bào vi khuẩn E.coli DH5α
Sau khi tinh sạch bằng kit tinh sạch GeneJET PCR, sản phẩm PCR được tích hợp vào vector nhân dòng pCR2.1 sau đó thâm chuyển vào vi khuẩn E.coli
DH5α. Vi khuẩn sau đó được nuôi cấy trong đĩa thạch có chứa 100µg ampicilin, 50µg kanamycin, 40µg/ml cơ chất X-gal và 100mM chất cảm ứng IPTG và nuôi cấy trong tủ ấm 370C qua đêm. Sau quá trình biến nạp chúng tôi thu được 3 khuẩn lạc màu trắng và một khuẩn lạc mầu xanh trong đĩa thạch chứa gen NbG-antiHER2, tuy nhiên chúng tôi chỉ thu được một khuẩn lạc mầu trắng và không có khuẩn lạc mầu xanh nào trên đĩa chứa gen NbA-antiHER2.
Trước tiên, để kiểm tra xem gen NbG-anti HER2 đã gắn được vào vector nhân dòng pCR2.1 hay chưa, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự nucletotit ở hai đầu của trình tự MCS của vector (M13-Fw:; M13-Rw). Sản phẩm được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8 %. Kết quả cho thấy khuẩn lạc mầu trắng với đường 1 và đường 3 cho kết quả dương tính với băng AND kích thước khoảng 620 bp giống như kích thước dự kiến trên lý thuyết gồm: 426 bp của gen NbG-antiHER2 và 200 bp từ vector (hình 3.2A). Đường 2 cho ra băng có kích thước lạ. Trong khi đó khi điện di khuẩn lạc mầu xanh cho ra một băng DNA khoảng 200 bp như mong đợi.
Ngoài ra, sau khi tinh sạch plasmid và đem điện di trên gel agarose 0,8% chúng tôi cũng thu được kết quả tương tự: plasmid tại làn 1, làn 3 ở vị trí cao hơn so với làn chứa plasmid tinh sạch từ mẫu khuẩn lạc mầu xanh ( Hình 3.2B).
39
Hình 3.2: Điện di đồ sản phẩm PCR khuẩn lạc và plasmid pCR2.1-Nb- antiHER2 sau khi tinh sạch
(A): Đường 1, 2,3: sản phẩm PCR khuẩn lạc mầu trắng; Đường 4: sản phẩm PCR khuẩn lạc mầu xanh. (B) Đường 1,2,3,4 plasmid sau tinh sạch tương ứng với 3 khuẩn lạc mầu trắng và 1 khuẩn lạc mầu xanh.
Theo kết quả trên chúng tôi có thể bước đầu khẳng định gen NbG- antiHER2 đã gắn được vào vector pCR2.1. Mặt khác để khẳng định chính xác thêm một lần nữa, chúng tôi tiến hành phản ứng cắt enzym của enzym EcoRI với tất cả các plasmid. Theo lý thuyết nếu gen NbG-antiHER2 đã tích hợp thành công vào vector pCR2.1 thì các plasmid tái tổ hợp chứa gen này khi bị cắt bởi enzym EcoRI sẽ giải phóng ra đoạn ADN có kích thước xấp xỉ 450bp. Do đó, plasmid tách từ khuẩn lạc mầu xanh sẽ bị cắt mở vòng (Hình 3.3).
40
Hình 3.3: Điện di đồ sản phẩm sau khi cắt plasmid pCR2.1-NbG-antiHER2 bằng EcoRI.
Đường 1, 2, 3: Plasmid từ khuẩn lạc mầu trắng sau khi cắt bởi EcoRI; Đường 4: Plasmid từ khuẩn lạc mầu xanh sau khi cắt bởi EcoRI
Tương tự, khuẩn lạc mầu trắng trên đĩa thạch biến nạp gen NbA-antiHER2 được dùng làm khuôn trong phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu NbA-Fw/Rw, sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0.8%. Kết quả như trên hình 3.4A chỉ ra sự xuất hiện một băng ADN kích thước khoảng 420bp, phù hợp với kích thước tính toán. Mặt khác, plasmid sau khi tinh sạch từ khuẩn lạc và được cắt với enzym giới hạn EcoRI cũng cho ra băng xấp xỉ 450 bp (hình 3.4 B). Như vậy, gen NbA-antiHER2 cũng đã được tích hợp thành công vào vector nhân dòng pCR2.1.
41
Hình 3.4: Điện di đồ sản phẩm PCR khuẩn lạc và cắt plasmid bằng enzym
EcoRI.
(A) M: marker ADN 1kb; Đường 1: sản phẩm PCR khuẩn lạc mầu trắng. (B) M:
marker ADN 1kb; Đường 1: Sản phẩm sau khi cắt plasmid pCR2.1-NbA- antiher2 bằng EcoRI.