gen mã hóa Nb-antiHER.
* Tinh sạch sản phẩm:
- Sản phẩm cắt enzym giới hạn được điện di trên gel agarose 0,8%. Sau khi các băng ADN phân tách, phần gel chứa ADN quan tâm được cắt riêng, chuyển sang ống eppengorf sạch. Tiến hành quy trình tinh sạch ADN từ gel agarose bằng kit thôi gel của Bioneer được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Trước tiên, đệm gắn mẫu (gel binding buffer –GB) chứa NaI được bổ xung vào mẫu, hỗn hợp được ủ ở 60oC cho tới khi gel tan hoàn toàn (5-10 phút). Trong trường hợp kích thước đoạn cần tính nhỏ hơn 200bp hay lớp hơn 3kb, hỗn hợp được bổ xung isopropanol để tăng khả năng thu hồi ADN.
- Sau khi thu hồi hỗn hợp được nạp lên cột kèm theo kit. Cột được ly tâm trong vòng 1 phút để loại bỏ đệm gắn mẫu, sau đó rửa 2 lần bằng 500µl đệm rửa (washing buffer – WB) có chứa EtOH, ly tâm 1 phút để loại bỏ dịch rửa. Sau đó cột được tiếp tục ly tâm trong vòng 1 phút để loại bỏ hoàn toàn EtOH.
ADN gắn trên cột được thu lại bằng cách bổ xung 30µl dung dịch đệm rửa chiết (elution buffer – EL) vào cột gel và ly tâm trong vòng 1 phút.
* Gắn gen mã hóa Nb-antiHER2 vào vector biểu hiện pEGFP-C2
Sau khi thu được hai sản phẩm gen mã hóa Nb-antiHER2 và vector pEGFP-C2 đã được tinh sạch, phản ứng gắn được thực hiện như bảng:
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng gắn gen mã hóa Nb-antiHER2 vào vector biểu hiện pEGFP-C2
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Vector pEGFP-C2 (đã xử lý enzym giới hạn) 2 2 Gen Nb-antiHER2 (đã xử lý enzym giới hạn) 6 3 T4 ADN ligase 1 4 Đệm T4 ligase 10X 1 Tổng thể tích phản ứng 10
33
Phản ứng gắn được thực hiện ở 22oC trong vòng 3 giờ. Sau đó thâm chuyển vào tế bào E.coli DH5α, nuôi cấy trong môi trường LB đặc bổ sung 50µg/ml kanamycin nuôi qua đêm ở 370C.
Plasmid biểu hiện pEGPF-C2 sau khi gắn thành công gen Nb-antiHER2 được gọi là vector pEGFP-Nb-anti HER2.