Nghiên cứu biểu hiện kháng thể nanobody kháng her2 trong tế bào động vật hek293

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ PHƯỢNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG THỂ NANOBODY KHÁNG HER2 TRONG TẾ BÀO ĐỘNG VẬT HEK293 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ PHƯỢNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG THỂ NANOBODY KHÁNG HER2 TRONG TẾ BÀO ĐỘNG VẬT HEK293 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC MÃ SỐ: 60720408 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Lê Quang Huấn HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Để có được bản luận văn hoàn thiện ngày hôm nay, xin cho phép tôi được dành những trang đầu tiên để bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới: Đảng ủy, Ban giám hiệu Trường Đại Học Dược Hà Nội, Phòng đào tạo sau đại học, Bộ môn Hóa sinh dược, cùng các phòng ban của nhà trường đã hết sức giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện luận văn. Phó giáo sư, Tiến sỹ Lê Quang Huấn – Trưởng phòng Công nghệ tế bào động vật, Viện Công nghệ sinh học, Người trực tiếp dìu dắt, hướng dẫn tôi cả về mặt chuyên môn và phương pháp nghiên cứu khoa học trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Các Thầy giáo, Cô giáo trong hội đồng chấm luận văn Cao học, những Người đã hết sức tận tình góp những ý kiến vô cùng quý báu giúp tôi hoàn thiện bản luận văn. Cuối cùng tôi xin được thành kính bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Bố, đặc biệt là người Mẹ luôn thầm lặng dõi theo những bước đi của tôi, cảm ơn những người thân trong gia đình luôn động viên kịp thời để tôi an tâm học tập và hoàn thiện luận văn. Bên cạnh đó, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh, các chị, các bạn và các em, những người đã chia sẻ cùng tôi nhiều kiến thức hỗ trợ trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 30 tháng 08 năm 2014 Vũ Thị Phượng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. U NG THƯ VÚ 3 1.1.1. Khái niệm 3 1.1.2. Dịch tễ 3 1.1.3. Các yếu tố nguy cơ 4 1.1.4. Phân loại 7 1.1.5. Điều trị 9 1.2. K HÁNG NGUYÊN HER2 Đ Ặ C HI Ệ U T Ế BÀO UNG THƯ VÚ 9 1.2.1. Khái quát về gen her2 và kháng nguyên HER2 9 1.2.2. Cấu trúc của gen her2 và protein HER2 10 1.2.2.1. Cấu trúc gen her2 10 1.2.2.2. Cấu trúc protein HER2 10 1.2.3. Mô hình cơ chế gây UTV của gen her2 13 1.2.4. Thuốc điều trị ung thư vú với mục tiêu lâm sàng là HER2 14 1.3. K HÁI QUÁT CHUNG V Ề KHÁNG TH Ể VÀ KHÁNG TH Ể L Ạ C ĐÀ 16 1.3.1. Kháng thể lạc đà 17 1.3.2. Cấu trúc của nanobody 18 1.3.3. Ưu điểm của nanobody 20 1.3.4. Ứng dụng của nanobody 20 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. ĐỐ I TƯ Ợ NG NGHIÊN C Ứ U 23 2.1.1. Plasmid 23 2.1.2. Dòng vi khuẩn 23 2.1.3. Dòng tế bào 23 2.1.4. Hóa chất 23 2.2. P HƯƠNG PHÁP NGHIÊN C Ứ U 24 2.2.1. Nhân dòng gen Nb-antiHER2 25 2.2.1.1. Nhân bản gen Nb-antiHER2 bằng kỹ thuật PCR 25 2.2.1.2. Điện di ADN trên gel Agarose 26 2.2.1.3. Tinh sạch sản phẩm PCR 26 2.2.1.4. Phản ứng gắn gen Nb-antiHER2 vào vector pCR2.1 27 2.2.1.5. Thâm chuyển ADN plasmid vào tế bào E. Coli DH5α 27 2.2.1.6. PCR gen Nb – anti HER2 trên khuẩn lạc 28 2.2.1.7. Tinh sạch plasmid 29 2.2.2. Xây dựng cấu trúc vector biểu hiện pEGP-C2 30 2.2.2.1. Tích hợp oligonucleotid 6-histidine vào vector biểu hiện pEGFP – C2 30 2.2.2.2. Cắt vector pEGFP-C2 và plasmid pCR2.1-Nb- anti HER2 bằng enzym giới hạn 31 2.2.2.3. Tinh sạch sản phẩm cắt giới hạn bằng kit thôi gel Bioneer và gắn gen mã hóa Nb-antiHER. 