21
hòa tan tốt, hoạt tính giống như kháng thể hoàn chỉnh, ái lực cao, tính ổn định cao trong cả điều kiện nhiệt độ và pH khắc nhiệt, dễ dàng biểu hiện trong nhân sơ và nhân chuẩn, nanobody là mục tiêu nghiên cứu, ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị bệnh [43]. Thực tế nanobody đã được sử dụng trong một số phòng thí nghiệm như một công cụ nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị bệnh. Một số đã được ứng dụng trong chẩn đoán, điều trị các bệnh như: nhiễm trùng, ung thư.
Nanobody có khả năng nhận biết các enzym nhờ đó được ứng dụng trong điều trị nhiều bệnh. Một ví dụ điển hình là bệnh ngủ được điều trị thành công với nanobody do chúng có khả năng liên kết với một protein vỏ trypanosome và hợp nhất các enzym apolipoprotien L-1 dẫn đến việc phân giải trypanosome [5]. Trong lĩnh vực ung thư nanobody được sử dụng như một nhân tố đích, cụ thể nanobody có khả năng kháng CEA (Carcinembryonic Antigen) - một chất chỉ điểm cho nhiều loại ung thư ở người do đó nanobody được kết hợp với β – lactamase. Sự liên hợp này sẽ có khả năng chuyển tiền chất thuốc không độc được truyền vào thành thuốc có độc tính trong tế bào khối u đích và tiêu diệt tế bào này [9]. Một số phương pháp điều trị ung thư hoặc các bệnh viêm nhiễm dựa vào ngăn chặn các tương tác phân tử. Nanobody hướng đến mục tiêu ngăn chặn các yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGFR) bằng cách liên kết với thụ thể của chúng, vì vậy nanobody được sử dụng trong điều trị các khối u rắn [45]. Hơn thế nữa nanobody kết hợp với yếu tố hoại tử khối u TNF-α dùng trong điều trị viêm khớp dạng thấp. Nanobody liên kết với lipopolysaccharide (LPS) được dùng trong điều trị bệnh nhiễm trùng máu [7].
Với khả năng lọt qua hàng rào máu não nhờ kích thước nhỏ, nanobody được lựa chọn để nghiên cứu điều trị các rối loạn thần kinh [21]. Nanobody đặc hiệu Bax đã được biểu hiện trong tế bào chất (gọi là kháng thể nội bào) để ngăn cản quá trình apotosis được cảm ứng bởi sự thiếu oxy trong một vài bệnh thoái hóa thần kinh. Cũng chính nhờ tính ổn định của nanobody mà chúng đặc biệt thích hợp trong sản xuất nội bào [21, 46]. Ngoài ra nanobody còn thích hợp cho những ứng dụng đòi hỏi tính ổn định cao như dùng trong sản xuất chất cảm biến
22 sinh học [37].
Nanobody với những ưu điểm nổi trội của nó đã trở thành ứng viên tốt nhất để tìm ra phương pháp điều trị ung thư mới đặc biệt trong điều trị ung thư vú. Mục tiêu chính của nghiên cứu là: Tạo được kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu với kháng nguyên HER2 trong tế bào động vật. Trong nghiên cứu này chúng tôi hướng đến việc xây dựng một vector biểu hiện phù hợp có thể tạo điểu kiện thuận lợi cho việc biểu hiện kháng thể nanobody kháng HER2 trong tế bào động vật từ đó làm cơ sở cho việc sản xuất, tinh chế, ứng dụng sản phẩm trong nghiên cứu in vitro và in vivo, dựa trên kết quả đưa ra phương pháp mới trong điều trị ung thư vú.
23
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Plasmid
+ Plasmid tái tổ hợp pENo8H (Entelechon, Germany) và pBSK (Epoch Life Science, Texax, US). Hai plasmid này đều chứa đoạn gen mã hóa kháng thể nanobody kháng HER2 tuy nhiên có khác nhau về trình tự dẫn.
