2.2.1. Nuôi cấy Mucor hiemalỉs
22
- Nuôi cấy theo phương pháp cấy chìm trong môi trường lỏng.
-Khảo sát nồng độ NaCl, Saccharose trong môi trường nuôi cấy để thu được hoạt độ protease tối đa.
2.2.2. Tách chiết và tinh chếprotease từ dịch nuôi cấy
- Phương pháp diêm tích.
- Phương pháp tủa bằng dung môi hŨTi cơ.
2.2.3. Định lượng protein - enzym và xác định hoạt độ protease dựa trên nguyên tắc của phản ứng Biuret nguyên tắc của phản ứng Biuret
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt độ protease chiết tách được từ dịch nuôi cấy Mucor hỉemalis.
- Định lượng protein - enzym và xác định hoạt độ protease của các sản phẩm sau các giai đoạn chiết tách, tinh chế.
2.3. Phương pháp thực nghiệm
2.3.1 Phương pháp nuôi cấy
■ Cấy truyền giống ra thạch nghiêng
Pha lOOml môi trường thạch nghiêng, đun cho thạch tan ra. Phân phối thạch vào các ống, mỗi ống 5 - 6ml, đậy kín miệng ổng bằng nút bông sạch. Khử trùng các ống bằng nồi hấp ở 121°c, latm, trong 15 phút. Sau đó để thạch đông ở vị trí nghiêng 45”.
Khử trùng tủ cấy bằng cách lau cồn 96“ và chiếu tia ư v trong 30 phút trước khi sử dụng, cấy giống chuẩn vào các ống thạch nghiêng. Đặt các ống thạch nghiêng trong tủ ấm 30°c. Sau 2 - 3 ngày có thể dùng giống nấm trong các ống thạch để nuôi cấy. Bảo quản ống giống chuẩn trong tủ lạnh 4”c và các ống thạch nghiêng trong tủ ấm 30°c.
■ Nuôi cấy trên máy lắc
Pha môi trường lên men như công thức, phân phối môi trường vào các bình nón 250ml, mồi bình chứa 50ml môi trường, đậy kín miệng bình bằng
23
nút bông sạch. Khử trùng các bình nón bằng nồi hấp ở 121°c, latm, trong 30 phút, sau đó để bình nón nguội, cấy chủng giống trong ống thạch nghiêng vào các bình nón chứa môi trường ở trong tủ cấy đã khử trùng. Nuôi cấy trên máy lắc ổn định nhiệt ở 30°c, với tốc độ lắc là 140 vòng/phút.
2.3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaCl trong môi trường nuôi cấy đên sinh tổng hợp protease của Mucor hỉemalis
- Tiến hành pha các môi trường lên men có các nồng độ NaCl tương ứng là: 0; 0,25; 0,5; 075; 1; 1,25;1,5M.
- Cấy nấm vào các môi trường trên rồi nuôi trong điều kiện ở 30“c , tốc độ lắc là 140 vòng/phút, trong vòng 72 giờ.
- Sau khi nuôi cấy, lọc loại bỏ sinh khối, lấy dịch lọc xác định hoạt độ protease và nồng độ protein.
2.3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Saccharose trong môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp protease của Mucor hiemalis
- Tiến hành pha các môi trường lên men có các nồng độ Saccharose tương ứng là: 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4M.
- Cấy nấm vào các môi trường rồi nuôi trong điều kiện ở 30°c, tốc độ lắc là 140 vòng/phút, trong vòng 72 giờ.
- Sau khi nuôi cấy, lọc loại bỏ sinh khối, lấy dịch lọc xác định hoạt độ protease và nồng độ protein
2.3.2. Phương pháp chiết tách và tinh chế protease từ môi trường nuôi cấy Mucor hiemalis
Thực hiện chiết tách và tinh chế protease từ môi trường nuôi cấy Mucor hiemalis qua 3 giai đoạn:
■ Giai đoạn 1: Thu nhận dịch nuôi cấy
-Mucor hiemalis cấy vào môi trường thích hợp và được nuôi ở 30°c, trong 72 giờ, với tốc độ lắc là 140 vòng/phút.
