■ Cấy truyền giống ra thạch nghiêng
Pha lOOml môi trường thạch nghiêng, đun cho thạch tan ra. Phân phối thạch vào các ống, mỗi ống 5 - 6ml, đậy kín miệng ổng bằng nút bông sạch. Khử trùng các ống bằng nồi hấp ở 121°c, latm, trong 15 phút. Sau đó để thạch đông ở vị trí nghiêng 45”.
Khử trùng tủ cấy bằng cách lau cồn 96“ và chiếu tia ư v trong 30 phút trước khi sử dụng, cấy giống chuẩn vào các ống thạch nghiêng. Đặt các ống thạch nghiêng trong tủ ấm 30°c. Sau 2 - 3 ngày có thể dùng giống nấm trong các ống thạch để nuôi cấy. Bảo quản ống giống chuẩn trong tủ lạnh 4”c và các ống thạch nghiêng trong tủ ấm 30°c.
■ Nuôi cấy trên máy lắc
Pha môi trường lên men như công thức, phân phối môi trường vào các bình nón 250ml, mồi bình chứa 50ml môi trường, đậy kín miệng bình bằng
23
nút bông sạch. Khử trùng các bình nón bằng nồi hấp ở 121°c, latm, trong 30 phút, sau đó để bình nón nguội, cấy chủng giống trong ống thạch nghiêng vào các bình nón chứa môi trường ở trong tủ cấy đã khử trùng. Nuôi cấy trên máy lắc ổn định nhiệt ở 30°c, với tốc độ lắc là 140 vòng/phút.
2.3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaCl trong môi trường nuôi cấy đên sinh tổng hợp protease của Mucor hỉemalis
- Tiến hành pha các môi trường lên men có các nồng độ NaCl tương ứng là: 0; 0,25; 0,5; 075; 1; 1,25;1,5M.
- Cấy nấm vào các môi trường trên rồi nuôi trong điều kiện ở 30“c , tốc độ lắc là 140 vòng/phút, trong vòng 72 giờ.
- Sau khi nuôi cấy, lọc loại bỏ sinh khối, lấy dịch lọc xác định hoạt độ protease và nồng độ protein.
2.3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Saccharose trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp protease của Mucor hiemalis
- Tiến hành pha các môi trường lên men có các nồng độ Saccharose tương ứng là: 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4M.
- Cấy nấm vào các môi trường rồi nuôi trong điều kiện ở 30°c, tốc độ lắc là 140 vòng/phút, trong vòng 72 giờ.
- Sau khi nuôi cấy, lọc loại bỏ sinh khối, lấy dịch lọc xác định hoạt độ protease và nồng độ protein
2.3.2. Phương pháp chiết tách và tinh chế protease từ môi trường nuôi cấy Mucor hiemalis
Thực hiện chiết tách và tinh chế protease từ môi trường nuôi cấy Mucor hiemalis qua 3 giai đoạn:
■ Giai đoạn 1: Thu nhận dịch nuôi cấy
-Mucor hiemalis cấy vào môi trường thích hợp và được nuôi ở 30°c, trong 72 giờ, với tốc độ lắc là 140 vòng/phút.
24
- Sau khi kết thúc quá trình lên men, môi trường được lọc sơ bộ qua gạc, sau đó lọc qua giấy lọc để loại bỏ sinh khối.
- Bảo quản dịch lọc ở nhiệt độ 0 - 4°c.
■ Giai đoạn 2: Thu nhận protease bằng (NH4)2S0 4
* Nguyên tắc: (NH4)2S0 4 hòa tan và điện ly trong dung dịch tạo lực ion làm mất lớp áo nước và trung hòa điện tích của các protein do đó protein sẽ tích tụ lại và gây tủa [2].
* Cách tiến hành:
- Nghiền nhỏ (NH4)2S0 4 bằng chày cối sứ.
- Cho từ từ từng lượng nhỏ (NH4)2S0 4 vào dịch lọc vừa cho vừa khuấy để muối tan hết cho đến khi nồng độ (NH4)2S0 4 trong dịch lọc đạt 85% nồng độ bão hòa.
- Dịch lọc được để ở 4°c trong vòng 48 giờ.
-K ết tủa được thu nhận bằng cách ly tâm với tốc độ 15000 vòng/phút trong 20 phút ở 4°c.
-Kết tủa được hòa tan vào dung dịch đệm Citric - Phosphat pH 3 và khuấy trong vòng 30 phút ở nhiệt độ phòng.
-Nếu có phần không tan thì loại bỏ bằng cách ly tâm với tốc độ 15000 vòng/phút trong 30 phút ở 4°c. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
■ Giai đoạn 3: Tinh chế protease bằng cồn tuyệt đối
* Nguyên tắc: Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi của môi trường giảm xuống làm mất lớp áo nước và trung hòa điện tích của protein do đó protein bị tủa [2].
* Cách tiến hành
- Thêm cồn tuyệt đối ở 4°c vào dung dịch enzym với lượng cồn lớn gấp 1,5 lần thể tích dung dịch enzym. Đe kết tủa ở nhiệt độ 4°c trong 24 giờ.
25
- Thêm vào phần dịch lỏng 1,5 thể tích cồn tuyệt đối ở 4°c nữa. Để kết tủa ở nhiệt độ 4”c trong 24 giờ.
-Sau đó, kết tủa được thu nhận bằng cách ly tâm với tốc độ 15000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°c.
- Hòa tan tủa trong dung dịch đệm Citric - Phosphat pH 3.
Toàn bộ quy trình tách chiết và tinh chế protease tử dịch nuôi cấy Mucor hiemalis được thể hiện ở hình 2.1.