32 2.2.3. Thâm chuyển ADN plasmid vào tế bào động vật 33 2.2.3.1. Thâm chuyển pEGFP- Nb - anti HER2 vào tế bào HEK 293 33 2.2.3.2. Kiểm tra gen Nb-antiHER trong tế bào HEK 293 sau khi chuyển gen 34 2.2.4. Phân tích protein thu được 34 2.2.4.1. Phương pháp điện di protein 35 2.2.4.2. Phương pháp Elisa 36 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 37 3.1. N HÂN DÒNG GEN MÃ HÓA KHÁNG TH Ể KHÁNG HER2 37 3.1.1. Nhân bản gen kháng thể kháng HER2 bằng phương pháp PCR 37 3.1.2. Nhân dòng gen Nb-antiHER2 bằng vector nhân dòng pCR2.1 trong tế bào vi khuẩn E.coli DH5α 38 3.2. X ÂY D Ự NG C Ấ U TRÚC VECTOR TÁI T Ổ H Ợ P 41 3.3. T HÂM CHUY Ể N PLASMID P EGFP-N B - ANTI HER2 VÀO T Ế BÀO Đ Ộ NG V Ậ T HEK 293 46 3.4. PHÂN TÍCH PROTEIN THU ĐƯỢC 48 3.4.1 Kiểm tra protein thu được bằng SDS-PAGE 48 3.4.2. Kiểm tra hoạt tính kháng thể thu được bằng phản ứng ELISA 49 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 51 4.1. X ÂY D Ự NG KHÁNG THỂ NANOBODY KHÁNG HER2 51 4.2. X ÂY D Ự NG PLASMID BI Ể U HI Ệ N P EGFP-C2 VÀ T Ế BÀO V Ậ T CH ỦHEK293 53 4.3. KẾ T QU Ả BI Ể U HI Ệ N KHÁNG TH Ể KHÁNG HER2 TRONG T Ế BÀO Đ Ộ NG V Ậ T . 54 KẾT LUẬN 55 KIẾN NGHỊ 56 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT bp Cặp bazơ (base pair) CBB Coomassie Blue Brillant BSA Albumin huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin) dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate ddNTP Dideoxyribonucleoside triphosphate dd H 2 O Nước cất loại ion, khử trùng (deionnized distilled H 2 O) E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside kb Kilobase kDa Kilodalton LB Luria Bertani OD Mật độ quang học (Optical Density) PAGE Điện di gel polyacrylamide (Polyarylamide Gel Electrophoresis) PBS Muối chứa đệm phosphate (Phosphate Buffered Saline) PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) PMSF Phenyl Methylsulphonyl Fluoride PVDF Polyvinylidere Fluoride SDS Sodium Dodecyl Sulphate TAE Tris base-Acetic-EDTA TEMED N,N,N’,N’-Tetramethyl-Ethylenediamine DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc của HER2 Hình 1.2: Hai con đường truyền tín hiệu qua thụ thể HER Hình 1. 3: Bất thường trong truyền tín hiệu do biểu hiện quá mức gen her2 Hình 1.4: Các dạng kháng thể từ trái qua phải: kháng thể thông thường, kháng thể lạc đà, nanobody (VHH) Hình 1.5: Sự khác biệt của kháng thể nanobody (VHH) và VH của kháng thể thông thường Hình 3.1: Điện di đồ sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi Nb-Fw và Nb-Rv. Hình 3.2: Điện di đồ sản phẩm PCR khuẩn lạc và plasmid pCR2.1-Nb-antiHER2 sau khi tinh sạch Hình 3.3: Điện di đồ sản phẩm sau khi cắt plasmid pCR2.1-NbG-antiHER2 bằng EcoRI Hình 3.4: Điện di đồ sản phẩm PCR khuẩn lạc và cắt plasmid bằng enzyme EcoRI Hình 3.5: Kết quả điện di đồ vector pEGFP-C2 và gen Nb-antiHER2 sau khi cắt bởi enzyme giới hạn. Hình 3.6: Điện di đồ sản phẩm sau PCR plasmid pEGFP-Nb-antiHER2 bằng cặp mồi đặc hiệu. Hình 3.7: Điện di đồ sau khi cắt plasmid pEGFP-Nb-antiHER2 bằng cặp enzyme BglII và EcoRI. Hình 3.8: Phân tích trình tự gen Nb-antiHER2 sau khi thâm chuyển vào vector pEGFP- C2. Hình 3.9: Hình ảnh tế bào HEK 293 sau thâm chuyển 2 ngày Hình 3.10: Điện di đồ sản phẩm PCR ADN tổng số tách từ tế bào HEK 293 sau thâm chuyển. Hình 3.11: Điện di đồ biểu hiện ban đầu của tế bào HEK 293 sau thâm chuyển. Hình 3.12 : Kết quả phản ứng ELISA Hình 3.13 : Biểu đồ kết quả xác định khả năng nhận biết và gắn kết của phức hệ kháng nguyên kháng thể bằng kỹ thuật ELISA DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen Nb-anti Her2 Bảng 2.2: Thành phần của phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pCR2.1 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR gen Nb-antiHER2 trên khuẩn lạc Bảng 2.4: Thành phần phản ứng cắt cắt vector pEGFP-C2 và plasmid pCR2.1- Nb- anti HER2 bằng enzyme giới hạn Bảng 2.5: Thành phần phản ứng gắn gen mã hóa Nb-antiHER2 vào vector biểu hiện pEGFP-C2 Bảng 2.6: Thành phần gel tách mẫu và gel cô mẫu Bảng 3.1 : Kết quả đo quang phổ sản phẩm phản ứng ELISA 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư vú là ung thu phổ biến nhất đối với phụ nữ và là nguyên nhân thứ 2 gây tử vong do ung thư ở nữ giới, chiếm khoảng 10% trên toàn bộ các ca gây tử vong ở các nước phương Tây. Tại Việt Nam năm 2010 ước tính có khoảng 12.533 trường hợp mới mắc, cao gấp đôi so với năm 2000 với 5.538 trường hợp. Tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi là 30/100.000 phụ nữ, đứng đầu trong ung thư nữ giới, cao gấp đôi so với loại ung thư xếp thứ 2 là ung thư đại trực tràng 15/100.000 phụ nữ [3]. HER2 là một loại thụ thể thuộc họ các yếu tố phát triển biểu mô (Human Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR), có hoạt tính tyrosine kinase, đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và biệt hoá tế bào. Biểu hiện quá mức HER2 có thể biến đổi tế bào thành dạng ác tính và làm tăng quá trình hình thành khối u. Theo nhiều nghiên cứu gần đây, khoảng 25-30% bệnh nhân ung thư vú cho thấy có sự khuếch đại gen her2 hoặc biểu hiện quá mức gen này trong các tế bào ung thư.Thời gian kéo dài sự sống và thời gian tái phát bệnh nhân ung thư vú dương tính HER2 là ngắn hơn đáng kể so với bệnh nhân không có biểu hiện quá mức HER2. Theo các nghiên cứu in vitro cho thấy rằng ức chế biểu hiện HER2 gây ra sự chết theo chương trình (apoptosis) đáng kể trong các tế bào ung thư vú. Đặc điểm này làm cho HER2 trở thành một marker hữu hiệu để chẩn đoán và điều trị ung thư vú cũng như đích tấn công một số ung thư biểu mô khác [48]. Điều trị ung thư vú cũng như nhiều loại ung thư khác theo các liệu pháp truyền thống như hoá trị liệu và xạ trị liệu mặc dù hiệu quả tiêu diệt khối u cao nhưng lại có một nhược điểm rất lớn, đó là tác dụng lên cả các cơ quan bình thường xung quanh. Mặt khác, các phương pháp này đa phần chỉ áp dụng đối với trường hợp các khối u đã phát triển và ở giai đoạn muộn nên có hiệu quả điều trị thấp. Hiện nay, 2 kháng thể đơn dòng được FDA phê chuẩn dùng trong điều trị ung thư vú dương tính HER2 là tratuzumab và petuzumab. Đây là 2 kháng thể [...]... vú Mục tiêu chính của nghiên cứu là: Tạo được kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu với kháng nguyên HER2 trong tế bào động vật Trong nghiên cứu này chúng tôi hướng đến việc xây dựng một vector biểu hiện phù hợp có thể tạo điểu kiện thuận lợi cho việc biểu hiện kháng thể nanobody kháng HER2 trong tế bào động vật từ đó làm cơ sở cho việc sản xuất, tinh chế, ứng dụng sản phẩm trong nghiên cứu in vitro và in vivo,... đầu có hiện tượng kháng thuốc [12] Để góp phần nghiên cứu nhằm tạo các bộ kít chẩn đoán và các loại thuốc có hiệu quả điều trị cao đối với dạng ung thư vú dương tính với HER2 chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu biểu hiện kháng thể nanobody kháng HER2 trong tế bào động vật HEK293 Với mục tiêu chính là: Tạo được kháng thể nanobody tái tổ hợp đặc hiệu với kháng nguyên HER2 trong tế bào động vật HEK293. .. nhiều kháng thể được chấp thuận Kỹ thuật kháng thể đơn dòng cũng cho phép các nhà khoa học phát triển và sản xuất nhiều kháng thể khác nhau: kháng thể đơn dòng tái tổ hợp, các kháng thể khảm và kháng thể đa dòng tái tổ hợp Kháng thể đơn dòng có thể gây ra tác dụng của mình thông qua kích hoạt hoạt tính gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể dẫn đến quá trình chết theo lập trình - apoptosis của tế bào và... vùng kháng Ampicilin vùng kháng Kanamycine, vùng Multiple Cloning Site (vùng đa điểm cắt – MCS) + Vector pEGFP – C2 dùng để biểu hiện protein được cung cấp bởi Phòng Công nghệ tế bào động vật 2.1.2 Dòng vi khuẩn Chủng E Coli được sử dụng để biểu nhân bản ADN plasmid trong nghiên cứu này là chủng DH 5α từ công ty Macrogen (Hàn Quốc) 2.1.3 Dòng tế bào Dòng tế bào sử dụng trong nghiên cứu này là dòng tế bào. .. Promega (Mỹ) - Kháng nguyên HER2 được tổng hợp và cung cấp bởi phòng công nghệ tế bào động vật - Các hóa chất cần thiết khác đều có độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu sinh học phân tử 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu Gen mã hóa kháng thể nanobody kháng HER2 (Nb-antiHER2) Gắn trình tự mã hóa enzym giới hạn BglII và Eco RI vào đầu 5, 3’ gen Nb-antiHER2, nhân dòng gen bằng vector pCR2.1 Vector biểu hiện pGFP-C2... sinh ung thư do sự biểu hiện quá mức của HER2 Biểu hiện quá mức của gen her2 là nguyên nhân của sự tăng dimer hóa HER2EGFR dẫn tới sự tăng sinh và sự xâm lấn của tế bào Sự tăng dimer hóa đồng hình HER2 làm mất tính phân cực của tế bào Sự tăng dimer HER2- HER3 có ảnh hưởng tới sự tăng sinh, khả năng tồn tại, tính xâm lấn và chức năng trao đổi chất của tế bào Tăng biểu hiện quá mức của HER2 dẫn tới tăng... vào vector Cắt gen Nb-antiHER2 bằng enzym giới hạn BglII và EcoRI Cắt vector bằng enzym giới hạn BglII và EcoRI Gen Nb-antiHER2 có đầu cắt bởi enzym giới hạn Vector pEGFP-C2 có đầu cắt bởi enzym giới hạn Gắn gen Nb-antiHER2 vào vector biểu hiện thu được plasmid pEGFP-Nb-antiHER2 Biến nạp plasmid vào tế bào động vật HEK293 Biểu hiện và thu kháng thể Nb-antiHER2 Phân tích kháng thể bằng SDS-PAGE, test... thụ thể thuộc yếu tố tăng trưởng [29] Hơn nữa những tiến bộ của công nghệ tái tổ hợp kháng thể đã dẫn đến sự ra đời các dạng mới của kháng thể đơn dòng trong điều trị như các miền kháng thể hoặc các mảnh kháng thể khuyết vùng Fc – vùng hằng định Chúng bao gồm vùng biến đổi – Fab, mảnh kháng thể đơn chuỗi – scFv, miền kháng thể - dads, kháng thể bispesific và intrabodies 16 [16] Mặc dù không phải là kháng. .. vài liệu pháp đích là các kháng thể mà có cơ chế hoạt động giống với các kháng thể được tạo ra trong tự nhiên bởi hệ thống miễn dịch của chúng ta Những loại liệu pháp đích này đôi khi được gọi là các liệu pháp đích miễn dịch [2] 1.2 Kháng nguyên HER2 đặc hiệu tế bào ung thư vú 1.2.1 Khái quát về gen her2 và kháng nguyên HER2 Đặc điểm của các kháng nguyên trên bề mặt các tế bào ung thư là luôn luôn biến... cho kháng thể nanobody có tính ổn định hơn so với VH [13] Hình 1.5: Sự khác biệt của kháng thể nanobody (VHH) và VH của kháng thể thông thường 19 1.3.3 Ưu điểm của nanobody Các nhà khoa học đã nghiên cứu về cấu trúc và trình tự của nhiều nanobody, kết quả cho thấy nanobody tự nhiên có sự tương đồng hơn 80% so với vùng VH của người Từ đó có thể thay thế một lượng nhỏ các axit amin trong vùng VH của nanobody . Nghiên cứu biểu hiện kháng thể nanobody kháng HER2 trong tế bào động vật HEK293 . Với mục tiêu chính là: Tạo được kháng thể nanobody tái tổ hợp đặc hiệu với kháng nguyên HER2 trong tế bào động. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ PHƯỢNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG THỂ NANOBODY KHÁNG HER2 TRONG TẾ BÀO ĐỘNG VẬT HEK293 LUẬN VĂN THẠC SĨ. GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ PHƯỢNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG THỂ NANOBODY KHÁNG HER2 TRONG TẾ BÀO ĐỘNG VẬT HEK293 LUẬN VĂN