Có những lý do dưới đây để chúng tôi quyết định tiến hành định lượng 3 enzym protease, lipase và amylase trong máu của BN VTM đó là:
Chức năng chính của tuyến tỊiy là sản xuất enzym tiêu hóa: protease, lipase và amylase. Trong quá trình tiêu hóa thức ăn thì các enzym tiêu hóa của tuyến tụy đóng một vai trò chính [2], [24],
ở điều kiện sinh lý các enzym này có hoạt độ như sau: araylase là < 22 đơn vị/lOOml; lipase là < 2,67 đơn vị Bondi [4]; Và trong trường hợp bệnh lý viêm tụy thì đều dẫn đến tăng lượng enzym trong máu. Trong các nghiên cứu về VTC đã khẳng định: Chẩn đoán VTC thưÒTig dựa vào tăng amylase trong huyết thanh. Và khi mức tăng trên 3 lần so với bình thường, thường là chỗ dựa vững chắc cho chẩn đoán. Hoạt tính lipase máu cũng tăng song song với tăng hoạt tính của amylase trong bệnh VTC [1]. Như vậy những chỉ số enzym này trong máu đã được sử dụng trong chẩn đoán và điều trị VTC, chính vì vậy chúng tôi đã đặt ra câu hỏi liệu rằn? trong VTM thì các enzym này có ứng dụng vào trong chẩn đoán và điều trị bệnh này hay không?
32
Trên thế giới cũng đã có một số nghiên cứu về các enzym tụy này nhưng chủ yểu là định lượng các protease tụy riêng biệt như trypsin: Đo trypsin trong huyết thanh bằng thử nghiệm miễn dịch phóng xạ bởi các nhà khoa học Anh năm 1981 [17]. Hoặc đo trypsin theo phương pháp test Lundh. Ngoài ra cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật hoạt độ trypsin trong huyết thanh còn được đo bằng pp xét nghiệm miễn dịch phóng xạ đặc biệt [23], Tuy nhiên các nhà khoa học đã khẳng định nồn? độ trypsin phản ứng miễn dịch trong huyết thanh có độ đặc hiệu và độ nhạy thấp với các bệnh tụy và không phản ánh mức độ thiếu hụt chức năng ngoại tiết ở những bệnh nhân VTM thực sự. Chymotrypsin thường được đo trong phân vì ít sai số nhất, song sự biến thiên giá trị của nó lại rất lón và không được thực hiện ở người lớn [17]. Elastase-1 tụy trong phân: là một xét nghiệm đơn giản để phát hiện VTM tính vôi hóa mức độ nặng và vừa. Ngược lại với Chymotrypsin, enzym này không bị giáng hóa khi lưu thông trong ruột non và cũng không bị làm giả bởi những liệu pháp enzym tụy trùng hợp. Nó là xét nghiệm ban đầu hữu ích trong chẩn đoán phân biệt rối loạn hấp thu kèm theo khi VTM tiến triển, và cho biết nhu cầu bổ sung enzym.
Tại Việt nam, thực tế VTM không phải là một bệnh hiếm gặp nhưng bệnh lý này lại chưa được quan tâm, chú ý bởi cả thầy thuốc lẫn người bệnh. Chính vì vậy có rất ít các nghiên cứu về cả 3 enzym này trên BN VTM. Năm 2000, Trần Văn Huy và Hoàng Trọng Thảng đã tiến hành nghiên cứu và cho biết chỉ số amylase máu tăng 76% trên tổng số các BN [8]. Năm 2004, Nguyễn Hữu Phương và cộng sự đã đánh giá 15 trường họp VTM được chẩn đoán và phẫu thuật tại bệnh viện Đà Nang thì chỉ số amylase máu tăng 12/15 trường hợp. Cũng năm 2004, Phạm Tiến Đạt và Hà Văn Quyết tổng kết 36 trường hợp phẫu thuật sỏi tụy tại Bệnh viện Việt Đức thì cho thấy chỉ số amylase máu tăng 50% [8], [9]. Trần Hiếu Học năm 2006 xét nghiệm amylase máu chỉ nhận thấy có 21 trường hợp tăng nhẹ còn 40 trường hợp bình thường. Tác giả Lê Văn Cưòmg năm 2008 cũng báo cáo kết quả amylase trong máu và nước tiểu chỉ phát hiện 28/49 trường hợp tăng cao [3], [8]. Tuy vậy cũng chưa có một nghiên cứu sâu rộng nào về 3 enzym này trong máu của BN
33
VTM để có được những kết luận chi tiết hơn, sâu sắc hơn về hoạt độ 3 enzym này trong máu với bệnh VTM.