+ Vector pCR2.1 được mua từ Invitrogen (CA, Mỹ) chứa các vùng chính: vùng promoter Lac vùng Lac Zα, vùng kháng Ampicilin vùng kháng Kanamycine, vùng Multiple Cloning Site (vùng đa điểm cắt – MCS).
+ Vector pEGFP – C2 dùng để biểu hiện protein được cung cấp bởi Phòng Công nghệ tế bào động vật.
2.1.2. Dòng vi khuẩn
Chủng E. Coli được sử dụng để biểu nhân bản ADN plasmid trong nghiên cứu này là chủng DH 5α từ công ty Macrogen (Hàn Quốc)
2.1.3. Dòng tế bào
Dòng tế bào sử dụng trong nghiên cứu này là dòng tế bào HEK 293 (Human Embryonic Kidney 293).
2.1.4. Hóa chất
- Oligonucleotid được tổng hợp từ công ty Macrogen (Hàn Quốc). - Endonuclease mua từ BioLabs (Anh).
- Enzym T4 ligase từ Promega (Mỹ).
- Thang chuẩn ADN và Protein nhuộm sẵn từ Promega (Mỹ).
- Kháng nguyên HER2 được tổng hợp và cung cấp bởi phòng công nghệ tế bào động vật.
- Các hóa chất cần thiết khác đều có độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu sinh học phân tử.
24
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Cắt gen Nb-antiHER2 bằng enzym giới hạn
BglII và EcoRI
Gen Nb-antiHER2 có đầu cắt bởi enzym giới hạn
Vector biểu hiện pGFP-C2
Cắt vector bằng enzym giới hạn
BamHI và XhoI, gắn đoạn oligonucleotid 6-His vào vector
Cắt vector bằng enzym giới hạn
BglII và EcoRI
Vector pEGFP-C2 có đầu cắt bởi enzym giới hạn
Gắn gen Nb-antiHER2 vào vector biểu hiện thu được plasmid pEGFP-Nb-antiHER2
Biến nạp plasmid vào tế bào động vật HEK293
Biểu hiện và thu kháng thể Nb-antiHER2
Phân tích kháng thể bằng SDS-PAGE, test ELISA Gắn trình tự mã hóa enzym giới hạn BglII và
Eco RI vào đầu 5, 3’ gen Nb-antiHER2, nhân dòng gen bằng vector pCR2.1
Gen mã hóa kháng thể nanobody kháng HER2 (Nb-antiHER2)
25
2.2.1. Nhân dòng gen Nb-antiHER2
2.2.1.1. Nhân bản gen Nb-antiHER2 bằng kỹ thuật PCR
Cơ sở của phương pháp PCR là dựa vào đặc tính hoạt động của DNA- polymerase. Trong thực nghiệm, sử dụng đoạn mồi có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA-polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Các đoạn ADN mới lại được sử dụng làm khuôn, sau một chu kỳ thì số lượng đoạn ADN được nhân lên theo cấp số nhân. Một gen trong một thời gian ngắn có thể được nhân lên hàng triệu lần.