Sinh khối Dịch Tủa Dịch 26 Dịch nuôi cấy Mucor hiemalis Lọc qua giấy lọc Cho từ từ, khuấy ( N H 4 ) 2 S Ơ 4 Đến 85% bão hòa Để ở 4°c trong 48h Ly tâm 15000 vòng/phút X 20 phút ở 4°c Đệm pH 3
Dung dịch protease thô
Khuấy
Khuấy
1 Vg^oH tuyệt đối
Để ở 4°c trong 24h
Ly tâm 15000 vòng/phút X 20 phút ở 4°c.
Dịch lỏng 1 Vg^OH tuyệt đối
Khuấy Đe ở 4°c trong 24h
Ly tâm 15000 vòng/phút X 20 phút ở 4”c.
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình chiết tách và tỉnh chế protease từ dịch nuôi cấy Mucor hiemalỉs
27
2.1.3.3. Kỹ thuật định lượng protein bằng phản ủng Biuret
Các phương pháp định lượng protein thường hay dùng hiện nay là: Kjedahl, Biuret, Lowry, đo quang trực tiếp và phương pháp cân [10],[11].
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật định lượng protein bằng phản ứng Biuret (kỹ thuật Gomal).
■ Nguyên tắc:
Khi cho tác dụng với thuốc thử Gomal, protein (có liên kết peptid) tạo thành phức màu tím hồng. Đo quang phổ hấp thụ, so với biểu đồ mẫu để định lượng protein.
■ Tiến hành:
Xây dựng biểu đồ mẫu để định lượng protein bằng phản ứng Biuret. Dùng dung dịch protein đã biết nồng độ (casein 1%) làm dung dịch mẫu. Thêm dung dịch đệm pH 6,5 và thuốc thử Gornal vào ống đã chứa casein.
Ong 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Protein mẫu (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 Đệm pH 6,5 (ml) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 TT Gornal (ml) 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Lắc đều để ở nhiệt độ phòng 30 phút. Đo quang ở 550nm, cuvet Icm. Từ kết quả đo quang phổ hấp thụ của các dung dịch dựng biểu đồ nồng độ protein (mg/ml) - mật độ quang (D). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
28
Tính:
Các hệ số protein K j là tỷ lệ giữa nồng độ protein (C protein) và độ hấp thụ quang (D)
Nồng độ protein * M ật độ quang Tính hệ số trung bình Ktb
Công thức tính nồng độ protein theo mật độ quang:
Cprotein K-tb X D
Thực hiện phản ứng với Iml dung dịch thử. Dira vào biểu đồ mẫu xác định hàm lượng protein trong dung dịch.
2.1.3.4. Phương pháp xác định hoạt độ protease
Một số phương pháp xác định hoạt độ protease thường dùng hiện nay là phương pháp Anson, Anson cải tiến, Biuret hoặc Lawry. Cũng có thể có một số phương pháp riêng cho mỗi enzym trong đó sử dụng một cơ chất đặc hiệu, hoạt độ protease được xác định bằng lượng cơ chất còn lại hoặc sản phẩm được tạo thành [9],[10].
Trong để tài này, chúng tôi sử dụng phương pháp xác định hoạt độ protease là phương pháp Biuret.
■ Nguyên tắc:
Dưới tác dụng của enzym protease, protein bị thủy phân giải phóng các acid amin tan trong acid tricloacetic. Phần protein còn lại tủa trong acid tricloacetic. Tủa này phản ứng với thuốc thử Gomal tạo phức màu tím hồng. Đo quang ở 550nm, cuvet Icm. Dựa vào biểu đồ mẫu tính ra hoạt độ của enzym.
29
■ Tiến hành:
Pha ioãng enzym đến nồng độ thích hợp bằng dung dịch đệm thích hợp. Sử dụng cơ chất là casein 1%. Cho vào 3 ống nghiệm như sau:
Thuốc thử Óng cơ chất (ml) Ong thử (ml) Ong chứng (ml)
Casein 1% 2,0 2,0 0
Dung dịch đệm 2,0 2,0 2,0
Dung dịch thử 0 0,1 0,1
Mật độ quang D, D2 D3
Đe 1 giờ trong tủ ấm 37°c. Cho vào mỗi ống 2,5 ml acid tricloacetic 10%. Lắc đều để ở nhiệt độ phòng 10 phút, ly tâm lấy tủa. Thực hiện phản ứng với 4 ml thuốc thử Gomal. Đe ồn định ở nhiệt độ phòng 30 phút, đo quang ở 550nm, cuvet Icm. Dựa trên biều đồ tính ra lượng protein bị thủy phân.
P = P l - P2 + P3
Trong đó;
P: lượng protein bị thủy phân. Pi: lượng protein trong ống cơ chất. P2: lượng protein trong ống thử. P3: lượng protein trong ống chứng. - Đơn vị hoạt tính:
+ Katal (K) và nanokatal (nK).
+ Katal là lượng enzym thủy phân 1 mol cơ chất trong 1 giây ở điều kiện xác định.
30 + Công thức: l O ^ A . L B HđP = m.M .T Trong đó:
HđP - Hoạt độ protease (nanokatal). A - Lượng protein bị thủy phân (mg).
B - Độ pha loãng của dung dịch chế phẩm enzym. M - Trọng lượng phân tử gam của casein (23600). L - Số liên kết peptid của một phân tử casein (209). T - Thời gian thủy phân (giây),
m - Lượng chế phẩm enzym đem thử (gam). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Hoạt độ protease tính theo % (hoạt độ protease tương đối) được tính theo công thức:
HđP ( %) = + D c h ử n g
^ c ơ chất
Trong đó:
Dcơ chất: mật độ quang của ống cơ chất. Dchứng: niật độ quang của ống chứng. Dthử: mật độ quang của ống thử.
31
Chương 3. THựC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN