Nghiên cứu thu nhận dịch đạm thuỷ phân từ gluten lúa mì để ứng dụng trong sản xuất thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THUỶ PHÂN TỪ GLUTEN LÚA MÌ ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM Mã số: 2013/02-CNSHTPMT Chủ nhiệm đề tài: TS NGUYỄN LỆ HÀ Tp Hồ Chí Minh, 5/2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THUỶ PHÂN TỪ GLUTEN LÚA MÌ ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM Mã số: 2013/02-CNSHTPMT Xác nhận Chủ tịch HĐ nghiệm thu Chủ nhiệm đề tài (ký, ghi rõ họ tên) (ký, họ tên) Tp Hồ Chí Minh, 5/2017 TĨM TẮT ĐỀ TÀI Đề tài tập trung nghiên cứu trình thủy phân gluten lúa mì với hai enzyme: Alcalase Flavourzyme nhằm thu dịch thủy phân giàu peptides mạch ngắn acid amin Gluten lúa mì có hàm ẩm 7.8%, chứa 75.7% protein, bao gồm glutenin có khối lượng phân tử 52-70kDa, gliadin có khối lượng phân tử từ 3038KDa, ngồi cịn có tiểu đơn vị thành phần glutenin có khối lượng phân tử thấp nằm khoảng 12-15KDa.Quá trình thủy phân thực lần lượt: ban đầu xúc tác enzyme Alcalase, endo-protease, sau xúc tác Flavourzyme Các thơng số thích hợp trình thủy phân gluten lúa mì với Alcalase thu sau: tỷ lệ enzyme/cơ chất 0.116 AU/g, nhiệt độ 60oC, pH 8.0, thời gian thủy phân 120 phút Dịch thủy phân thu có hàm lượng Nitơ tổng 17.76±0.202g/L, hàm lượng amoniac 0.273±0.01g/L, hàm lượng acid amin tự 30.166mg/g Sản phẩm thủy phân với Alacalase tiếp tục thủy phân với Flavourzyme nhằm thu dịch thủy phân giàu acid amin tự peptides ngắn Điều kiện thủy phân với Flavourzyme là: tỷ lệ enzyme/cơ chất 0.204AU/g, pH 6.5, nhiệt độ 45oC, thời gian 210 phút Sản phẩm thủy phân với quy trình có hàm lượng Nitơ tổng 18.497±0.369 g/L, hàm lượng ammoniac 0.474±0.012 g/L, hàm lượng acid amin tự do102.527 mg/g Dịch thủy phân thu bao gồm peptides có khối lượng phân tử 35kDa 10KDa ABSTRACT In this work, we focused onprocess of wheat gluten hydrolyzed utilizing enzymes Alcalase and Flavourzyme to enrich peptides and acid amine.Protein concentration of wheat gluten is 75.7%, including glutenin and gliadin molecular are range from 52 to70 kDa and from 30 to 38 kDa, respectively.In addition, glutenin containlow molecular weight subunitsfluctuating between 12 and 15KDa.The parameters of hydrolysis using Alcalase and Flavourzyme were determined Prehydrolysis process was carried out by enzymes Alcalase, an endo-protease At the optimal of enzyme Alcalase concentrationof0.116 AU/g, temperature of60°C, pH of 8.0 and hydrolysis time of 120 minutes,hydrolyzate reached total nitrogen content of 17.76 ± 0.202 g/L, ammonia content of0.273 ± 0.01 g/L andfree acid aminecontent of 30.166mg/g Product was continued to hydrolyze by Flavourzyme to obtain free acid amine and short chain peptides The optimal parameters of hydrolysis using Flavourzyme were enzyme concentration of 0.204 AU/g, pH of 6.5, temperature of 45oC and hydrolysis time of 210 minutes Total nitrogen, ammonia and free acid amine content of product were 18.497±0.369 g/L, 0.474±0.012 g/L and 102.527 mg/g, respectively The final product presented peptides whose molecular weight is 35 kDa and less than 10 kDa MỤC LỤC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ i TÓM TẮT ĐỀ TÀI iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi GIỚI THIỆU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Thành phần gluten lúa mì 1.1.1 Giới thiệu chung gluten lúa mì 1.1.2 Thành phần protein lúa mì 1.2 Tính chất dịch gluten lúa mì sau thủy phân ứng dụng thực phẩm 1.2.1 Tính chất dịch gluten lúa mì sau thủy phân 1.2.2 Ứng dụng dịch đạm thủy phân 1.3 Các phương pháp thủy phân protein 1.3.1 Phương pháp sinh học 1.3.2 Phương pháp kết hợp 1.4 Giới thiệu enzyme protease Alcalase Flavourzyme 1.4.1 Enzyme Alcalase 1.4.2 Enzyme Flavourzyme 1.5 Một số nghiên cứu ngồi nước q trình thủy phân gluten 3 6 10 10 11 12 12 13 14 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu hóa chất 2.1.1 Gluten lúa mì 2.1.2 Enzyme Alcalase Flavourzyme 2.1.3 Hóa chất 2.2 Dụng cụ thiết bị 2.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Nội dung nghiên cứu 2.3.2 Bố trí thí nghiệm 2.3.3 Phương pháp phân tích 2.4 Phương pháp xử lý kết thí nghiệm 17 17 17 17 19 19 20 20 21 32 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Các thông số nguyên vật liệu dùng thí nghiệm 3.1.1 Khảo sát hoạt tính enzyme 3.1.2 Khảo sát thành phần nguyên liệu 34 34 34 35 3.2 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân gluten lúa mì Alcalase 36 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/cơ chất đến trình thủy phân Alcalase 36 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên trình thủy phân 40 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng pH đến trình thủy phân 44 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến trình thủy phân enzyme Alcalase 48 3.3 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân protein Flavourzyme sau xử lý với Alcalase 52 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ enzmye/cơ chất 52 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân 57 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng pH đến trình thủy phân 60 3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến q trình thủy phân 64 3.4 Phân tích thành phần dịch thủy phần 68 3.4.1 Hàm lượng nito tổng amoniac dịch thủy phân 68 3.4.2 Kết phân tích khối lượng phân tử dịch thủy phân nguyên liệu 68 3.4.3 Kết phân tích thành phần acid amin tự HPLC 70 CHƯƠNG KẾT LUẬN 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 PHỤ LỤC Phụ lục 2: Các phương pháp phân tích dùng nghiên cứu 80 85 DANH MỤC BẢNG Bảng Hàm lượng protein hàm lượng protein hòa tan thủy phân enzyme khác 10 Bảng Thành phần gluten lúa mì nhà sản xuất cung cấp 17 Bảng 2 Các đặc tính enzyme Alcalase nhà sản xuất cung cấp 18 Bảng Các đặc tính enzyme Flavourzyme nhà sản xuất cung cấp 18 Bảng Hoạt tính enzyme Alcalase Flavourzyme 34 Bảng Thành phần nguyên liệu gluten lúa mì 35 Bảng 3 Hàm lượng Nito tổng amoniac dịch thủy phân 68 Bảng Thành phần aicd amin tự dịch thủy phân 70 Comment [NT1]: số trang để cuối dòng DANH MỤC HÌNH Comment [NT2]: số trang để cuối dịng Hình 1 Kích thước hạt protein mạng gluten trạng thái tự (a) kéo căng (b) Hình Mức độ thủy phân gluten theo thời gian với enzyme khác ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED Hình Cơ chế phản ứng thủy