Từ trước tới nay việc nghiên cứu các cơ quan, tổ chức nằm sâu trong cơ thể người là hết sức khó khăn. Các nghiên cứu thường chỉ thực hiện trên động vật (chuột, thỏ, chó...) từ đó suy diễn, quy nạp cho người. Vì vậy việc lấy máu đofn giản và dễ thực hiện hơn rất nhiều so với việc phẫu thuật để lấy mẫu dịch tụy. Trong nghiên cứu này, nhờ có các bác sỹ tại khoa phẫu thuật tiêu hóa, Bệnh viện Việt Đức - bệnh viện đầu nghành về ngoại khoa của Việt Nam mà chúng tôi đã lấy được những mẫu máu của các BN VTM được điều trị phẫu thuật tại khoa để việc tiến hành nghiên cứu thuận lợi hoTi và cho kết quả chính xác hơn.
Vì vậy chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu định lượng 3 enzym quan trọng nhất của tuyến tụy trona máu để đánh giá chức năng tụy ngoại tiết và từ đó đưa ra những tham số có tính chất tham khảo hỗ trợ cho việc chẩn đoán và điều trị VTM. Ngoài ra chúng tôi cũng muốn xác định: trong VTM thì hoạt độ enzym tụy trong máu có tăng lên không và tăng lên bao nhiêu lần so với giá trị của người bình thường.
3.4.2. v ề lựa chọn phương pháp xác định hoạt độ enzym tụy trong máu.
^ Protease:
^ Định lượng trypsin trong máu bằng pp GOWENLOCK và pp
GAULTIER; định lưọng protease bằng pp cân theo PLEURY: Đều là những pp tuy đơn giản về nguyên tắc nhưng khá tỉ mỉ trong khâu tiến hành, sai số cao do phụ thuộc nhiều vào từng người tiến hành thí nghiệm cho nên chúng tôi đã không áp dụng vào phần thực nghiệm trong nghiên cứu này.
^ Định lượng protease sử dụng kỹ thuật miễn dịch liên kết men ELISA: Đây là pp định lượng protease có độ nhạy cao hiện nay [18]. Nhưng pp này sử dụng các thiết bị hiện đại mà phòng thí nghiệm thông thường như trường ta không có nên chúng tôi không thể áp dụng pp này để xác định hoạt độ enzym trong máu của BN VTM. Ngoài ra trên thế giới hiện nay chủ yếu sử dụng những bộ kit có sẵn cho kết
34
quả nhanh chóng, chính xác gần như tuyệt đối: kit đo hoạt độ trypsin (hãng RIAgnost, Hoechst), đo elastase theo phản ứng miễn dịch liên kết men ELI SA (ScheBoTech, Wettenberg, Đức và Bioserv Diagnostics, Rostock, Đức), đo chymotrypsin (Boehringer, Mannheim, Đức) [18], [20], [22],[26]. Nhưng những pp này chúng tôi không áp dụng được vào nghiên cứu vì phòng thí nghiệm của chúng tôi chưa được trang bị những thiết bị đó.
^ Lipase:
Định lưọng lipase huyết thanh bằng pp TIETZ, pp SAIFE và PERLE, pp NATELSON, pp TIETZ và BORDER đều là những pp dựa trên nguyên lí chung là lipase tác dụng lên cơ chất, giải phóng ra acid béo tự do và được chuẩn độ bằng dung dịch NaOH để xác định được hoạt độ lipase trong huyết thanh tuy nhiên chúng tôi không áp dụng do độ chính xác không cao mặc dù đơn giản và rất dễ áp dụng.
Trên thế giới hiện nay thường sử dụng bộ kit công nghiệp; kit Marupi (Marupi, Osaka, Nhật Bản) hay "PP đo quang " sử dụng kit của hãng Biosystem để xác định hoạt độ lipase tuy cho kết quả nhanh và chính xác nhưng trang thiết bị khá là hiện đại và những phòng thí nghiệm thông thường đều chưa được trang bị. Chính vì vậy chúng tôi không thể áp dụng pp này vào trong nghiên cứu.
Amylase;
^ Định lượng amylase huyết thanh bằng pp WOHLGEMUTH và pp FENNEL đều là những pp đơn giản nhưng độ chính xác không cao nên chúng tôi không sử dụng vào trong nghiên cứu này.
Một khó khăn mà pp tạo đưòng để định lượng amylase mắc phải khi sử dụng cơ chất tinh bột là kết quả thu được luôn có sự khác nhau, pp đo màu là pp đơn giản, có độ nhạy cao, thích họrp với những máy theo dõi tình hình bệnh liên tục, rất tự động, tiện lợi hiện đang ngày càng trở nên phổ biến. “PP chuẩn tối tni" sử dụng kit của hãng La Roche cũng dựa trên nền tảng của pp này. Tuy nhiên chúng tôi không áp dụng được vì thiếu thiết bị để tiến hành thí nghiệm.