Đoạn gen kháng thể nanobody kháng HER2 (Nb-antiHER2) được khuếch đại bằng phản ứng PCR từ plasmid tái tổ hợp pENo8H (Entelechon, Germany) và pBSK (Epoch Life Science, Texax, US). Trong đó sử dụng cặp mồi đặc hiệu chứa enzym giới hạn BglII tại đầu 5’ và EcoRI tại đầu 3’ (vị trí cắt enzym giới hạn được thể hiện bằng chữ có gạch chân). Đặc biệt ở đây chúng tôi có 2 gen Nb-antiHER2 khác nhau về trình tự dẫn, do vậy hai gen này khác nhau về mồi xuôi Fw nhưng có chung mồi ngược Rv. Trình tự của mồi như sau:
NbG-Fw: 5’-GTC GAC AGA TCT ATG AAA CAT CTG TGG -3’ (BglII) NbA-Fw: 5’-GTC GAC AGA TCT ATG GGC GTG AAA G-3’ (BglII) Nb-Rv: 5’-TGA ATT CGG TGA CCT GGG TCC CCT GG-3’ (EcoRI)
Cách tiến hành
Trộn phản ứng PCR với khuôn là pENo8H và pBSK mang gen mã hóa kháng thể nanobody kháng HER2. Thành phần của phản ứng PCR như sau:
Bảng 2.1: Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen Nb-anti Her2
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 pBSK hoặc pENo8H 0,5 2 Nb-Fw 10pmol 1 3 Nb-Rv 1 4 dNTPs 2mM 2.5 5 Taq polymerase 0,5
26
6 Đệm Taq polymerase 2,5
7 Dd H2O 17
Tổng thể tích 25
Chạy máy PCR với chu trình nhiệt được thực hiện trên máy Veriti® thermocycler (Applied Biosystem, US) như sau: Biến tính ở 940C: 3 phút; Thực hiện 30 chu kỳ phản ứng liên tiếp với chu trình nhiệt: biến tính 940C – 45 giây, bắt cặp 500C – 30 giây, kéo dài 720C - 45 giây; Cuối cùng để ở 720C – 8 phút để hoàn tất phản ứng; sau đó sản phẩm được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
2.2.1.2. Điện di ADN trên gel Agarose
Các phân tử ADN là các polyanion nên trong môi trường trung tính và kiềm, dưới tác dụng của điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương. Mức di chuyển của các phân tử ADN trong điện trường phụ thuộc chủ yếu vào kích thước của chúng và nồng độ gel.
Tiến hành:
- Gel agarose được chuẩn bị trong đệm TAE với nồng độ EDTA 1-2nM để tránh sự phâm cắt ADN bởi nuclease.
- Mẫu ADN được trộn với đệm mẫu có chứa chất chỉ thị màu là bromophenol xanh sau đó tra vào giếng.
- Tiến hành điện di với điện thế ổn định khoảng 10volt/cm gel và chạy trong vòng 30 phút.
- Sau khi kết thúc điện di bảng gel được lấy ra soi và chụp ảnh dưới ánh sáng tử ngoại của máy gel Doc (Bio – Rad).
2.2.1.3. Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩn PCR sau đó được tinh sạch bằng GeneJET PCR purification Kit (Thermo Scientific, US) qua các bước sau:
- Bổ sung đệm Binding Buffer với tỷ lệ thể tích 1 đệm 1 thể tích dung dịch ADN cần tinh sạch. Đảo đều, chuyển dịch sang cột tinh sạch GeneJET.
27
- Bổ sung 500µl đệm rửa đã pha cồn, để 1 phút, ly tâm như trên, loại dịch. - Ly tâm thêm một lần nữa để loại hoàn toàn đệm rửa, đặt cột vào ống Eppendorf mới.
- Dùng 30µl nước tinh khiết nhỏ vào cột, ủ trong vòng 2 phút sau đó đem ly tâm để thu ADN vào ống Eppendorf.
Các sản phẩn PCR tinh sạch được bảo quản ở - 200C.
2.2.1.4. Phản ứng gắn gen Nb-antiHER2 vào vector pCR2.1
Các sản phẩm PCR tinh khiết sau đó được nhân dòng lên với số lượng lớn bằng cách tích hợp với vector pCR2.1 trong đó sử dụng bộ TA Cloning Kit (Invitrogen, U.S).
Sản phẩm PCR được tổng hợp với sự xúc tác của enzym Taq DNA polymerase sẽ có đầu A do hoạt tính gắn thêm đầu tận cùng không phụ thuộc vào trình tự khuôn của enzym Taq DNA polymerase. Trong khi đó, vector nhân dòng pCR2.1 của Invitrogen được thiết kế chứa gốc thymidine monophosphate (T) ở đầu 3’.
Tiến hành: Thành phần của phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector
pCR2.1 được thể hiện trong bảng 2.2.
