Chiết tách tinh chế tạo chế phẩm protease từ chủng mucor hiemalis để ứng dụng trong dược và thực phẩm chức năng

Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI v ủ MẠNH CHIÉT TÁCH TINH CHỂ TẠO CHÉ PHẨM PROTEASE TỪ CHỦNG MUCOR HIEMALIS ĐẺ ỨNG DỤNG TRONG Dược VÀ THựC PHẨM CHỨC NĂNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Nguyễn Xuân Thành 2. ThS. Nguyễn Thị Loan Nơi thực hiện: 1. Bộ môn hóa sinh 2. Bộ môn công nghiệp Du’Ọ'c HÀ NỘI - 2010 _________________ * LỜI CẢM OfN Với lòng kỉnh trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xỉn phép được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô: PGS.TS. Nguyễn Xuân Thành TS. Nguyễn Văn Rư ThS. GVC. Nguyễn Thị Loan Là những thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Đồng thời tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Hóa sinh, bộ môn Vi sinh - Công nghiệp dược - trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tội trong quá trình thực hiện đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo cùng toàn thể các cán bộ trưòng Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình dạy bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình năm năm tôi được học tại đây. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè, những người đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này. Hà Nội, ngày 8 tháng 05 năm 2010 Sinh viên Vũ Mạnh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Đại cưong về protease 2 1.1.1. Khái niệm protease 2 1.1.2. Phân loại protease 2 1.1.3. Protease nguồn gốc động vật 4 1.1.4. Protease thực vật 5 1.1.5. Protease vi sinh vật 6 1.2. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật và chiết tách, tinh chế protease ngoại bào 13 1.2.1. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật 13 1.2.2. Thu nhận và tinh chế protease ngoại bào 14 1.3. Tổng quan về Mucor hiemalỉs 18 Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚXJ 20 2.1. Nguyên vật liệu, thiết b ị 20 2.1.1. Nguyên vật liệu 20 2.1.2. Dụng cụ máy móc 21 2.2. Nội dung nghiên cứu 21 2.2.1. Nuôi cấy Mucor hiemalis 21 2.2.2. Tách chiết và tinh chế protease từ dịch nuôi cấy 22 2.2.3. Định lượng protein - enzym và xác định hoạt độ protease dựa trên nguyên tắc của phản ứng Biuret 22 2.3. Phương pháp thực nghiệm 22 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy 22 2.3.2. Phương pháp chiết tách và tinh chế protease từ môi trường nuôi cây Mucor hỉemalis 23 Chương 3. THựC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31 3.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng protein 31 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng họp protease của Mucor hỉemalis 32 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ Saccharose trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp protease của Mucor hiemalis 33 3.4. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt độ của protease Mucor hiemalis 35 3.5. Các giai đoạn chiết tách và tinh chế protease từ môi trường nuôi cấy Mucor hiemalỉs 37 3.5.1. Giai đoạn thu nhận protease từ dịch nuôi cấy bằng (NH4)2S04 ở nồng độ 85% bão hòa 37 3.5.2. Giai đoạn tinh chế protease bằng cồn tuyệt đối 37 3.6. Bàn luận 39 3.6.1. Nuôi cấy Mucor hỉemalis 39 3.6.2. về chiết tách và tinh chế protease từ dịch nuôi cấy Mucor hiemalis 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42 VSV: Vi sinh vật. PDA : Môi trường thạch khoai tây và dextrose. SK: Sinh khối. TT: Thuốc thử. bh: Bão hòa. C: Nồng độ. [protein]: Nồng độ protein. P: Khối lượng protein bị thủy phân. HđP: Hoạt độ protease. HđP riêng: Hoạt độ protease riêng. K tb i Hệ số K trung bình. HđP %: Hoạt độ protein tính theo %. HđP riêng: Hoạt độ riêng của protein (nK/mg hoặc nK/ml). Kat: Đơn vị hoạt độ protease (1 Katal = 1 mol/s). DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẲT Bảng 1.1. Tên và nguồn gốc một số chế phẩm protease Bảng 1.2. Một số tính chất của protease v sv Bảng 1.3. Một số v sv có khả năng tổng hợp mạnh protease Bảng 1.4. Những phương pháp sắc ký Bảng 1.5. Hệ thống phân loại khoa học của Mucor hiemalis Bảng 3.1. Ket quả xây dựng đượng chuẩn casein Bảng 3.2. Hoạt độ protease ngoại bào của Mucor hiemalỉs được nuôi cấy trong các môi trường có nồng độ NaCl khác nhau Bảng 3.3. Hoạt độ protease ngoại bào của Mucor hiemalỉs được nuôi cấy trong các môi trường có nồng độ Saccharose khác nhau Bảng 3.4. Hoạt độ protease ở các pH khác nhau Bảng 3.5. Hoạt độ protease ở các nhiệt độ khác nhau