Tủa protein - enzym ở giai đoạn trên được hòa tan vào trong dung dịch đệm, thêm 1,5 thể tích cồn tuyệt đối đã làm lạnh đến 4"c vào dung dịch enzym thô, khuấy kĩ. Để ở nhiệt độ 4°c trong 24 giờ. Ly tâm với tốc độ 15000 vòng/phút trong 20 phút ở 4°c để loại tủa. Thêm 1,5 thể tích cồn tuyệt đối ở 4°c nữa vào phần dịch lỏng và để ở 4°c trong 24 giờ cho kết tủa. Ly tâm với tốc độ 15000 vòng/phút trong 20 phút ở 4°c để thu tủa. Hòa tan tủa vào dung dịch đệm, tiến hành định lượng nồng độ protein và xác định hoạt độ protease. Kết quả được tóm tắt ở bảng 3.6
38
Bảng 3.6. Kết quả quá trình chiết tách và tinh chế protease từ dịch nuôi cấy M ucor hiemalis
Giai đoạn Thê tích (ml) Protein , Ẵ Ấ tông sô (mg) C p r o te in (mg/ml) HđP (nKat) HđP riêng (nKat/mg) Tỉ lê• thu hồi (%) Môi trường nuôi cấy 250 - - - - - Môi trường loại SK 200 4016,01 20,08 75359,00 18,76 100,00 Kêt tủa bằng ( N H 4 ) 2 S Ơ 4 85% bh 50 2845,86 56,92 68968,56 24,23 70,86 Tinh chê bằng cồn lần 1 125 1191,63 9,53 62608,24 52,54 29,67 Tinh chê bằng cồn lần 2 50 201,30 4,03 43475,53 215,97 5,01
Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy, qua các giai đoạn chiết tách, tinh chế bằng (NH4)2S0 4 85% bão hòa và cồn tuyệt đối từ 4016,0Img protein ban đầu chúng tôi thu được 201,3mg protein - protease, tỉ lệ thu hồi đạt 5,01%, tuy nhiên hoạt độ protease riêng tăng 11,5 lần (từ 18,76 lên
39
215,97nKat). Điều này chứng tỏ quy trình chiết tách và tinh chế protease từ dịch nuôi cấy Mucor hỉemalỉs là rất khả quan.
3.6. Bàn luân
3.6,1. Nuôi cẩy Mucor hiemalis
Vỉệc lựa chọn chủng Mucor híemalis
Mucor hiemalis là chủng nấm mốc thuộc loài Mucor, loài nấm tồn tại rất phố biến trong tự nhiên, nó có ở trong chất thải, thực vật và rau quả hỏng
21]. Do đó việc tìm kiếm nguồn v s v không gặp quá nhiều khó khăn.
Sử dụng Mucor hiemalis để nuôi cấy, thu nhận protease có một số ưu điểm là ưu điểm chung của v s v trong sản xuất enzym đó là;
Thứ nhất, v s v có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối lượng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm. Do đó, v s v phải tổng hợp một lượng enzym rất lớn trong một khoảng thời gian ngắn, điều này cũng đồng nghĩa với khả năng tổng họp enzym của v s v hơn hẳn khả năng tổng họp enzym ở động vật và thực vật.
Thứ hai, hoạt tính enzym của vsv cao hơn hoạt tính enzym được tổng hợp từ động vật và thực vật.
Thứ ba, tốc độ sinh sản của v s v rất cao, trong một thời gian ngắn ta có thể thu được lượng sinh khối rất lớn.
Thứ tư, đây cũng là đặc điểm quan trọng nhất, đó ià v s v là những cơ thể rất nhỏ bé, ta có thể đưa chúng vào những thiết bị lên men. Trong các thiết bị lên men, ta hoàn toàn có thể điều khiển và kiểm soát được các điều kiện nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, chất độc hại, lưu lượng không khí...Do đó, ta có thể sản xuất enzym từ v s v từ hình thức thủ công sang hình thức công nghiệp hiện đại với sản phẩm được sản xuất hàng loạt và có kiểm soát.
40
Thứ năm, nguyên liệu dùng để sản xuất enzym từ v s v là những nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm, v s v không đòi hỏi quá khắt khe những yếu tố dinh dưỡng của môi trưòng, nhất là vi sinh vật tổng hợp enzym.
Cuối cùng, ta hoàn toàn có thể điều khiển tốc độ sinh tổng hợp enzym trong sản xuất bằng cách sử dụng pH, nhiệt độ và đặc biệt là cơ chất mà chúng tham gia phân hủy [8].
Protease ngoại bào do Mucor hiemalỉs sinh tống hợp là protease acid, có khoảng pH hoạt động tối ưu là 2 - 5 phù hợp với pH dạ dày và phần đầu ruột non tương tự như rennin và pepsin. Do đó, có thể nghiên cứu tạo chế phẩm protease có tác dụng tiêu hóa dùng trong trường hợp thiếu dịch vị ở dạ dày, dạ dày tiêu hóa kém hoặc dùng nó để chế biến thức ăn dễ tiêu hóa cho trẻ em.
Protease Mucor hỉemalỉs còn có khả năng làm đông tụ sữa giống như protease của Mucor pusỉllus, Mucor miehei và Eudothia parasỉtiaca [12], do đó có thể ứng dụng trong công nghiệp sản xuất phomat, công nghiệp chế biến sữa và thực phẩm chức năng.
Protease Mucor hiemalis có ưu điểm hơn rennin, pepsin do có nguồn cung cấp lớn nhờ quá trình lên men; đồng thời enzym có đặc tính là vẫn ổn định ở nhiệt độ khá cao 45 - 60°c nên rất thuận tiện trong chế biến vì vậy tiềm năng ứng dụng của protease Mucor hiemalis là vô cùng lớn.
v ề quy trình nuôi cấy
Có thể nói rằng, làm môi trường là khâu quan trọng bậc nhất trong công tác nghiên cứu v s v vì môi trường kém phẩm chất hoặc không thích hợp sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến kết quả nghiên cứu.
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng môi trường nuôi cấy bao gồm bột đậu tương là nguồn cung cấp nitơ, saccharose là nguồn cung cấp hydrad carbon, NaCl và nước máy là nguồn cung cấp những nguyên tố vi lượng cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của Mucor hiemalis. Đây là
41
nhưng nguyên liệu rẻ tiền, sẵn có do đó đảm bảo tính khả thi và kinh tế khi thực hiện trên quy mô lớn.
Chúng tôi cũng đã khảo sát ảnh hưởng nồng độ của một số thành phần dinh dưỡng trong môi trường là NaCl và Saccharose đến khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào của Mucor hiemaỉis, từ đó lựa chọn được nồng độ tạo ra nhiều protease nhất, đồng thời mở ra hướng đi mới nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng khác như nhiệt độ, pH, độ ẩm ... đến khả năng sinh tổng hợp protease.
3.6,2. về chiết tách và tỉnh chếprotease từ dịch nuôi cấy Mucor hiemalís
Như đã trình bày ở trên, có nhiều phương pháp để chiết tách và tinh chế protease từ môi trường nuôi cấy khi dùng phương pháp nuôi cấy chim. Trong đề tài này chung tôi sử dụng phương pháp thu nhận bằng cách kết tủa bằng muối và tinh chế bằng phương pháp kết tinh bằng dung môi hữu cơ. Tiến hành đồng thời hai phương pháp này giúp khắc phục được nhược điểm chúng. Dùng muối để kết tủa protein - enzym ban đầu sẽ cho chế phẩm có hoạt độ cao hơn và tinh sạch hơn phương pháp dùng cồn. Tuy vậy khi dùng muối thì tủa protein - enzym thu được chứa rất nhiều muối (NH4)2S0 4 nên lúc này dùng cồn để kết tủa lại sẽ loại được phần lớn muối vô cơ trong tủa protein - enzym, lượng cồn sử dụng cũng sẽ giảm rất nhiều so với việc dùng cồn để kết tủa protein - enzym ngay từ đầu mà vẫn thu được enzym tinh sạch.
Trước khi thu nhận protease, chúng tôi loại sinh khối bằng cách lọc mà không ly tâm vì theo các tác giả Nhật Bản khi ly tâm thường làm giảm đáng kể hoạt độ enzym [8].
42
KẾT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT
Kết luận
-Đ ã nuôi cấy thành công chủng Mucor hiemalỉs có khả năng sinh tổng họp protease ngoại bào trong quy mô phòng thí nghiệm.
- Đã khảo sát được ảnh hưởng của nồng độ NaCl và Saccharose trong môi trường đến khả năng sinh tổng họp protease ngoại bào của Mucor hiemal is.
Trên cơ sở đó lựa chọn được nồng độ tối thích của hai yếu tố này để nuôi cấy thu nhận protease Mucor hiemalis là NaCl 0,5M và Saccharose 0.2M.
- Đã lựa chọn được quy trình chiết tách, tinh chế protease từ môi trường nuôi cấy Mucor hiemalỉs qua 2 giai đoạn chính là: giai đoạn thu nhận protease bằng muối (NH4)2S0 4 85% bão hòa và giai đoạn tinh chế 2 lần bằng cồn tuyệt đối (tỉ lệ 1 : 1,5), từ đó thu được protease đã tinh chế có hoạt độ riêng tương đối cao là 215,97 nKat/mg.
- Đã khảo sát được ảnh hưỏng của pH và nhiệt độ đến hoạt độ protease của Mucor hiemalis. Từ đó xác định được điều kiện thích họp cho hoạt động của enzym là ở dãy pH 2 - 5 và khoảng nhiệt độ 45 - 60°c (tối ưu là pH 3 và nhiệt độ 55 °C).
Đề xuất
Tiếp tục nghiên cứu và tìm hiểu tác dụng protease của Mucor hiemalis
nhằm ứng dụng vào tạo chế phẩm trợ giúp tiêu hóa và ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm chức năng, chế biến sữa.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Kiều Hữu Ảnh, Ngô Tự Thành (1981), Cơ sở hỏa sinh của vi sinh vật học, NXB Khoa học kỹ thuật.
2. Bộ Y tế (2005), Hóa sinh học, Nxb Y học, Hà Nội, tr. 84.
3. Bộ Y tế (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phâm, tập 2, Nxb Y học, Hà Nội, tr. 37.
4. Nguyễn Trọng cẩn, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Giang, Trần Thị Luyến (1998), Công nghệ enzyme, Nxb Nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh. 5. Phạm Trân Châu, La Văn Ngữ, Nguyễn Lân Dũng, Lê Ngọc Tú (1982),
Enzym vi sinh vát, tập I, tập II, Nxb Khoa học và kỹ thuật.
6. Ngô Tuấn Kỳ (1988), “Một số ứng dụng của enzym”, Enzym và đời sổ n g , Nxb Khoa hoc kĩ thuật, Hà Nội, tr. 15-86.
7. Nguyễn Hạnh Phúc, Nguyễn Thị Hỏa, Đoàn Thị Thủy, Nguyễn Thị Hòa (1984), “ Tinh chế papain từ nhựa đu đủ tươi dùng trong nuôi cấy tế bào”, Tạp chỉ dược học, (2), tr. 12-14.
8. Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzyni, Nxb ĐH Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, tr. 67-92, 309-317.
9. Nguyễn Văn Mùi (2002), Xác định hoạt độ enzym, Nxb Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tr. 144-147.
10.Nguyễn Văn Rư (2002), Nghiên cứu tạo chê phẩm protease nguồn gổc động, thực vật ứng dụng trong phòng chổng suy dinh dưỡng, Luận án Tiến sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr. 3-37.
1 l.Vũ Đình Vinh, Đặng Hạnh Phúc, Đỗ Đình Hồ (1974), Kỹ thuậty sinh hóa, Trường Đại học Quân y.
Tiếng Anh
12.Abdel-Fattah. A. F., Nadia M. El-Hawwary (1979), “Studies on the Production of Milk-clotting Enzymes, Proteolytic enzymes and Mucilage by Fungi”, Journal o f General Microbiology, pp. 327-331. 13.Berfeld. p.(1955), Method in enzymology, vol I, pp.149-158.
14.Cadewick s. p., and Kaplan N. o . (1991). “Immobilized enzymes and ceils”, Methods in enzymology, Vol 137, Part D. Edited by Klous Mozback, Academic Press, USA, pp. 538-599.
15.Desnuelle p. (1960), “ Chymotrypsin”, The enzyme, Vol IV, Academic Press InC, New York, pp. 93-118.
16.John I. Pitt, Ailsa D. Hocking (2009), Fungi and Food Spoilage,
p p.153-154.
17.Lewis A. Jetal (1974), Modern drug encyclopedia and Therapeutic index, B published by the Yorke Medical group, New York, pp. 1,61, 248-251, 305, 407, 409, 413, 548-551, 582-585, 669-671.
IS.Milett J, Archer R and Auber J.p (1969), Biotechonology and bioengineering, pp.l 1, 1233.
19.Pettei M. J. and eds (1994), “ Pancolonic disease in cystic fibrosis and high - does pancreatic enzym therapy”, J. Pediatr, (125), pp. 587-599. 20.Samal. B, B. Karan and Y. Stansky (1990), Biotechonolog}^ and
bioengineering, pp. 35, 650-652.
21.Stewart N. J., Munday B. L., and T. Hawkesford (1999), “Isolation of Mucor circinelloides from a case of ulcerative mycosis of platypus (Ornithorhynchus anatinus), and a comparison of the response of Mucor circinelloides and Mucor amphibiorum to different culture temperatures”, Med Mycol, pp. 201-206.
22. Whitaker J. R., (1972), Principles o f enzymology fo r the food sciences,