35
Chúng tôi đã cố gắng tìm tòi và lựa chọn được những pp thích hợp nhất để đo hoạt độ protease, lipase và amylase trong máu của BN VTM đó là:
'íỉ> pp xác định hoạt độ protease dựa trên phản ứng Biuret là một pp cơ bản được áp dụng rộng rãi trong rất nhiều nghiên cứu từ trước tới nay. pp này có ưu điểm là sử dụng những hóa chất sẵn có, máy đo mật độ quang thông thường đặc biệt là kết quả tính được theo đơn vị quốc tế (nK). Điều này rất có ý nghĩa vì nó có thể tránh được những nhầm lẫn khi kết quả này được so sánh với các nghiên cứu theo pp khác, hoặc giữa những người tiến hành cùng một pp nhưng lại tính toán theo những cách khác nhau.
pp Bondi dựa trên tính chất tiêu hóa mỡ của lipase giúp chúng tôi dễ dàng xác định được hoạt độ lipase, pp này định lượng gián tiếp, kết quả sẽ tính thành ml NaOH đã dùng. Đây là pp đơn giản, dễ làm, không khó khăn trong việc tính toán kết quả cũng như tìm kiếm chỉ số hoạt độ lipase ở người bình thường. Chỉ bằng những thao tác kỹ thuật chuẩn độ thông thường, cùng với những trang thiết bị sẵn có tại phòng thí nghiệm, chúng ta hoàn toàn có thể xác định được giá trị hoạt độ của lipase, ở đây người ta cũng có thể sử dụng hỗn dịch dầu ôliu ổn định (0,2g natri benzoat và 7g gôm arabic trộn kỹ. Sau đó vừa cho từ từ vừa trộn đều 93ml dầu ôliu. Cho quấy trong máy đồng thể hóa từ 10 - 15 phút để tạo thành hỗn dịch) để thay thế cho dầu ôliu thông thưÒTig. Mặt khác ta cũng có thể dùng máy chuẩn độ tự động để kết quả thu được nhanh chóng và chính xác hơn, tránh được sai số.
pp King xác định hoạt độ amylase thì không quá phức tạp. Đây là pp amyloclastic, đo sự thủy phân cơ chất tinh bột của amylase thông qua iod. pp về cơ bản tương tự như pp của Pimstone (1954), Caraway (1963) và Gomori (1964), hiện vẫn là nền tảng cho những pp công nghiệp, hiện đại tại các phòng thí nghiệm lớn trên thế giới. Đơn vị hoạt độ amylase là không phải là một đơn vị tiêu chuẩn quốc tế như katal hay IU nhưng thực tế những thí nghiệm về hoạt độ enzym chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố như nhiệt độ, pH, thời gian đo, điều kiện ủ...Không thể tiêu chuẩn hóa tất cả sự khác nhau này, do đó đơn vị hoạt độ enzym thường được quy
36
ước trong những phạm vi nhất định. Đây cũng được xem như một nguyên tắc đã được quốc tế hóa.
Ba phương pháp xác định hoạt độ protease, lipase và amylase mà chúng tôi đã lựa chọn có thể chưa phải là chuẩn xác nhất nhưng là phù hợp và tối ưu nhất trong điều kiện còn nhiều khó khăn, hạn chế tại phòng thí nghiệm của bộ môn Hóa sinh - Trường Đại học Dược, Hà nội. HoTi thế nữa, các pp này cũng có thể dễ dàng được triển khai tại bệnh viện và nhiều phòng thí nghiệm tại Việt Nam. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.4.3. v ề kết quả hoạt độ protease, lipase, amylase trong máu của BN VTM
Hoạt độ các enzym thủy phân protein - protease máu của BN VTM trên người bình thường là rất khó xác định. Chúng tôi đã tham khảo nhiều tài liệu, tạp chí có uy tín trên thế giới, hay tham khảo ý kiến các chuyên gia trong lĩnh vực này nhưng vẫn chưa có được chỉ số này ở người bình thường. Điều này có lẽ nên hiểu rằng ở các nước tiên tiến, người ta thường xác định cụ thể một protease như trypsin, chyniotrypsin, elastase - 1...trong huyết thanh mà ít khi xác định protease chung trong máu của BN VTM như nghiên cứu của chúng tôi. Trần Văn Huy và Hoàng Trọng Thảng nhận xét về bệnh nguyên và đặc điểm bệnh lí VTM qua các trường hợp tại bệnh viện Huế cũng cho biết chỉ số amylase máu tăng 76% trên tổng số các BN [7]. 2004, Nguyễn Hữu Phương và cộng sự đã đánh giá 15 trường họp VTM được chẩn đoán và phẫu thuật tại bệnh viện Đà Nang thì chỉ số amylase máu tăng 12/15 trường hợp. Và các tác giả cũng khẳng định thêm rằng việc chẩn đoán VTM khi chưa có biến chứng ở bệnh viện Đà Nằng là rất khó khăn vì ở đây chưa có một xét nghiệm nào đánh giá chức năng tụy. Cũng năm 2004, Phạm Tiến Đạt và Hà Văn Quyết tổng kết 36 trường hợp phẫu thuật sỏi tụy tại Bệnh viện Việt Đức thì cho thấy chỉ số amylase máu tăng 50% [8], [9].
