Dựa vào tác dụng của CaCl2, thành tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho ADN có thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi sốc nhiệt.
28
Cách tiến hành
* Chuẩn bị tế bào khả biến
- Lấy chủng tế bào được cất giữ ở -200C.
- Pha loãng dịch giữ chủng theo tỉ lệ 1:20ml LB lỏng. Nuôi lắc qua đêm ở 37oC, 200v/p.
- Cấy chuyển 2% dịch nuôi tế bào qua đêm sang 10 ml môi trường LB lỏng. Nuôi lắc ở 370C, 200v/p trong 150 phút đến khi mật độ quang học OD600 đạt 0.5-0.7.
- Chuyển dịch tế bào sang ống falcon vô trùng, để trên đá 10 phút. - Ly tâm thu sinh khối (4000v/p, 40C trong 5 phút).
- Loại dịch nổi, đặt ống chứa tế bào trong đá 10 phút. - Hòa tan cặn tế bào trong 2ml CaCl2 100mM, búng nhẹ. - Đặt ống tế bào trong đá 30 phút.
- Ly tâm 4000v/p trong 5 phút.
- Hoà lại tế bào trong 300µl CaCl2 100mM, búng nhẹ cho tan hết tế bào. - Để ống tế bào trên đá trước khi sử dụng tối thiểu 1h.
* Thâm chuyển vào E. coli
- Trộn 6µl dung dịch tích hợp trên với tế bào khả biến, sau đó để trên đá 30 phút tạo điều kiện cho vector bám trên thành tế bào.
- Sốc nhiệt ở 420C, 45 giây. Đặt trên đá 2 phút.
- Bổ sung 300µl LB lỏng vào hỗn hợp thâm chuyển, nuôi lắc (200vòng/phút) ở 370C trong 1giờ.
- 50µl hỗn hợp thâm chuyển được trải cấy trên đĩa LB đặc có chứa 100µg ampicilin, 50µg kanamycin, 40µg/ml cơ chất X-gal và 100mM IPTG và nuôi cấy trong tủ ấm 370C qua đêm.