Bảng 2.2: Thành phần của phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector pCR2.1
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Sản phẩm PCR 4 2 Đệm 1X 1 3 Vector pCR2.1 1 Tổng thể tích 6
Hỗn hợp phản ứng gắn được ủ ở nhiệt độ 220C trong thời gian 3giờ sau đó được giữ tại 4 0C trong thời gian chuẩn bị để thâm chuyển vào tế bào.
2.2.1.5. Thâm chuyển ADN plasmid vào tế bào E. Coli DH5α
Dựa vào tác dụng của CaCl2, thành tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng trở nên xốp, tạo điều kiện cho ADN có thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi sốc nhiệt.
28
Cách tiến hành
* Chuẩn bị tế bào khả biến
- Lấy chủng tế bào được cất giữ ở -200C.
- Pha loãng dịch giữ chủng theo tỉ lệ 1:20ml LB lỏng. Nuôi lắc qua đêm ở 37oC, 200v/p.
- Cấy chuyển 2% dịch nuôi tế bào qua đêm sang 10 ml môi trường LB lỏng. Nuôi lắc ở 370C, 200v/p trong 150 phút đến khi mật độ quang học OD600 đạt 0.5-0.7.
- Chuyển dịch tế bào sang ống falcon vô trùng, để trên đá 10 phút. - Ly tâm thu sinh khối (4000v/p, 40C trong 5 phút).
- Loại dịch nổi, đặt ống chứa tế bào trong đá 10 phút. - Hòa tan cặn tế bào trong 2ml CaCl2 100mM, búng nhẹ. - Đặt ống tế bào trong đá 30 phút.
- Ly tâm 4000v/p trong 5 phút.
- Hoà lại tế bào trong 300µl CaCl2 100mM, búng nhẹ cho tan hết tế bào. - Để ống tế bào trên đá trước khi sử dụng tối thiểu 1h.
* Thâm chuyển vào E. coli
- Trộn 6µl dung dịch tích hợp trên với tế bào khả biến, sau đó để trên đá 30 phút tạo điều kiện cho vector bám trên thành tế bào.
- Sốc nhiệt ở 420C, 45 giây. Đặt trên đá 2 phút.
- Bổ sung 300µl LB lỏng vào hỗn hợp thâm chuyển, nuôi lắc (200vòng/phút) ở 370C trong 1giờ.
- 50µl hỗn hợp thâm chuyển được trải cấy trên đĩa LB đặc có chứa 100µg ampicilin, 50µg kanamycin, 40µg/ml cơ chất X-gal và 100mM IPTG và nuôi cấy trong tủ ấm 370C qua đêm.
2.2.1.6. PCR gen Nb – anti HER2 trên khuẩn lạc
Tiến hành: Sau thâm chuyển, các khuẩn lạc màu trắng được sử dụng làm mẫu
cho phản ứng PCR. Một hỗn hợp phản ứng bao gồm các thành phần sau:
29
Trong khi đó khuẩn lạc mầu xanh được nhân bản dùng làm mẫu đối chứng âm. Chạy máy PCR với chu trình nhiệt được thực hiện trên máy Veriti® thermocycler (Applied Biosystem, US) như sau: Biến tính ở 940C: 3 phút; Thực hiện 35 chu kỳ phản ứng liên tiếp với chu trình nhiệt: biến tính 940C – 30 giây, bắt cặp 520C – 45 giây, kéo dài 720C – 1 phút; cuối cùng để ở 720C – 8 phút để hoàn tất phản ứng, sau đó sản phẩm được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
2.2.1.7. Tinh sạch plasmid
Màng tế bào sẽ bị dung giải bằng SDS để giải phóng plasmid. Trong môi trường kiềm ADN nhân sẽ bị biến tính và kết tủa khi hỗn hợp được trung hòa bằng acid nhưng plasmid do có cấu trúc siêu xoắn nên quá trình biến tính xảy ra ở mức độ vừa phải và sẽ hồi tính khi trung hòa. Do vậy, plasmid sẽ được tách riêng ra khỏi ADN nhân. Mặt khác, sự phá vỡ màng tế bào được điều khiển bằng thời gian tiếp xúc với SDS sao cho màng nhân không bị phá hủy, sự giải phóng DNA nhân là tối thiểu.
Tiến hành:
- Các khuẩn lạc mầu trắng cho kết quả PCR dương tính cùng với khuẩn lạc mầu xanh được cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung 50 µg/ml kanamycin và 100 µg/ml ampicilin, được nuôi cấy lắc qua đêm ở nhiệt độ 370C, 200vòng/phút.
- Dịch nuôi cấy được ly tâm ở 12000 vòng/phút trong vòng 1 phút ở 40C để thu tế bào.
- Tủa tế bào được tái hòa tan trong 150µl dung dịch I chứa: 50 mM glucose,
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Khuẩn lạc mầu trắng
2 Dream Taq buffer2X 6,5 3 Mồi xuôi M13 0,5 4 Mồi ngược M13 0,5 5 DdH2O 5,5
30 25 mM Tris-HCl pH 8, 10 mM EDTA pH 8.
- Dung dịch tiếp tục được trộn nhẹ nhàng với 200 µl dung dịch II chứa: 0.2N NaOH, 1 % SDS trong vòng 3 -5 phút nhằm tránh giải phóng DNA của nhân.
- Tiếp đến được trung hòa bằng 150µl dung dịch III chứa: 60 mM CH3COOK 5M, 11.5 ml acetic acid, 28.5 ml H2O bằng cách bổ sung và đảo ngược ống effendorf 4-6 lần.
- Bổ sung dung dịch hỗn hợp Phenol: Cloroform: Isoamylalcohol (25:24:1) vào hỗn hợp trên theo tỷ lệ thể tích 1:1, lắc mạnh và ly tâm ở 12000 vòng/phút trong vòng 20 phút. Hút lớp trên cùng một cách cẩn thận và chuyển sang một ống eppendorf mới.
- Sau đó, DNA đã được tủa với Isopropanol theo tỷ lệ thể tích 1:2. Hỗn hợp được để ở -200C trong vòng ít nhất 1 giờ.
- Tiếp đến ly tâm 12 000 vòng/phút trong 20 phút, loại bỏ phần nổi. Bổ sung 700µl ethanol 70% vào ống trước khi ly tâm tiếp 12 000 vòng/phút trong 10 phút và loại bỏ phần nổi một lần nữa.
- Sau khi sấy khô trong 10 phút, các plasmid kết tủa được tái hòa tan bằng cách thêm 30µl nước tinh khiết chứa RNAase và ủ ở 370C trong vòng 30 phút.
- Các plasmid được bảo quản ở - 200C.
2.2.2. Xây dựng cấu trúc vector biểu hiện pEGP-C2
2.2.2.1. Tích hợp oligonucleotid 6-histidine vào vector biểu hiện pEGFP – C2
Vector biểu hiện pEGFP trước hết được gắn oligonucleotid 6-histidin (His tag) tại vị trí đầu cuối C nhằm mục đích sản xuất một loại protein tái tổ hợp gắn với His tag, từ đó tạo điều kiện cho tinh chế protein bằng sắc ký ái lực kim loại (IMAC).
31
- Đầu tiên, một phân đoạn oligonucleotit có chứa trình tự của 6-histidin và vị đầu cắt của các enzym giới hạn BamHI và EcoRI được tổng hợp (Macrogen, Hàn Quốc).
- Vector pEGFP-C2 cũng được cắt bằng cả hai enzym giới hạn BamHI và
EcoRI.
- Gắn đoạn nucleotit có chứa 6-histidin vào vector pEGFP-C2 bằng enzym T4- DNA ligase.
- Thâm chuyển plasmid vào vi khuẩn E.coli DH5α và cấy trải trên đĩa thạch LB đặc có bổ sung kháng sinh phù hợp. Khuẩn lạc sau đó được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có chứa 50µg/ml Kanamycin và plasmid được tinh sạch để