Trần Hiếu Học năm 2006 đã nghiên cứu 58 trường họp được chẩn đoán là sỏi tụy tại Bệnh viện Bạch Mai, xét nghiệm amylase máu chỉ nhận thấy có 21 trường hợp tăng nhẹ còn 40 trường hợp bình thường. Tác giả đã cho rằng có lẽ amylase máu chỉ nên dùng để đánh giá viêm tụy cấp còn VTM thì cấu trúc ngoại
37
tiết đã bị phá hủy nặng nên không thể tổng hợp một lượng lớn enzym như viêm tụy cấp. Song đây cũng coi như một định hướng để thăm khám kĩ lưỡng hon [8].
Tác giả Lê Văn Cường năm 2008 cũng báo cáo về kết quả phẫu thuật của 49 BN VTM tại Bệnh viện Bình Dân. Theo đó, kết quả amylase trong máu và nước tiểu chỉ phát hiện 28/49 trường họp tăng cao và nhận định rằng nếu trong VTM không cố viêm tụy cấp kết hợp thì amylase có thể trong giới hạn bình thường [6].
Bởi vậy chúns; tôi chỉ có thể đưa ra được giá trị trung vị về hoạt độ protease là 86,0 nK/ml, lipase là 4,5 đơn vị Bondi, amylase là 95 đơn vị/lOOml ở nhóm BN VTM trong nghiên cứu này. Rất khó để đưa ra những kết luận về chức năng tụy ngoại tiết ở BN VTM. Tuy nhiên kết quả hoạt độ lipase thu được cho thấy có 36,8% số BN nằm trong giới hạn của người bình thường, 63,2% là cao hơn giá trị của người bình thường. Như vậy khi bị VTM không phải hoạt độ lipase trong máu của tất cả các BN đều đã tăng. Trong khi kết quả hoạt độ amylase thu được cho thấy chỉ có 7,9% số BN nằm trong giới hạn của người bình thường trong khi có đến những 92,1% số BN có hoạt độ amylase trong máu cao hơn giá trị của người bình thường. Như vậy, trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi chỉ có thể sơ bộ kết luận ràng, trong số 38 BN VTM: HđL/máu cao hơn của người bình thường thì có 24 BN (63,2%); HđA/máu cao hofĩi của người bình thường thì có 35 BN (92,1%). Song để có thể đánh giá, kết luận chính xác hơn cần tiến hành với số lưọng BN lớn hơn, và cần tiến hành nghiên cứu định lượng lại 3 enzym này trong máu của các BN trong nghiên cứu này để tìm được mối liên hệ giữa tình trạng bệnh lý VTM và sự thay đổi hoạt độ enzym tụy ngoại tiết trong máu.
3.4.4. v ề ý nghĩa tiến hành nghiên cứu
Nghiên cứu của chúng tôi về hoạt độ 3 enzym quan trọng nhất của dịch tụy trong máu của BN VTM có ý nghĩa vô cùng to lớn:
- Góp phần cùng các biện pháp chẩn đoán hình ảnh, thăm khám lâm sàng đánh giá được phần nào chức năng tụy ngoại tiết trong máu của BN VTM.
38
Góp phần cung cấp những thông số tham chiếu có tính chất tham khảo về hoạt độ enzym tụy trong máu của BN VTM.
Chúng tôi hy vọng nghiên cứu của chúng tôi tạo tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn, rộng hơn, toàn diện hơn sau này trong việc tìm mối liên hệ giữa tình trạng bệnh lý VTM và sự thay đổi hoạt độ enzym tụy ngoại tiết trong máu của BN.
39
KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ KÉT LUẬN
1. Đã xác định được hoạt độ 3 nhóm enzym trong máu của 38 BN VTM. Giá trị trung vị về: - Hoạt độ protease là 86,0 nK/ml, khoảng tin cậy 95% của trung vị là 86,0 ± 23,9 nK/m l.
- Hoạt độ lipase là 4,5 ĐV Bondi, klioảng tin cậy 95% của trung vị là 4,5 ± 4,9 ĐV Bondi.
- Hoạt độ amylase là 95 đơn vị/lOOml, khoảng tin cậy 95% của trung vị là 95 ± 74,1 đơn vị/lOOml.
2. Trong nghiên cứu của chúng tôi, hầu hết các hđE/máu của BN VTM là cao hơn giá trị trung bình của người bình thường. Cụ thể: