi enzym trong đó sử dụng một cơ chất đặc hiệu, hoạt

độ protease được xác định bằng lượng cơ chất còn lại hoặc sản phẩm được tạo thành

^ PPAnson cải tiến:

Nguyên tắc: cho protease tác dụng với cơ chất là casein, sau đó kết tủa protein dư

bằng acid tricloacetic, định sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin - Ciocanteu Biểu diễn hoạt độ bằng đơn vị hoạt động (đvhđ) Đvhđ là lượng enzym mà trong điều kiện 30°c sau một phút phân giải protein tạo thành sản phẩm hòa tan trong acid tricloacetic tương đưong Immol tyrosin

'Y' p p Biuret:

Nguyên tắc: dưới tác dụng của enzym thì protein bị thủy phân giải phóng ra các

acid amin Xác định lượng protein còn lại bằng cách tủa với acid tricloacetic Tủa này phản ứng với thuốc thử Gomall tạo phức màu tím hồng Đo quang phổ hấp thụ

ở bước sóng À, = 530 nm, cuvet Icm [13]

^ p p sử dụng cơ chất đặc hiệu cho protease: là BAEE ( L - benzoyl, L -

arginin etyl ester) chỉ chứa một liên kết peptid để xác định hoạt độ protease Tuy là

pp đặc hiệu và chính xác nhưng lại khá đắt đỏ [10]

Nguyên tắc: Huyết thanh đã khô (loại đã hỏng không còn dùng được cho

truyền máu) được sử dụng làm cơ chất, sau khi đã làm biến tính bằng cách đun nóng

trong môi trường kiềm Do tác dụng của trypsin, tyrozin và tryptophan giải phóng

từ cơ chất, và được định lưọng bằng thuốc thử Polin - Xiocanto

Phương pháp GAULTIER [10]:

Nguyên tắc: cho trypsin tác dụng trên gelatin-1 phần của gelatin được

chuyển thành acid amin, các acid amin này được định lượng bằng focmol theo pp

Sorensen

Phương pháp khác: Định lưọng trypsin trong dịch tá tràng được Lundch

thực hiện (1957) Haverback, Dyce, Gutentag, Montgomery xác định bằng một thiết

bị chuẩn độ tự động (1963) bằng cách sử dụng một chất nền p toluene sulfonyl - L

arginine methyl ester [16] Năm 1967 Wiggins s.H (Phòng nghiên cứu tiêu hóa,

Hội đồng nghiên cứu y khoa, Bệnh viện trung tâm Midddlesex, Luân đôn, Anh) đã

định lượng trypsin dựa trên nguyên tắc đo lường giải phóng (bằng việc tính thời

gian trung hòa bởi kiềm) khi cho trypsin tác dụng với cơ chất đặc biệt là N-bezoyl-

L-arginine ethyl ester hydrochloride (BAEE); Đây là một pp đơn giản, thích hợp

với nhiều phòng thí nghiệm trang thiết bị bình thường, sử dụng đơn vị tiêu chuẩn

quốc tế để đo hoạt độ trypsin nên sau đó đã có rất nhiều nghiên cứu ứng dụng và

biến đổi một chút trong việc đo hoạt độ trypsin [25]

Schwert và Takenaka tại phòng thí nghiệm Seravac (Pty) Ltd đã sử dụng cơ

chất tổng hợp đặc biệt là N - benzoyl - L - arginine ethyl ester hydrochloride

(BAEE) để định lượng trypsin [21] Vào những năm 80 của thế kỷ trựớc trypsin

huyết thanh còn được định lưọng bằng pp xét nghiệm miễn dịch phóng xạ sử dụng

kit công nghiệp (RIAgnost, Hoechst) và pp này được sử dụng khá rộng rãi trên thế

giới

^ Chymotrypsin: Schwert và Takenaka sử sụng cơ chất đặc biệt N - acetyl

- L - tyrosine ester monohyđrate (ATEE) để định lượng Chymotrypsin [21]

^ Elastase: Elastase - 1 thưÒTig được định lưọng ở trong phân, chưa thấy có

nghiên cứu nào định lượng ở trong máu Đặc biệt xác định elastase - 1 trong phân được cho là một xét nghiệm đon giản, tương đối “rẻ tiền”, không xâm hại, đặc hiệu

và có độ nhạy cao trong việc đánh giá chức năng tụy cũng như phân biệt mức độ nặng nhẹ của thiểu năng tụy [18],

Cách thủy 37° trong 60 phút

Dùng NaOH 0,05N chuẩn độ đến màu xanh sáng bền Ví dụ aml cho mẫu thí nghiệm và bml cho mẫu trắng Tính a - b ( Dùng biuret Iml chia độ đến 10'^ml)

> Phương pháp SAIFE và PERLE [10].

Nguyên tắc: Dưới tác dụng của lipase, phenyl laurat bị thủy phân thành phenol và

acid lauric Phenol này được định lượng bằng thuốc thử Folin và Ciocalteu Natri cholat được sử dụng làm chất hoạt hóa lipase

lipasePhenyl laurat + H2O -> phenol + acid lauric

Để vài phút ở cách thủy 37°c rồi cho huyết thanh

- Để 10 phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm cả 2 ống Lấy 5ml nước trong ở trên thêm 2,5ml dung dịch carbonat Trộn đều và để ở nhiệt độ thường 20 phút Nếu thấy đục thì ly tâm vào những phút cuối của thời gian để phát triển mẫu ở trên

- Đo mật độ quang ở 680nm Đối chiếu trên đường chuẩn để tính HđL

- Bằng pp này huyết thanh người bình thường có từ 9 - 20 đơn vị quốc tế/llit

> p p cải tiến của NA TELSON [10];

Tiến hành:

- Iml đệm phosphat; 0,2ml huyết thanh; 0,5ml dung dịch gôm Arabic và 0,2ml dầu

ôliu Trộn kỹ trong bình nón Đậy nút rồi để cách thủy 37”c trong 24 giờ Sau đó thêm 2ml methanol rồi chuẩn độ bằng dung dịch KOH 0,05N, với chỉ thị màu là phenolphthalein

- Lấy ống ĐC cũng giống như trên, nhưng chỉ cho huyết thanh ngay trước khi chuẩn độ

- Cách tính: (V - V’) X 5 = Đơn vị hoạt độ enzym

> Phương pháp TIETZ và BORDER [10].

Nguyên tắc: Cho tác dụng enzym với cơ chất là dầu ôliu Acid béo được chuẩn độ

bằng kiềm

Tiến hành:

- Trong 2 ống nghiệm cho 0,25ml nước, 0,3ml hỗn hợp dịch dầu ôliu và 0,1 ml đệm

Trong ống thí nghiệm cho 0,lml huyết thanh, ống thứ 2 được dùng làm ống ĐC Sau khi trộn kỹ cho cả 2 ống vào nồi cách thủy 37°c trong 6h sau đó thêm 0,3ml dung dịch ethanol 95% vào cả 2 ống và 0,1 ml huyết thanh vào ống ĐC Thêm một giọt chỉ thị màu thymolphtalein Trộn đều, chuẩn độ bằng NaOH 0,05N đến màu xanh tới Dùng micro buret để chuẩn độ

- Gọi V, V’ lượng ml NaOH 0,05N dùng để chuẩn độ ống TN và ống ĐC:

( V - V’) X 10 = Số đơn vị hoạt độ enzym

> Phương pháp đo quang:

Nguyên tẳc: Lipase làm xúc tác phản ứng thủy phân diglycerid thành monoglycerid

và acid béo Hoạt độ của lipase được xác định bằng tốc độ hình thành quinoneimin,

đo ở bước sóng 550 nm, qua các phản ứng xúc tác bởi monoglycerid lipase (MGL), glycerol kinase, glycerol phosphat oxydase (GPO) và phản ứng tạo màu xúc tác bởi peroxidase:

Lipase1,2-Diglycerid + H2O -► 2-Monoglycerid + acid béo

MGL2-Monoglycerid + H2O - ► Glycerol + acid béo

Glycerol kinaseGlycerol + ATP -► Glycerol-3-phosphat + ADP

PGOGlycerol-3-phosphat + O2 -^ Dihydroxyaceton-P + H2O2

Peroxidase

2H2O2 + 4-aminoantipyrin + TOOS - ► Quinoneimin + 4 H2O

(Ở đây: TOOS =N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin)

Đọc độ hấp thụ quang ban đầu và đọc mỗi phút một lần, trong 3 phút Hoạt độ lipase bình thường trong huyết tương đo ở 37°c ở nam và ở nữ là 7- 59 Ư/L Sử dụng xét nghiệm lipase tốt hơn khi kết hợp với định lượng a-amylase [3]

1.3.3 Xác định hoạt độ amylase

> Phương pháp WOHLGEMUTH: [10].