phân chất protein Substilisin Carlsberge Hình Nội dung nghiên cứu 14 20 Hình 2 Sơ đồ tiến hành thủy phân gluten enzyme Alcalase 21 Hình Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ E/S đến trình thủy phân Alcalase 23 Hình Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân Alcalase 24 Hình Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng pH đến trình thủy phân Alcalase 25 Hình Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian đến trình thủy phân Alcalase 26 Hình Sơ đồ thủy phân enzyme Flavourzyme có tiền xử lý Alcalase 27 Hình Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ E/S đến trình thủy phân Flavourzyme sau xử lý Alcalase 28 Hình Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân Flavourzyme sau xử lý Alcalase 29 Hình 10 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng pH đến trình thủy phân Flavourzyme sau xử lý Alcalase 30 Hình 11 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng thời gian đến trình thủy phân Flavourzyme sau xử lý Alcalase 31 Hình Đồ thị biểu diễn mức độ thủy phân gluten theo thời gian tỷ lệ E/S khác 36 Hình Mức độ thủy phân sau 120 phút với tỷ lệ E/S khác vi 37 Hình 3 Hàm lượng protein hòa tan dịch gluten sau thủy phân nồng độ enzyme khác theo thời gian 38 Hình Hàm lượng protein hịa tan sau 120 phút với nồng độ enzyme khác 39 Hình Đồ thị biểu diễn mức độ thủy phân theo thời gian nhiệt độ khác 41 Hình Mức độ thủy phân sau 120 phút nhiệt độ khác 42 Hình Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein hòa tan theo thời gian nhiệt độ khác 43 Hình Hàm lượng protein hòa tan sau 120 phút giá trị nhiệt độ khác 44 Hình Đồ thị biểu diễn mức độ thủy phân theo thời gian giá trị pH khác 45 Hình 10 Mức độ thủy phân nhiệt độ khác 46 Hình 11 Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein hòa tan pH khác theo thời gian 47 Hình 12 Hàm lượng protein hòa tan pH khác 48 Hình 13 Đồ thị biểu diễn mức độ thủy phân theo thời gian 49 Hình 15 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ E/S đến hàm lượng aa theo thời gian 52 Hình 16 Hàm lượng aa sau 180 phút theo nồng độ enzyme khác 53 Hình 17 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ E/S đến DH 54 Hình 18 Mức độ thủy phân sau 180 phút theo nồng độ enzyme khác 55 Hình 19 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng aa theo thời gian 57 Hình 20 Hàm lượng aa sau 180 phút theo nhiệt độ khác 58 Hình 21 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến DH 59 Hình 22 Mức độ thủy phânsau 180 phút nhiệt độ khác vii 60 Hình 23 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến hàm lượng aa theo thời gian 61 Hình 24 Hàm lượng aa sau 180 phút giá trị pH khác 62 Hình 25 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng pH đến DH 63 Hình 26 Mức độ thủy phân sau 180 phút pH khác 64 Hình 27 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng aa 65 Hình 28 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian lên mức độ thủy phân 66 Hình 29 Khối lượng phân tử gluten (NL), dịch thủy phân Alcalase 2h, dịch thủy phân với Alcalase 3h, dịch thủy phân với Alcalase Flavourzyme(A-L) 69 viii Phương pháp dựa sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại bước sóng 750 nm Cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein phạm vi định Dựa vào mức độ hấp thụ quang học protein chuẩn, ta xác định hàm lượng protein mẫu nghiên cứu Hoá chất  Dung dịch A: 0.4g NaOH (0.1M) 2g Na2CO3 (2%) pha 100mL nước cất  Dung dịch B: 0.5g CuSO4.5H2O (0.5%) pha dung dịch Natri Xitrat (1%) dung dịch Kali Natri Tartrat 1% thành 100 mL  Dung dịch C: Hỗn hợp hai dung dịch A B theo tỷ lệ 49:1 (pha trước dùng)  Dung dịch albumin huyết bò 1mg/mL Các bước tiến hành  Xây dựng đường đồ thị chuẩn albumin Dung dịch albumin chuẩn 0.2 mg/mL: Cân 0.01g (10mg – albumin huyết bò) định mức lên50mLbằng nước cất Chuẩn bị ống nghiệm chứa dung dịch albumin chuẩn nồng độ xác định bảng sau: Ống nghiệm Nồng độ, mg/mL 0.04 0.08 0.12 0.16 0.2 Dung dịch albumin, mL 0.2 0.4 0.6 1.0 0.8 Nƣớc cất, mL 0.8 0.6 0.4 0.2 Dung dịch C, mL 2 2 2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 Thuốc thử Folin, mL Pha dung dịch albumin chuẩn nồng độ khác bảng Thêm mL dung dịch C, lắc để yên 10 phút Sau cho thêm 0.2 mL thuốc thử Folin vào ống nghiệm, lắc đều, để yên 20 phút tiến hành đo mật độ quang dung dịch ống nghiệm bước sóng 750 nm Ghi nhận kết Ồng đối chứng: thay dung dịch albumin mL nước cất, tiến hành cho thuốc thử tương tự ống nghiệm khác xây dựng đường chuẩn đem đo mật độ quang bước sóng 750 nm Ghi nhận kết Xây dựng đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang (∆OD) theo nồng độ Comment [NT11]: canh lề theo chế độ justify protein 1.2 y = 5.151x + 0.041 R² = 0.993 OD 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.05 0.1 0.15 0.2 BSA(mg/mL)  Xác định hàm lượng protein dung dịch nghiên cứu 0.25 Đối với mẫu trước thủy phân: tiến hành hòa tan gluten nước Tiến hành ly tâm 5000 vòng/phút 20oC 30 phút, thu nhận dịch đem xác định thể tích dịch thu hàm lượng protein hòa tan dịch Đối với mẫu thủy phân: dịch thủy phân thu đem ly tâm 5000 vòng/phút 20oC 30 phút, thu nhận dịch đem xác định thể tích dịch thu hàm lượng protein hòa tan dịch thủy phân Tính tốn hàm lượng protein hịa tan Hàm lượng protein hịa tan xác định theo cơng thức sau: Hàm lượng protein hịa tan g/100g = x×V×L MP Trong đó: x: hàm lượng protein hòa tan suy từ đường chuẩn, mg/mL V: thể tích phần dịch thu sau ly tâm, mL MP: khối lượng protein có hỗn hợp phản ứng, mg MP tính tích số lượng gluten có mẫu (mg) % protein gluten (xác định phương pháp Kjeldahl) L: độ pha loãng mẫu 2.3 Xác định mức độ thủy phân theo phƣơng pháp pH-stat(Alder Nissen, 1986) Nguyên tắc Trong q trình thủy phân protein điều kiện trung tính kiềm, acid amin giải phóng dẫn đến phân ly proton, làm pH hỗn hợp phản ứng giảm Số lượng liên kết peptides bị phá vỡ ước lượng thể tích dung dịch kiềm sử dụng để trì pH ban đầu suốt trình phản ứng (Adler-Nissen, 1986) Mức độ thủy phân (DH) định nghĩa phần trăm tỷ lệ số liên kết peptides bị phá vỡ (h) tổng số liên kết peptides tính đơn vị khối lượng (htot), trường hợp, tính tốn hàm lượng kiềm tiêu thụ (Adler-Nissen, 1986), theo công thức đây: DH% = h × 100% B × Nb × 100% = htot α × Mp × htot Trong đó: B: thể tích dung dịch kiềm tiêu thụ, mL B xác định hiệu số lượng kiềm cần dùng để chuẩn