24
- Sau khi kết thúc quá trình lên men, môi trường được lọc sơ bộ qua gạc, sau đó lọc qua giấy lọc để loại bỏ sinh khối.
- Bảo quản dịch lọc ở nhiệt độ 0 - 4°c.
■ Giai đoạn 2: Thu nhận protease bằng (NH4)2S0 4
* Nguyên tắc: (NH4)2S0 4 hòa tan và điện ly trong dung dịch tạo lực ion làm mất lớp áo nước và trung hòa điện tích của các protein do đó protein sẽ tích tụ lại và gây tủa [2].
* Cách tiến hành:
- Nghiền nhỏ (NH4)2S0 4 bằng chày cối sứ.
- Cho từ từ từng lượng nhỏ (NH4)2S0 4 vào dịch lọc vừa cho vừa khuấy để muối tan hết cho đến khi nồng độ (NH4)2S0 4 trong dịch lọc đạt 85% nồng độ bão hòa.
- Dịch lọc được để ở 4°c trong vòng 48 giờ.
-K ết tủa được thu nhận bằng cách ly tâm với tốc độ 15000 vòng/phút trong 20 phút ở 4°c.
-Kết tủa được hòa tan vào dung dịch đệm Citric - Phosphat pH 3 và khuấy trong vòng 30 phút ở nhiệt độ phòng.
-Nếu có phần không tan thì loại bỏ bằng cách ly tâm với tốc độ 15000 vòng/phút trong 30 phút ở 4°c.
■ Giai đoạn 3: Tinh chế protease bằng cồn tuyệt đối
* Nguyên tắc: Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi của môi trường giảm xuống làm mất lớp áo nước và trung hòa điện tích của protein do đó protein bị tủa [2].
* Cách tiến hành
- Thêm cồn tuyệt đối ở 4°c vào dung dịch enzym với lượng cồn lớn gấp 1,5 lần thể tích dung dịch enzym. Đe kết tủa ở nhiệt độ 4°c trong 24 giờ.
25
- Thêm vào phần dịch lỏng 1,5 thể tích cồn tuyệt đối ở 4°c nữa. Để kết tủa ở nhiệt độ 4”c trong 24 giờ.
-Sau đó, kết tủa được thu nhận bằng cách ly tâm với tốc độ 15000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°c.
- Hòa tan tủa trong dung dịch đệm Citric - Phosphat pH 3.
Toàn bộ quy trình tách chiết và tinh chế protease tử dịch nuôi cấy Mucor hiemalis được thể hiện ở hình 2.1.
Sinh khối Dịch Tủa Dịch 26 Dịch nuôi cấy Mucor hiemalis Lọc qua giấy lọc Cho từ từ, khuấy ( N H 4 ) 2 S Ơ 4 Đến 85% bão hòa Để ở 4°c trong 48h Ly tâm 15000 vòng/phút X 20 phút ở 4°c Đệm pH 3
Dung dịch protease thô
Khuấy
Khuấy
1 Vg^oH tuyệt đối
Để ở 4°c trong 24h
Ly tâm 15000 vòng/phút X 20 phút ở 4°c.
Dịch lỏng 1 Vg^OH tuyệt đối
Khuấy Đe ở 4°c trong 24h
Ly tâm 15000 vòng/phút X 20 phút ở 4”c.
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình chiết tách và tỉnh chế protease từ dịch nuôi cấy Mucor hiemalỉs
27
2.1.3.3. Kỹ thuật định lượng protein bằng phản ủng Biuret
Các phương pháp định lượng protein thường hay dùng hiện nay là: Kjedahl, Biuret, Lowry, đo quang trực tiếp và phương pháp cân [10],[11].
