2..3.L Xác định hoạt độ protease [13].
* Nguyên tắc: dưới tác dụng của enzym thì protein bị thủy phân giải phóng ra các acid amin. Xác định lượng protein còn lại bằng cách tủa với acid tricloacetic. Tủa này phản ứng với thuốc thử Gomall tạo phức màu tím hồng. Đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng X = 530 nm, cuvet Icm.
* Tiến hành: Ly tâm máu lấy huyết tương, pha loãng huyết tương 10 lần bằng NaCl 9%0 (dung dịch I).
Bảng 2. ỉ. Xác định protease theo phản ứng Biuret
nghiệm T h u ố cth ư ^
Ong cơ chât (ml) Ong thử (ml) Ông chứng (mỉ)
Dd casein 1,2% 2,0 2,0 0
Acid tricloroacetic 5% 2,5 0 2,5
Đệm thích hợp 2,0 2,0 2,0
II Dung dịch I 0 0.1 0,1
Lắc đều, ủ ấm 37°c trong thời gian theo dõi thích họp. Sau thời gian ủ ấm cần thiết, cho vào ống thử 2,5 ml acid tricloacetic 5%. Lắc kĩ để ở nhiệt độ phòng 10 phút. Ly tâm lấy tủa, hòa tan tủa với 4 ml thuốc thử Gomall. Lắc kĩ, để ở nhiệt độ phòng 30 phút. Đo mật độ quang ở = 550 nm, cuvet Icm.
20
- Katal là lượng enzym xúc tác thủy phân hết 1 mol cơ chất trong thời gian 1 giây, thường dùng là nanokatal (nK).
^ Kết quả;
A X 10'^ X 209 X 10^ X B nK =
23600 x t x V Trong đó;
- A (mg) : Số mg casein bị thủy phân. A = Aca chất + Achứng - Athử và Acc chất,
Achứng, Athử được xác định theo biểu đồ mẫu.
- B : Độ pha loãng của dịch enzym (10 lần).
- 23600 ; Trọng lượng phân tử casein (tính theo gam). - 209 : Số liên kết peptid của một phân tử casein.
-1: thời gian phản ứng thủy phân (1800 giây =^30 phút). - V : Lưọng mẫu đem thử (0,1 ml).
- Xây dựng biểu đồ mẫu để định lượng protein bằng phản ứng Biuret:
Cân l,00g Albumin bò tinh khiết, hòa tan với dung dịch NaCl 9%0 vừa đủ lOOml để có dung dịch 1%. Từ dung dịch này ta thực hiện phản ứng theo bảng sau:
Bảng 2.2. Cách tiến hành để xây dựng biểu đồ mẫu
Thuốc thử (ml) Ổng nghiệm
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
DD Albumin 1% 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
DD NaCl 0,9% 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0
Thuốc thử Gornall 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
21
^ Kết quả thu được:
Bảng 2.3. Kết quả sau khi xây dựng biểu đồ mẫu
c'^protein (mg/ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 D 0,04 0,088 0,132 0,180 0,225 0,274 0,315 0,363 0,408 0,455 Hệ số protein K Cprotein (mg/ml) D 10 g K i Ktb - = 4,05 10 Nồng độ protein = Ktb ^ D
2.3.2. Xác định hoạt độ amylase: p p King [12].
* Nguyên tắc: Huyết thanh được ủ với cơ chất là tinh bột. Lượng tinh bột còn lại tác dụng với iod cho màu xanh. So sánh với một ống cơ chất có tinh bột
nhưng không có amylase, sự giảm độ đậm màu cho biết về hoạt độ amylase.
Tiến hành: Pha loãng huyết thanh gấp 10 lần bằng NaCl 9%0. Lấy 2 ống nghiệm. Cho các chất vào 3 ống theo bảng sau:
4- Ống thử cho Iml dung dịch cơ chất tinh bột rồi để cách thủy 37”c. Sau 3 phút cho thêm 0,1 ml huyết thanh đã pha loãng. Trộn đều rồi ủ đúng 15 phút. Lấy ống ra khỏi nồi cách thủy, thêm 0,4 ml dung dịch iod 0,0 IN. Trộn đều rồi thêm 8,5 ml nước. Lại trộn đều.
4- Ống cơ chất cho lần lượt Iml dung dịch cơ chất tinh bột, 8,6 ml nước và 0,4 ml iod 0,0 IN.
22
^ Ống trắng lần lượt cho 0,1 ml huyết thanh, 0,4ml dung dịch iod 0,0 IN và 9,5 ml nước cất. Trộn đều.
4- Soi màu ngay lập tức cả 3 ống trên ở 660 nm.
Đon vị: Một đơn vị amylase là lượng enzym thủy phân 5 mg tinh bột trong điều kiện 37°c.
Kết quả; Trong phương pháp này, ống đối chứng chứa 0,4 mg tinh bột. Lượng tinh bột đã được thủy phân trong ống nghiệm:
Eđối chứng “ Ethừ
Lưọng tinh bột đã thủy phân = --- X 0,4 mg
Eđố i chứng
(Eđối chứng “ Ethử)x0,4 Lượng enzym có trong 0,01mlmáu = ---
Eđối chứng X 5
(Eđóichứng- Ethử) 0 , 4 1 0 0
Lượng enzym có trong lOOml dịch tụy = --- X --- X ---
chiing 5 0,01
Eđối chứng ■ Ethử
HđA = --- X 800 (ĐV amylase/100 ml)
Eđối chứng
Trong đó; HđA : Hoạt độ amylase; Eđối chứng : Mật độ quang của ống cơ chất;
23
2.3.3. Xác định hoạt độ lipase: p p Bondỉ [12]
Nguyên tắc: Lipase xúc tác thủy phân trên dầu ô liu giải phóng ra các acid béo. Các acid này được chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N với sự có mặt của ethanol.
^ Tiến hành:
Cho vào bình nón 250 ml có nút mài gồm:
Dịch enzym pha loãng 1% Iml
Dầu ô liu lOml
Lắc thật đều trong 5 phút để nhũ tương hóa, đặt trong tủ ấm 37°c trong 1 giờ. Cho vào bình nón ethanol 95%, 2-3 giọt thuốc thử phenolphtalein và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng bền vững (lắc mạnh mà vẫn còn màu). Ghi số thể tích Vt ml NaOH 0,1N đã dùng.
Nếu sau khi lắc xuất hiện bọt bền vững là do có sự phân li một phần xà phòng kiềm khi định lượng và màu phenolphtalein chuyển qua sớm. Cho thêm ethanol để làm mất màu rồi nhỏ tiếp dung dịch NaOH 0,1N cho tới khi màu hồng xuất hiện lại (cần không có bọt bền vững).
Song song làm một bình chứng gồm:
Dung dịch NaCl 9%0 Iml
Dầu ô liu 10 ml
Tiến hành như đối với bình thử. Ghi số Vc ml NaOH đã dùng.
^ Kết quả: Hoạt độ lipase (HđL) tính theo đơn vị Bondi là số ml dung dịch NaOH 0,1N dùng để trung hòa hết lượng acid béo giải phóng ra khi cho lipase tác dụng với cơ chất dầu ô liu.
HđL = Vt - Vc (đơn vị Bondi)
Trong đó: - V t: số ml dung dịch NaOH 0,1N tiêu thụ hết ở bình thử. - V c: số ml dung dịch NaOH 0, IN tiêu thụ hết ở bình chứng.
24