độ mẫu thủy phân mẫu đối chứng pH khảo sát ban đầu NB: nồng độ dung dịch kiềm dùng chỉnh pH, (N) Trong thí nghiệm chúng tơi dùng NaOH có nồng độ NB = 1N chuẩn độ dịch thủy phân Alcalase NaOH 0.1N chuẩn độ dịch thủy phân Flavourzyme 1/α: mức độ phân ly trung bình nhóm α-amino liên hệ với giá trị pK nhóm amino, điều kiện nhiệt độ pH định MP: hàm lượng protein có hỗn hợp phản ứng, g MP tính tích số lượng gluten có mẫu (g) % protein gluten (xác định phương pháp Kjeldahl) htot: tổng số milimol amino acid độc lập gam protein.phụ thuộc vào nguồn protein sử dụng thí nghiệm, meq/g Với gluten lúa mì, htot = 8.3 meq/g Giá trị 1/α tính tốn theo công thức sau: α= 10pH −pK + 10pH −pK 2.4 Xác định nitơ tổng phƣơng pháp Kjeldahl Nguyên tắc: đốt nóng ngun liệu đem phân tích với H2SO4 đậm đặc, hợp chất hữu bị oxy hóa, Carbon hydro tạo thành CO2 H2O Cịn nitơ sau giải phóng dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan dung dịch Đuổi NH3 khỏi dung dịch NaOH đồng thời chưng cất thu NH3 lượng dư H2SO4 0.1N Định phân lượng H2SO4 0.1N lại dung dịch NaOH 0.1N chuẩn dùng phenolphthalein làm chất thị màu chuẩn độ dung dịch đến chuyển sang màu hồng nhạt, từ tính lượng nitơ có mẫu ngun liệu thí nghiệm  Cách tiến hành: Vơ hóa mẫu: tiến hành tủ Hotte Lấy mẫu cho vào bình Kjeldahl, mẫu lấy khoảng 0.2g (đối với mẫu rắn) 5mL (đối với mẫu lỏng) Thêm vào từ từ 10mL dung dịch H2SO4 đậm đặc (tỷ trọng 1.84) Để tăng nhanh q trình vơ hóa (đốt cháy) cần bổ sung thêm chất xúc tác Có thể dùng xúc tác acid perchoric HClO4, giải phóng oxi cho phản ứng oxy hóa Sau thêm chất xúc tác, đun nhẹ hỗn hợp tránh sôi trào, đun mạnh hỗn hợp chuyển sang dịch lỏng Trong trình đun lắc nhẹ, tráng khéo léo cho khơng cịn vết đen mẫu nguyên liệu thí nghiệm chưa bị phân hủy sót lại thành bình Đun dung dịch bình hồn tồn trắng  Cất đạm: tiến hành máy cất đạm bán tự động Gerhardt Đức Chuẩn bị máy cất đạm Chuyển tồn dung dịch mẫu sau vơ hóa xong bình Kjeldahl vào bình định mức 100mL, thêm nước cất vạch định mức Lúc nhiệt độ tỏa mạnh làm nước bay phần Làm nguội điều chỉnh lại mức nước để tránh sai số, sau đổ erlen để dễ lắc trộn dung dịch mẫu đồng Lấy vào erlen 10mL dung dịch H2SO4 0.1N, lắp vào máy, ý nhúng ngập ống vào dịch lỏng Lấy vào ống phản ứng 10mL dung dịch thí nghiệm từ bình định mức, lắp vào hệ thống Comment [NT12]: canh lề theo chế độ justify  Tính tốn kết Hàm lượng phần trăm nitơ tổng có mẫu tính theo cơng thức sau: 𝑁= 𝑎 − 𝑏𝐾 × 0.0014 × 𝑉 × 100 𝑣 ×𝑚 Trong đó:  N: hàm lượng nitơ tính phần trăm khối lượng  a: số mL dung dịch chuẩn H2SO4 0.1N đem hấp thụ NH3  b: số mL NaOH 0.1N tiêu tốn cho chuẩn độ  m: khối lượng mẫu đem vô hóa, g  V: tổng thể tích định mức dung dịch vơ hóa (100mL)  v: thể tích dung dịch vơ hóa dùng chưng cất (10mL)  0.0014: lượng gam nitơ ứng với 1mL H2SO4 0.1N (Trần Bích Lam)  K: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0.1N Tính hàm lượng protein thơ: nitơ vật liệu sinh học chủ yếu nitơ protein cịn có lượng nhỏ nitơ thành phần khác gọi nitơ phi protein Nitơ tổng = Nitơ protein + Nitơ phi protein Hàm lượng protein vật liệu sinh học tính cách nhân hàm lượng nitơ protein với hệ số chuyển đổi 6.25, hệ số 5.7 ngũ cốc Như vậy, cơng thức tính hàm lượng phần trăm protein thơ là: Protein (%) = Nitơ (%) x 5.7 2.5 Xác định hàm lƣợng acid amin(Friedman, 2004) Nguyên tắc: Phản ứng màu đặc trưng của ninhydrin với acid amin cường độmàu phụ thuộc nồng độ acid amin sở việc sử dụng ninhydrin để xác định hàm lượng nitơ amin kĩ thuật so màu Kết nitơ tính tốn dựa vào đường chuẩn tính theo đơn vị mg/mL Cách dựng đường chuẩn: Cân 0.2g acid glutamic, sau cho vào bình định mức 100mL định mức lên nước cất, ta dung dịch glutamic có nồng độ 0.2mg/mL Sau tiến hành pha loãng dung dịch bảng sau: Ống nghiệm Nồng độ, mg/mL Dung dịch glutamic, mL 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 Nƣớc cất, mL 2.8 2.7 2.6 2.5 2.4 Thuốc thử nihydrin, mL 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.013 0.02 0.027 0.033 0.04 Sau chuẩn bị dung dịch chuẩn bảng ta tiến hành đun nóng o 95 C vịng 10 phút Sau làm nguội tiến hành đo mật độ quang bước sóng 570nm Từ hàm lượng aa thu OD ta vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ Đối với mẫu: sau ly tâm, lọc bẩn, ta tiến hành pha loãng mẫu theo tỷ lệ định để kết OD nằm vào đường chuẩn Sau hút 3mL mẫu 0.6 mL thuốc thử cho vào ống nghiệm, tiến hành đun ở 95oC vòng 10 phút Sau làm nguội tiến hành đo mật độ quang bước sóng 570nm Từ kết đo quang thu dựa vào đường chuẩn ta có hàm lượng aa mẫu 0.7 y = 15.83x - 0.008 R² = 0.995 0.6 0.5 OD 0.4 0.3 0.2 0.1 -0.1 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 glutamic (mg/mL) 2.6.Xác định độ ẩm Sử dụng cân phân tích ẩm hồng ngoại Nguyên tắc: Nguyên tắc hoạt động cân sấy ẩm cho nguyên liệu vào cân khối lượng mẫu (m1), sau gia nhiệt đến nhiệt độ 130oC để làm bốc nước khối lượng khơng đổi (m2) phần trăm ẩm tính tự động hiển thị lên hình, theo cơng thức tính sau: x m1  m  100 (%) m1 Trong đó: - m1: khối lượng mẫu trước sấy (g) - m2: khối lượng mẫu sau sấy (g) 2.7 Xác định lipid tổng theo phƣơng pháp Shoxhlet Dùng dung mơi kị nước trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu nghiền nhỏ Một số thành phần hòa tan chất béo trích ly theo bao gồm sắc tố, vitamin tan chất béo, chất mùi…tuy nhiên hàm lượng chúng thấp Do có lẫn tạp chất, phần trích ly gọi lipid tổng hay dầu thô Hàm lượng lipid tính cách cân trực tiếp lượng dầu sau chưng cất loại dung mơi tính gián tiếp từ khối lượng bã cịn lại Ưu điểm cách tính gián tiếp đồng thời trích ly nhiều mẫu trụ chiết  Cách tiến hành: Sấy khô nguyên liệu đến khối lượng khơng đổi, Cân xác 5g ngun liệu nghiền nhỏ, cho vào bao giấy sấy khô biết khối lượng Đặt bao giấy vào trụ chiết, Lắp trụ chiết vào bình cầu gắn ống sinh hàn Qua đầu ống sinh hàn, dùng phễu cho dung môi vào trụ chiết cho lượng dung mơi chảy xuống bình cầu lượng phễu chiết cịn đủ ngập mẫu Dùng bơng làm nút đầu ống sinh hàn Mở nước lạnh vào ống sinh hàn Điều chỉnh nhiệt độ trích ly cho chu kỳ hồn lưu dung mơi đạt từ đến lần Chiết – 12 trích ly hồn tồn hết chất béo Thử cách lấy vài giọt ether cuối ống xi phông nhỏ lên giấy lọc, dung mơi bay khơng để lại vết dầu loang kết thúc Cho ether chảy xuống hết bình cầu Lấy bao giấy ra, đặt tủ Hotte cho bay hết ether nhiệt độ thường cho vào tủ sấy, sấy 100 – 105oC 