Bảng 3.6.Tóm tắt quá trình chiết tách và tinh chế protease từ dịch nuôi cấy Mucor hiemalis DANH MỤC CÁC BẢNG Hình 2.1. Sơ đồ quy trinh chiết tách protease từ dịch nuôi cấy Mucor hiemalỉs Hình 3.1. Đồ thị tương quan giữa nồng độ protein và mật độ quang Hình 3.2. Ảnh hưởng cùa nồng độ NaCl đến khả năng sinh protease Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ Saccharose đến khả năng sinh protease Hình 3.4. Ảnh hưởng của pH đến HđP Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến HđP DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, Đ ồ THỊ ĐẶT VẤN ĐÈ Protease là loại enzym đã và đang được dùng rất phổ biến trong các lĩnh vực khác nhau của đời sống như: công nghiệp chế biến, nông nghiệp, y dược. Khoa học càng phát triển thì càng tìm thấy nhiều ứng dụng của protease, vì vậy việc nghiên cứu phát hiện thêm các protease mới có những đặc tính đặc biệt phục vụ cho lợi ích của con người vẫn đang thu hút được sự quan tâm đặc biệt của đông đảo các nhà khoa học. Protease được thu nhận từ ba nguồn là: động vật, thực vật và vi sinh vật. Trong các nguồn đó, nguồn vi sinh vật giữ vai trò đặc biệt quan trọng. Nguồn enzym này đang dần dần thay thế enzym từ động vật và thực vật do hàng loạt nhưng ưu điểm về sinh lý vi sinh vật và kỹ thuật sản xuất [8]. Hiện nay, hầu hết các enzym ứng dụng trong công nghiệp đều do vi sinh vật tạo ra [3\ Mucor hiemalis là chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng họp protease ngoại bào mạnh. Protease của Mucor hỉemalis đã và đang cung cấp những giá trị thưong mại to lớn. Để góp phần nâng cao khả năng sinh tổng hợp và thu nhận, tinh chế protease từ Mucor hiemalỉs chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, tinh chế, tạo chế phẩm Protease của chủng Mucor hiemalis ứng dụng trong dược và thực phẩm chức năng”, với các mục tiêu: - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thành phần môi trường đến khả năng sinh tống hợp protease ngoại bào của Mucor hiemalis. - Chiết tách, tinh chế protease từ dịch nuôi cấy Mucor hỉemalis. - Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt độ của protease thu nhận được. Chương 1. TỎNG QUAN 1.1. Đại cương về protease 1.1.1. Khải niệm protease Ngày nay, danh từ Protease dùng để chỉ những enzym xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptid (giữa các L - acid amin) trong chuỗi polypeptid hoặc trong phân tử protein thành các peptid phân tử thấp và các L - acid amin. Protease còn gọi là proteinase hoặc peptidase hoặc c - N hydrolase. Phản ứng thủy phân liên kết peptid có xúc tác của protease không cần cung cấp năng lượng từ bên ngoài [10\ 1.1.2. Phân loại protease 1.1.2.1. Dựa vào nguồn gốc phát sinh, người ta chia protease thành 2 nhóm\ - Frotase nội bào (enzym ở trong tế bào) ví dụ cathepsin chứa trong các bào quan (lysosom). - Protease ngoại bào (enzym được xuất tiết ra khỏi tế bào vào môi trường xung quanh) như các enzym của đường tiêu hóa (pepsin, trypsin v.v ). 1.1.2.2. Dựa vào vị trí tác dụng đặc hiệu với cơ chất, protease cũng cỏ thể chia thành 2 loại: -Endopeptiđase: enzym thủy phân liên kết peptid ở phần giữa mạch polypeptid. - Exopeptidase: enzym phân cắt liên kết peptid ở đầu mạch polypeptid. 1.1.2.3. Dựa vào pH tối ưu, người ta chia protease thành 3 loại: - Protease trung tính: ví dụ như papain, bromelain, ficin. - Protease acid: như pepsin, rennin. - Protease kiềm: như trypsin, a - chymotrypsin. 1.1.2.4. Dựa vào nhỏm chức trong trung tâm hoạt động của enzym Protease được chia ra thành 4 nhóm, tên của các nhóm này bao gồm tên của acid amin hoặc kim loại có vai trò quan trọng xúc tác trong trung tâm hoạt động: - Protease serin: ví dụ như trypsin, substilopeptidase ( EC. 3. 4. 21). -Protease cystein: ví dụ như papain, bromelain, ficin ( EC. 3. 4. 22). - Protease aspartic; VÍ dụ như pepsin, rennin ( EC. 3. 4. 23). - Protease chứa kim loại: ví dụ như carboxypeptidase, aminopeptidase. 1.1.2.5. Dựa vào nguồn thu enzym - Protease động vật. - Protease thực vật. - Protease vi sinh vật. -Protease nấm men [10]. [...]... lọc xác định hoạt độ protease và nồng độ protein 2.3.2 Phương pháp chiết tách và tinh chế protease từ môi trường nuôi cấy Mucor hiemalis Thực hiện chiết tách và tinh chế protease từ môi trường nuôi cấy Mucor hiemalis qua 3 giai đoạn: ■Giai đoạn 1: Thu nhận dịch nuôi cấy -Mucor hiemalis cấy vào môi trường thích hợp và được nuôi ở 30°c, trong 72 giờ, với tốc độ lắc là 140 vòng/phút 24 - Sau khi kết thúc... papain tinh khiết để tách mô tế bào [7]; tinh chế Chymotrypsin để điều chế thuốc tiêm (chống viêm, giảm phù nề) hoặc dùng trong nghiên cứu [15’ Protease có bản chất cấu tạo là protein do đó các phưoTig pháp tinh chế enzym cũng là các phương pháp tinh chế protein Nguyên lý tinh chế là dựa vào tính chất lý hóa của enzym Có ba phương pháp tinh sạch enzym đang được sử dụng nhiều trong nghiên cứu và trong. .. omnivorum 1.1.5.3 ứng dụng của protease vi sinh vật Các protease nói chung cũng như protease v s v nói riêng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp, nông nghiệp, y dược học, nghiên cứu khoa học Trong công nghiệp, protease được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm như: chế biến cá, thịt, sữa, trong quá trình làm bánh mỳ, trong công nghiệp nước giải khát và trong một... Hai Asp.tericola protease kiem protease: protease acid và Nấm Protease acid CÓ tác dụng làm đông mốc sữa Asp.Candidus Protease trung tính Protease kiềm Asp.ochraceus Hai protease: protease kiềm và protease trung tính Asp.sojae Protease acid Asp.ßavus Protease kiềm Pen.janthinellum Protease acid có tác dụng làm đông Pen.cyaneo fulvum sữa đã được dùng ở Nhật để thay thế Mucorpusillus cho rennin 11 Rh.chinensis... học đã phân loại các protease v s v thành 4 nhóm như sau: - Protease - serin - Protease - thiol - Protease - kim loại - Protease - acid Một so tác giả khác chia protease ra làm 3 nhóm dựa vào pH hoạt động của chúng bao gồm: - Protease - acid - Protease - trung tính - Protease - kiềm Trong 4 nhóm protease kể trên, các protease - serin và protease - thiol có khả năng phân giải ester và liên kiết amid của... lạp xường Trong quá trình chế biến sữa: chủ yếu sử dụng các protease có tác dụng làm đông sữa như: rennin, pepsin và một số protease v s v khác trong quá trình sản xuất phomat Khi sử dụng protease, phomat sẽ nhanh chín, nâng cao được chất lượng và có thể tạo ra được nhiều loại phomat khác nhau Trong công nghiệp nước giải khát, protease được sử dụng làm trong quy trình làm bia và nước hoa quả, ở đây nó... phản ứng Biuret - Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt độ protease chiết tách được từ dịch nuôi cấy Mucor hỉemalis - Định lượng protein - enzym và xác định hoạt độ protease của các sản phẩm sau các giai đoạn chiết tách, tinh chế 2.3 Phương pháp thực nghiệm 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy ■ Cấy truyền giống ra thạch nghiêng Pha lOOml môi trường thạch nghiêng, đun cho thạch tan ra Phân phối thạch vào... protein trong thức ăn của động vật, hoặc sử dụng để sản xuất các dịch thủy phân giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm Trong công nghiệp dược phẩm và y học, protease được sử dụng để sản xuất các thuốc làm chữa nghẽn tĩnh mạch, tăng khả năng tiêu hóa protein của những người bị bệnh tiêu hóa kém do dạ dày, tụy tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzym Protease cũng được sử dụng để phân giải... giải sâu sắc hơn tạo thành các acid amin 13 Sử dụng các phương pháp khác nhau để tiến hành nghiên cứu cấu trúc phân tử protein [18],[20] 1.2 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật và chiết tách, tinh chế protease ngoại bào 1.2.1 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật Để có chế phẩm protease từ v s v cũng như các enzym khác có thể dùng hai phương pháp nuôi cấy: phương pháp bề mặt (phương pháp nổi) và phương pháp... thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy Một số protease ngoại bào đã sản xuất quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, trong nông nghiệp và trong y học [8 ] Các loài VSVcó khả năng tổng mạnh protease được trình bày ở bảng 1.3 Bảng 1.3 Một số v s v có khả năng tổng ho’p mạnh protease [8] Vi sinh vât Bac.subtilispha Ghi chú Protease trung tính, protease . hợp và thu nhận, tinh chế protease từ Mucor hiemalỉs chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, tinh chế, tạo chế phẩm Protease của chủng Mucor hiemalis ứng dụng trong dược và thực phẩm. YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI v ủ MẠNH CHIÉT TÁCH TINH CHỂ TẠO CHÉ PHẨM PROTEASE TỪ CHỦNG MUCOR HIEMALIS ĐẺ ỨNG DỤNG TRONG Dược VÀ THựC PHẨM CHỨC NĂNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ Người hướng. 3.6.Tóm tắt quá trình chiết tách và tinh chế protease từ dịch nuôi cấy Mucor hiemalis DANH MỤC CÁC BẢNG Hình 2.1. Sơ đồ quy trinh chiết tách protease từ dịch nuôi cấy Mucor hiemalỉs Hình 3.1.