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật định lượng protein bằng phản ứng Biuret (kỹ thuật Gomal).
■ Nguyên tắc:
Khi cho tác dụng với thuốc thử Gomal, protein (có liên kết peptid) tạo thành phức màu tím hồng. Đo quang phổ hấp thụ, so với biểu đồ mẫu để định lượng protein.
■ Tiến hành:
Xây dựng biểu đồ mẫu để định lượng protein bằng phản ứng Biuret. Dùng dung dịch protein đã biết nồng độ (casein 1%) làm dung dịch mẫu. Thêm dung dịch đệm pH 6,5 và thuốc thử Gornal vào ống đã chứa casein.
Ong 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Protein mẫu (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 Đệm pH 6,5 (ml) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 TT Gornal (ml) 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Lắc đều để ở nhiệt độ phòng 30 phút. Đo quang ở 550nm, cuvet Icm. Từ kết quả đo quang phổ hấp thụ của các dung dịch dựng biểu đồ nồng độ protein (mg/ml) - mật độ quang (D).
28
Tính:
Các hệ số protein K j là tỷ lệ giữa nồng độ protein (C protein) và độ hấp thụ quang (D)
Nồng độ protein * M ật độ quang Tính hệ số trung bình Ktb
Công thức tính nồng độ protein theo mật độ quang:
Cprotein K-tb X D
Thực hiện phản ứng với Iml dung dịch thử. Dira vào biểu đồ mẫu xác định hàm lượng protein trong dung dịch.
2.1.3.4. Phương pháp xác định hoạt độ protease
Một số phương pháp xác định hoạt độ protease thường dùng hiện nay là phương pháp Anson, Anson cải tiến, Biuret hoặc Lawry. Cũng có thể có một số phương pháp riêng cho mỗi enzym trong đó sử dụng một cơ chất đặc hiệu, hoạt độ protease được xác định bằng lượng cơ chất còn lại hoặc sản phẩm được tạo thành [9],[10].
Trong để tài này, chúng tôi sử dụng phương pháp xác định hoạt độ protease là phương pháp Biuret.
■ Nguyên tắc:
Dưới tác dụng của enzym protease, protein bị thủy phân giải phóng các acid amin tan trong acid tricloacetic. Phần protein còn lại tủa trong acid tricloacetic. Tủa này phản ứng với thuốc thử Gomal tạo phức màu tím hồng. Đo quang ở 550nm, cuvet Icm. Dựa vào biểu đồ mẫu tính ra hoạt độ của enzym.
29
■ Tiến hành:
Pha ioãng enzym đến nồng độ thích hợp bằng dung dịch đệm thích hợp. Sử dụng cơ chất là casein 1%. Cho vào 3 ống nghiệm như sau:
Thuốc thử Óng cơ chất (ml) Ong thử (ml) Ong chứng (ml)
Casein 1% 2,0 2,0 0
Dung dịch đệm 2,0 2,0 2,0
Dung dịch thử 0 0,1 0,1
Mật độ quang D, D2 D3
Đe 1 giờ trong tủ ấm 37°c. Cho vào mỗi ống 2,5 ml acid tricloacetic 10%. Lắc đều để ở nhiệt độ phòng 10 phút, ly tâm lấy tủa. Thực hiện phản ứng với 4 ml thuốc thử Gomal. Đe ồn định ở nhiệt độ phòng 30 phút, đo quang ở 550nm, cuvet Icm. Dựa trên biều đồ tính ra lượng protein bị thủy phân.
P = P l - P2 + P3
Trong đó;
P: lượng protein bị thủy phân. Pi: lượng protein trong ống cơ chất. P2: lượng protein trong ống thử. P3: lượng protein trong ống chứng. - Đơn vị hoạt tính:
+ Katal (K) và nanokatal (nK).
+ Katal là lượng enzym thủy phân 1 mol cơ chất trong 1 giây ở điều kiện xác định.
30 + Công thức: l O ^ A . L B HđP = m.M .T Trong đó:
HđP - Hoạt độ protease (nanokatal). A - Lượng protein bị thủy phân (mg).
B - Độ pha loãng của dung dịch chế phẩm enzym. M - Trọng lượng phân tử gam của casein (23600). L - Số liên kết peptid của một phân tử casein (209). T - Thời gian thủy phân (giây),
m - Lượng chế phẩm enzym đem thử (gam).
- Hoạt độ protease tính theo % (hoạt độ protease tương đối) được tính theo công thức:
HđP ( %) = + D c h ử n g
^ c ơ chất
Trong đó:
Dcơ chất: mật độ quang của ống cơ chất. Dchứng: niật độ quang của ống chứng. Dthử: mật độ quang của ống thử.
31
Chương 3. THựC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng protein
■ Mục đích: Chứng minh mối quan hệ tuyến tính đồng biến của nồng độ protein và mật độ quang, làm cơ sở cho việc định lượng nồng độ protein và xác định hoạt độ protease của các dung dịch thử.
■ Tiến hành: Dùng dung dịch chuẩn casein 1% để pha chính xác thành các dung dịch protein có nồng độ từ 1,0 đến 10 mg/ml và thực hiện phản ứng với 4ml thuốc thử Gornal, sau 30 phút đem đo quang ở 550nm, cuvet Icm.
■ Kết quả: Sau khi đo quang thu được kết quả như trong bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn casein
Cprotein (mg/ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 O D 0,062 0 ,112 0,171 0,225 0,275 0,332 0,369 0,426 0,477 0,520 K 16,13 17,86 17,54 17,78 18,18 18,07 18,97 18,78 18,86 19,23 Ktb== 17,95
32
Nồng độ casein % (mg/ml)
Hình 3.1. Đồ thị tương quan giữa nồng độ protein và mật độ quang ■ Nhận xét:
Đường thu được là đường thẳng có phương trình OD = 0,0512.[protein] + 0,0155 và có hệ số tương quan là 0,9988 > 0,99. Vậy có thể kết luận nồng độ protein và mật độ quang tại 550nm (sau khi thực hiện theo quy trình trong phần phương pháp thực nghiệm) có quan hệ tuyến tính đồng biến. Vì vậy, để xác định được nồng độ protein có thể căn cứ vào đường chuẩn phương trình hoặc vào hệ số protein Ktb-
3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl trong môi trường nuôi cấyđến khả năng sinh tổng hợp protease của Mucor hiemalis đến khả năng sinh tổng hợp protease của Mucor hiemalis
Sau khi lên men Mucor hiemalis trong các môi trường có nồng độ NaCl khác nhau, chúng tôi tiến hành lọc loại bỏ sinh khối rồi định lượng nồng độ protein và xác định hoạt độ protease trong dịch lọc. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.2
33
Bảng 3.2. Hoạt độ protease ngoại bào của M ucor hìemalìs được nuôi cấy trong các môi trường có nồng độ NaCl khác nhau
CNaCI (M) 0 0,25 0,50 0,75 1,0 1,25 1,5
HđP(nKat) 9661 23187 75359 57002 27052 5797 5507
Hình 3.2. Ảnh hưởng cùa nồng độ NaCI đến khả năng sinh protease ngoại bào của Mucor hiemalis
Nhận xét: Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy, khi nồng độ NaCl trong khoảng 0 - 0,5M, hoạt độ protease tăng dần theo nồng độ NaCl trong môi trường và đạt cao nhất khi nồng độ NaCl là 0,5M. Hoạt độ protease trong môi trường có nồng độ NaCl 0,5M lớn gấp 7 lần so với trong môi trường không có NaCl. Hoạt độ protease bắt đầu giảm khi nồng độ NaCl trong môi trường tăng hơn 0,5M, tuy nhiên sự giảm này không lớn cho đến khi nồng độ NaCl tăng trên IM.
3.3. Ảnh hưởng của nồng độ Saccharose trong môi trường nuôi cấy đếnkhả năng sinh tổng hợp protease của M ucor hiemalis khả năng sinh tổng hợp protease của M ucor hiemalis
Sau khi lên men Mucor hiemalis trong các môi trường có nồng độ Saccharose khác nhau, chúng tôi tiến hành lọc loại bỏ sinh khối và định lượng
34
nồng độ protein rồi xác định hoạt độ protease trong dịch lọc. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Hoạt độ protease ngoại bào của Mucor hiemalis được nuôi cấy trong các môi trường có nồng độ Saccharose khác nhau
Csaccharose ( M ) 0 0 , 1 0 , 2 0,3 0,4
HđP (nKat) 26924 64593 75359 74482 71770
protease ngoại bào của M ucor hiemalís
Nhận xét: Từ kết quả trên chúng tôi kết luận, khi nồng độ Saccharose trong khoảng 0 - 0,2M, hoạt độ protease đã tăng dần theo nồng độ Saccharose trong môi trường nuôi cấy, hoạt độ tăng đến cao nhất khi nồng độ Saccharose
0,2M. Hoạt độ này lớn gấp 2,8 lần hoạt độ thu được trong môi trường không có Saccharose. Hoạt độ protease thu được sẽ giảm xuống khi nồng độ Saccharose lớn hơn 0,2M, tuy nhiên tốc độ giảm không nhanh. Nguyên nhân có thể là do khi nồng độ Saccharose tăng cao sẽ gây ra hiện tượng tăng áp
35
suất thẩm thấu của môi trường dẫn đến ức chế sự sinh trưỏng và phát triển cùa
Mucor hiemaỉis [8].
3.4. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt độ của protease Mucor hiemalis hiemalis
Chúng tôi thực hiện kết tủa protease từ môi trường nuôi cấy Mucor hiemalis đã lọc loại bỏ sinh khối bằng (NH4)2S0 4 ở nồng độ 85% bão hòa và tinh chế bằng cồn tuyệt đối rồi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt độ của pro tease Mucor hiemalis.
■ Khảo sát ảnh hưởng của pH
Tiến hành xác định hoạt độ protease được chiết tách và tinh chế từ môi trường nuôi cấy Mucor hỉemalis ở các đệm pH từ 2 đến 8. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Hoạt độ protease ở các pH khác nhau
pH 2 3 4 5 6 7 8
HđP (nKat) 32114 40143 29104 21075 9032 3011 1505
36
Nhận xét: Từ kết quả trên chúng ta có thể nhận thấy, protease Mucor hiemalis hoạt động tốt nhất trong khoảng pH 2 - 5 và hoạt độ protease đạt cao nhất ở pH 3. Hoạt độ giữ được khá cao ở pH 3 - 5, hoạt độ giảm mạnh khi pH trên 5 và protease gần như hoàn toàn mất hoạt tính ở pH trung tính và kiềm.
■ Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ.
Tiến hành xác định hoạt độ protease được chiết tách và tinh chế từ môi trường nuôi cấy Mucor hiemalis ờ các nhiệt độ: 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65°c. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Hoạt độ protease ở các nhiệt độ khác nhau
Nhiệt độ
C O 35 40 45 50 55 60 65
HđP
(nKat) 29260 32771 36283 39794 42135 38624 16386
Hình 3.5. Ảnh hưỏ'ng của nhiệt độ đến HđP
Nhận xét: Hoạt độ của protease tăng dần từ 35°c và đạt cao nhất ở
37
hơn 60°c. Từ đó ta có thể kết luận, khoảng nhiệt độ thích hợp của protease
Mucor hiemalis là 45 - 60°c.
3.5. Các giai đoạn chiết tách và tinh chế protease từ môi trường nuôi cấy