1.5 Để nguội bình hút ẩm, cân xác định khối lượng  Tính kết quả: Hàm lượng phần trăm chất béo tính theo cơng thức: 𝑋= 𝑀1 − 𝑀2 × 100 𝑚 Trong đó: M1: khối lượng bao giấy mẫu ban đầu, g M2: khối lượng bao giấy mẫu sau trích lipid sấy khơ, g m: khối lượng mẫu ban đầu, g Comment [NT13]: “lắp” 2.8 Xác định định tinh bột phƣơng pháp thủy phân enzyme Dùng enzyme alpha amylase glucose amylase thủy phân hồn tồn tinh bột thành glucose Sau xác định hàm lượng glucose tạo thành, từ tính lượng tinh bột có mẫu nguyên liệu  Dựng đường chuẩn glucose Pha dung dịch chuẩn: cân 0.1g glucose hòa tan vào nước cất, định mức lên 100mL, ta dung dịch glucose chuẩn mg/mL Tiến hành dựng đường chuẩn glucose bảng sau: Ống nghiệm Nồng độ, mg/mL 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Dung dịch glucose, mL 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 Nƣớc cất, mL 2.7 2.3 2.1 1.8 1.5 Thuốc thử DNS, mL 1 1 1 Đun sơi ống nghiệm phút (có đậy nút) Sau đó, làm nguội đến nhiệt độ phịng Tiến hành đo độ hấp thu dung dịch bước sóng 540nm, ghi nhận giá trị OD dựng đường chuẩn 0.7 y = 0.555x + 0.010 R² = 0.998 0.6 OD 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 Nồng độ glucose(mg/mL) Hình Hàm lượng đường khử theo thời gian  Cách xác định hàm lượng đường khử mẫu Tiến hành: Cân 2(g) chuyển vào becher sau thêm 30mL nước cất Khuấy đun sôi đến 90oC, sau cho 1mL enzyme alpha amylase vào tiến hành thủy phân vịng Sau làm nguội dung dịch xuống 60oC tiếp tục cho 1mL enzyme glucose amylase vào tiếp tục thủy phân vòng Kiểm tra dung dịch thủy phân hoàn toàn thuốc thử Liugon Tiến hành mẫu đối chứng cách khơng cho enzyme vào Sau ly tâm thu phần dịch lỏng, pha loãng mẫu để giá trị OD nằm đường chuẩn Chuẩn bị mẫu cần xác định hàm lượng đường khử theo tỷ lệ 3mL mẫu + 1mL thuốc thử DNS Đun sôi phút, đo ghi nhận giá trị OD Dựa vào phương trình đường chuẩn ta tính hàm lượng glucose mẫu Tính kết quả: TB = (Xtb-Xk)*0.9*V/m *100% Trong Xtb hàm lượng đường khử sau thủy phân Xk hàm lượng đường khử trước thủy phân 0.9 hệ số chuyển đồi từ glucose sang tinh bột Comment [NT14]: canh lề theo chế độ justify V: thể tích định mức m: khối lượng mẫu ban đầu 2.9 Xác định hàm lƣợng tro Tiến hành Đặt chén nung vào lò đốt nóng giữ 60 phút nhiệt độ 525± o 25 C, sau lấy đặt vào bình hút ẩm Khi nhiệt độ bình hút ẩm ngang với nhiệt độ mơi trường xung quanh cân chén nung với sai số không vượt ± 0,001g Lặp lại q trình đến khối lượng chén sứ khơng thay đổi Ghi nhận khối lượng chén sứ m1 Cân m(g) mẫu với sai số không lớn 0,001g, cho mẫu vào chén nung chuẩn bị sẵn Đặt chén vào lò nung nhiệt độ 525 ± 25oC khoảng 60 phút, làm nguội bình hút ẩm đến nhiệt độ mơi trường cân Q trình lặp lặp lại hiệu lần cân cuối không 0,001g.Ghi lại giá trị mẫu chén sứ sau nung m2 Tính kết Hàm lượng tro chung (X) tính phần trăm so x m2  m1  100 m Trong đó: m - khối lượng mẫu tính gam; m2 - khối lượng tro chén sứ sau nung, g; m1–khối lượng chén sứ, g; 2.10 Xác định hàm lƣợng amoniac  Nguyên tắc Đẩy muối amoni thể tự chất kiềm mạnh amoniac không quámạnh (như Mg(OH)2 hay Na2CO3) để tránh ảnh hưởng thực phẩm Dùng nước kéo ammoniac giải phóng thể tự sang bình chuẩn độ định lượng H2SO4 0,1N với alizarin natri sunfonat làm thị màu  Tiến hành - Trong phương pháp định lượng amoniac, nước sử dụng thiết amoniac hay muối amoni Do trước cất kéo amoniac để định lượng phải rửa máy cho thật kỹ để loại amoniac (nếu có) - Cân hút xác m(g) V(mL) mẫu, cho vào bình cầu B chứa nước trung tính cất kéo nước để rửa máy với 0.5mL thị màu Cho MgO bột vào tới có phản ứng kiềm rõ rệt (màu tím) Đậy nút để tránh amoniac bay ra.Để tránh bọt sủi phồng lên cho thêm vài giọt dầu paraffin cồn octylic - Đun sơi, nước bốc lên bình A, qua bình đựng thực phẩm B kéo NH3theo qua ống sinh hàn đọng lại, rơi xuống bình chuẩn độ D đựng sẵn nước trung tính, thị màu lượng xác định (mL) H2SO40.1N - Cất nước bay khơng cịn NH3 Hơi NH3 bay kết hợp với H2SO4 thành (NH4)2SO4 Chuẩn độ H2SO4 thừa dung dịch NaOH 0.1N Đầu chưng cất phải nhúng chìm vào dung dịch H2SO4 bình tam giác  Tính kết Hàm lượng NH3 1000g thực phẩm = 𝑉−𝑉𝑥 ∗1.7 Vm V: thể tích H2SO4 cho vào bình chuẩn độ Vx: thể tích NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ H2SO4 thừa Vm: thể tích mẩu lấy để định lượng Comment [NT15]: canh lề theo chế độ justify 2.11 Phân tích khối lƣợng phân tử phƣơng pháp điện di(Kittiphattanabawon, 2005) Điện di xác định phân tử lượng protein theo phương pháp Kittiphattanabawon cộng (2005)  Chuẩn bị mẫu: yêu cầu mẫu CH có nồng độ ≥ 3mg/mL Trộn mẫu CH với dung dịch đệm (5% β-mecaptol + 95% sample buffer) theo tỷ lệ 1:1 (v/v) Hỗn hợp gia nhiệt 95oC phút  Tạo giếng: pha gel 10% bơm vào khoảng trống kính, cài lược tạo miệng giếng Mẫu chuẩn bị bơm vào miệng giếng, đặt bảng gel vào bể điện di, cho dung dịch đệm vào chỉnh dòng điện 40V, cài đặt cường độ dòng điện số lượng giếng x 5mA  Sau chạy điện di xong, nhuộm màu bảng gel dung dịch chứa Co-omassie blue R-250 nồng độ 0,05% (w/v) methanol 15% (v/v) acetic 5% (v/v) 1-2 giờ, sau rửa giải dung dịch methanol 30% (v/v) acetic 5% (v/v) xuất vạch protein Comment [NT16]: canh lề theo chế độ justify 2.12 Phân tích thành phần acid amin tự phƣơng pháp HPLC(Chulaporn Kamnerdpetch, 2007) O-phthalaldehyde (OPA) dẫn xuấtđược sử dụng đểxác địnhcác nhómα-amin dịch thủy phân Proteinthủy phânđượckết tủabằng cách thêm0,4mLmethanolcho 0,1mLdịch thủy phânvà bảo quảntại4oCqua đêm Hỗn hợp đượcly tâm ở6000gtrong 15 phút Phần dịch lỏng đượccho qua màng lọccó kích thước mao quản0.22µmvàpha lỗng1:1 vớiđệmboratpH 8.0 Phân tích thực thiết bị sắc kí lỏng cao áp HPLC (Alliance HT system, module 2795, Waters, Milford, MA, USA) có cột Picotag C18 (4mm x 15cm) Các acid amin phát bước sóng 250nm nhờ máy đo độ hấp thu Tốc độ dòng chảyđã đượcgiữ ổn định ở1 mL /phútvới nhiệt độ30oC Comment [NT17]: canh lề theo chế độ justify ... VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ NGHIÊN CỨU THU NHẬN DỊCH ĐẠM THU? ?? PHÂN TỪ GLUTEN LÚA MÌ ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM Mã số: 2013/02-CNSHTPMT Xác nhận Chủ tịch HĐ nghiệm thu Chủ nhiệm đề tài (ký,... THIỆU Glutenlà protein lúa mì tách trình sản xuất bột mì Hiện nay, gluten lúa mì sử dụng chủ yếu để làm tăng độ dai, đàn hồi khối bột nhào sản xuất bánh mì giúp tạo cấu trúc cho sản phẩm thực phẩm. .. các peptides có phân tử lượng