Nguyên tắc: Cho enzym trong máu tác dụng với tinh bột trong các điều kiện pH và

nhiệt độ thích hợp Tinh bột sẽ thủy phân thành đường khử Dựa vào số lượng hồ tinh bột thủy phân hết để suy ra HĐ amylase

Tiến hành:

Lấy 8 ống nghiệm, đánh số từ 1 đến 8, cho vào mỗi ống Iml máu Tráng ống hút Hút Iml của ống số 1 cho sang ống số 2 Cũng tráng ống hút như trên Hút Iml của ống số 2 cho sang ống số 3 Tiếp tục làm như vậy cho tới ống số 8 Đến ống số 8

thừa Iml hút bỏ Iml đó đi Như vậy theo thứ tự các ống nghiệm, máu đã được pha loãng với tỷ lệ: 1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/64; 1/128; 1/256

Thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch HTB1%0 Lắc đều đặt vào nồi cách thủy 37°c trong 30 phút Sau đó lấy ra ngâm vào nước đá chừng 1 phút rồi cho nhanh vào mỗi ống 2 giọt iod N/50 Lắc Quan sát màu của các ống Các ống nào mà tinh bột bị thủy phân hoàn toàn thì không màu Các ống nào có màu nâu đỏ là do tinh bột bị thủy phân một phần ở dạng dextrin, óng nào còn tinh bột thì có màu xanh lơ

> Phương pháp FENNEL [10]:

Nguyên tẳci Hoạt độ amylase được xác định dựa vào sự giảm cưÒTig độ màu với iod

sau phản ứng, đối chiếu với dung dịch chuẩn để nghiên cứu

Huyết thanh pha loãng 100 lần bằng cách

lấy 0,1 ml dịch nghiên cứu + 9,9 ml dung

dich NaCl o’85% Lắc đều, ủ ở 37-38°C, 30

> Phương pháp tạo đường:

Nguyên tắc: là đo lượng đưÒTig được sinh ra bởi khả năng khử của enzym hoặc những cách thức đặc trưng của chúng Thứ hai là đo mật độ quang của những nhóm mang màu đặc hiệu bằng bộ đôi dụng cụ đo màu và đo huỳnh quang Một khó khăn

mà pp này mắc phải khi sử dụng cơ chất tinh bột là kết quả thu được luôn có sự khác nhau

> Phương pháp đo màu:

Nguyên tắc: một cơ chất tổng hợp sẽ được sử dụng nhằm tạo ra sản phẩm có màu,

dễ dàng đo được bằng máy đo quang phổ pp này được xem là đơn giản, có độ nhạy

cao, thích họp với những máy theo dối tình hình bệnh liên tục, tự động, tiện lợi hiện

đang ngày càng trở nên phổ biến “PP chuẩn tối ưu” sử dụng kit của hãng La Roche

cũng dựa trên nền tảng của pp này

2 ethyliden-G4 + 2 G3PNP + ethyliden-Gs + G4PNP

a-glucosidase 2G2PNP + 2 G3PNP + 1OH2O ^ ► 4PNP + 1OG

Phản ứng biến thành PNP là chất có màu đỏ gây nên sự tăng độ hấp thụ quang có

thể đo được ở bước sóng 405nm Đọc độ hấp thụ quang ban đầu, rồi đọc độ hấp thụ

quang lặp lại chính xác sau 1, 2, 3 phút

Tính toán:

Hoạt độ aamylase huyết tương (U/L) = 9788 X AA405 nm/ phút

Hoạt độ a amylase nước tiểu (Ư/L) = 19261X AA405 nm/ phút

> Phương pháp động học dựa theo nguyên lý amylase thuỷ phân 2-chloro-

4nitrophenyl-maltotrioside (CNPG3) thành 2-chloro-4Nitrophenyl (CNP), 2-

Chloro-4Nitrophenyl-Maltodioside và glucose (G), theo phản ứng sau;

Sự giải phóng CNP từ cơ chất và sự tăng hấp thụ của nó tỷ lệ thuận với hoạt độ

amylase huyết thanh

Trên thế giới, chủ yếu sử dụng các loại kit để xác định hoạt độ amylase máu,

nước tiểu Trị số bình thường của nó phụ thuộc vào kỹ thuật và thuốc thử (chủ yếu

là cơ chất như G3, G7) Các hãng khác nhau sẽ cho kết quả khác nhau, kết quả đơn

vị đều tính là ư/l Trong đó G3 là 2-Chloro-4 Nitrophenyl-Maltotriosid (CNPG3) và

G7 là p-Nitrophenyl-Maltoheptaoside (EPS)

ơ

‘V