Màng tế bào sẽ bị dung giải bằng SDS để giải phóng plasmid. Trong môi trường kiềm ADN nhân sẽ bị biến tính và kết tủa khi hỗn hợp được trung hòa bằng acid nhưng plasmid do có cấu trúc siêu xoắn nên quá trình biến tính xảy ra ở mức độ vừa phải và sẽ hồi tính khi trung hòa. Do vậy, plasmid sẽ được tách riêng ra khỏi ADN nhân. Mặt khác, sự phá vỡ màng tế bào được điều khiển bằng thời gian tiếp xúc với SDS sao cho màng nhân không bị phá hủy, sự giải phóng DNA nhân là tối thiểu.
Tiến hành:
- Các khuẩn lạc mầu trắng cho kết quả PCR dương tính cùng với khuẩn lạc mầu xanh được cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung 50 µg/ml kanamycin và 100 µg/ml ampicilin, được nuôi cấy lắc qua đêm ở nhiệt độ 370C, 200vòng/phút.
- Dịch nuôi cấy được ly tâm ở 12000 vòng/phút trong vòng 1 phút ở 40C để thu tế bào.
- Tủa tế bào được tái hòa tan trong 150µl dung dịch I chứa: 50 mM glucose,
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Khuẩn lạc mầu trắng
2 Dream Taq buffer2X 6,5 3 Mồi xuôi M13 0,5 4 Mồi ngược M13 0,5 5 DdH2O 5,5
30 25 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8.
- Dung dịch tiếp tục được trộn nhẹ nhàng với 200 µl dung dịch II chứa: 0.2N NaOH, 1 % SDS trong vòng 3 -5 phút nhằm tránh giải phóng DNA của nhân.
- Tiếp đến được trung hòa bằng 150µl dung dịch III chứa: 60 mM CH3COOK 5M, 11.5 ml acetic acid, 28.5 ml H2O bằng cách bổ sung và đảo ngược ống effendorf 4-6 lần.
- Bổ sung dung dịch hỗn hợp Phenol: Cloroform: Isoamylalcohol (25:24:1) vào hỗn hợp trên theo tỷ lệ thể tích 1:1, lắc mạnh và ly tâm ở 12000 vòng/phút trong vòng 20 phút. Hút lớp trên cùng một cách cẩn thận và chuyển sang một ống eppendorf mới.
- Sau đó, DNA đã được tủa với Isopropanol theo tỷ lệ thể tích 1:2. Hỗn hợp được để ở -200C trong vòng ít nhất 1 giờ.
- Tiếp đến ly tâm 12 000 vòng/phút trong 20 phút, loại bỏ phần nổi. Bổ sung 700µl ethanol 70% vào ống trước khi ly tâm tiếp 12 000 vòng/phút trong 10 phút và loại bỏ phần nổi một lần nữa.
- Sau khi sấy khô trong 10 phút, các plasmid kết tủa được tái hòa tan bằng cách thêm 30µl nước tinh khiết chứa RNAase và ủ ở 370C trong vòng 30 phút.
- Các plasmid được bảo quản ở - 200C.