* Tách ADN tổng số từ tế bào động vật
- Các dòng tế bào HEK chuyển gen trong môi trường nuôi cấy DMEM được ly tâm ở 3000v/phút trong vòng 5 phút để loại bỏ môi trường, sau đó được rửa thêm 1 lần bằng đệm PBS 1x.
- Tủa tế bào sau đó được hòa tan trong dung dịch đệm ly giải 10mM Tris HCl, 10 mM EDTA, 0.1 M NaCl và 2 % SDS và ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng.
- Sau đó, các mẫu trên đều được bổ sung proteinase K với tỉ lệ thể tích 1:1 và ủ ấm ở 58°C trong vòng 3 giờ.
- Bổ sung dung dịch hỗn hợp Phenol: Cloroform: Isoamylalcohol (25:24:1) vào hỗn hợp trên theo tỷ lệ thể tích 1:1, lắc mạnh và ly tâm ở 12000 vòng/phút trong vòng 20 phút. Hút lớp trên cùng một cách cẩn thận và chuyển sang một ống eppendorf mới.
- Thực hiện bước trên thêm 1 lần bằng dung dịch Cloroform: Isoamylalcohol (24:1) nhằm loại bỏ tối đa các protein.
- Sau đó, ADN đã được tủa với cồn tuyệt đối theo tỷ lệ thể tích 1:2. Hỗn hợp được để ở -200C qua đêm.
- Tiếp đến ly tâm 12 000 vòng/phút trong 20 phút, loại bỏ phần nổi. Bổ
sung 700µl ethanol 70% vào ống trước khi ly tâm tiếp 12 000 vòng/phút trong
10 phút và loại bỏ phần nổi một lần nữa.
- Sau khi sấy khô trong 10 phút, ADN tổng số được tái hòa tan bằng cách thêm 30µl nước tinh khiết chứa RNAase và ủ ở 370C trong vòng 30 phút.
- ADN tổng số được bảo quản ở - 200C.
* PCR ADN tổng số thu được bằng cặp mồi đặc hiệu BglII EcoRI
ADN tổng số thu được đem PCR với cặp mồi đặc hiệu BglII và EcoRI, sản phẩm sau đó được điện di kiểm tra trên gel Agarose 0,8%.