Protein tổng số thu được từ dịch nuôi và dịch phá tế bào HEK 293 sau thâm chuyển pEGFP-NbG-antiHER2 và pEGFP-Nb-antiHER2 được kiểm tra hoạt tính bằng phản ứng ELISA với đối chứng (-) là dịch rửa PBS. Kết quả trên hình 17 cho thấy giếng chứa dịch nuôi tế bào không hiện mầu trong khi dịch phá tế bào có hiện mầu sau khi ủ với cơ chất TMB 10 phút nhưng rất mờ.
Hình 3.12 : Kết quả phản ứng ELISA.
1 : Tế bào HEK 293 chứa pEGFP-C2; 2: Tế bào HEK 293 chứa pEGFP-NbG- antiHER2; 3: Tế bào HEK 293 chứa pEGFP-NbA-antiHER2 ; 4: Dịch nuôi Tế bào HEK 293 chứa pEGFP-C2 ; 5: Dịch nuôi Tế bào HEK 293 chứa pEGFP- NbG-antiHER2 ; 6: Dịch nuôi Tế bào HEK 293 chứa pEGFP-NbA-antiHER2 ; 7 : Đối chứng (-).
50
Kiểm tra tiếp bằng máy đo quang phổ tại bước sóng 450 nm kết quả phản ứng ELISA dịch phá tế bào cho kết quả theobảng :
Bảng 3.1 : Kết quả đo quang phổ sản phẩm phản ứng ELISA
pEGFP-C2 NbG-antiher2 NbA-antiher2 Chứng (-)
0.031 0.253 0.234 0.028
Hình 3.12 : Biểu đồ kết quả xác định khả năng nhận biết và gắn kết của phức hệ kháng nguyên kháng thể bằng kỹ thuật ELISA
Từ giá trị OD đo được cho thấy protein NbG-antiher2 và NbA-antiher2 có ái lực với kháng nguyên HER2, và không có sự khác biệt giữa hai mẫu. Kết quả cho phép chúng tôi kết luận protein NbG-antiHER2 và NbA- antiHER2 có hoạt tính kháng thể.
51
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
4.1. Xây dựng kháng thể nanobody kháng HER2
Những kiến thức sâu rộng đã tích lũy qua nhiều thập kỷ trong lĩnh vực kháng thể đơn dòng và kháng thể đơn dòng phục vụ cho điều trị khối u. Trên thực tế kháng thể đơn dòng đã được áp dụng trong điều trị ung thư vì độ đặc hiệu cao của chúng với các kháng nguyên khối u và các cơ chế khác nhau để hướng đến đích là tế bào ung thư: gây độc tế bào phụ thuộc bổ thể (CDC), thực bào phụ thuộc kháng thể (ADCP), gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể (ADCC) và hoạt hóa quá trình chết theo chu trình của tế bào. Vì những lợi thế trên nên kháng thể đơn dòng trở thành liệu pháp điều trị mạnh mẽ với 18 sản phẩm thuốc đã được thông qua và hàng trăm sản phẩm đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng pha II và III.
Mặc dù kháng thể đơn dòng có những ưu điểm nổi trội so với các phương pháp thông thường như phẫu trị và xạ trị thì kháng thể đơn dòng vẫn còn nhiều hạn chế. Ví dụ như kích thước của kháng thể đơn dòng lớn hơn 160kDa nên dẫn đến khả năng phân bố mô thấp và tiềm năng gây đáp ứng miễn dịch cao. Ngoài ra kháng thể đơn dòng độ thanh thải khỏi máu thấp nên thường gây độc cho cả các mô bình thường dẫn đến nhiều tác dụng phụ khi sử dụng. Để giải quyết những nhược điểm trên, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để đưa ra các dạng kháng thể ở cấu trúc đơn giản hơn như scFv, VH. Những kháng thể này có kích thước giảm xuống nhưng vẫn giữ được đặc tính kháng nguyên ràng buộc. Tuy nhiên, sự ra đời của các dạng kháng thể mới phần nào giải quyết được các vấn đề tồn tại. Do đó, mục tiêu tạo được kháng thể có kích thước nhỏ, xâm nhập nhanh chóng vào khối u mà vẫn giữ được ái lực và độ đặc hiệu cao với kháng nguyên đích là mong muốn của các nhà khoa học trên thế giới.
Phát hiện về nanobody trong lạc đà năm 1993 đã mở ra liệu pháp mới trong điều trị ung thư vú. Nanobody có đặc tính sinh học và miễn dịch ưu việt làm cho chúng trở thành ứng viên tốt nhất trong các liệu pháp điều trị. Với kích thước
52
khoảng 15kDa, chỉ bằng một phần mười kích thước của các kháng thể thông thường. Nanobody có khả năng thâm nhập nhanh chóng vào mô đích và thanh thải khỏi máu nhanh chóng. Ngoài ra, chúng bền với nhiệt, độ hòa tan cao, và không gây đáp ứng miễn dịch ở người. Với các ưu điểm này nanobody trở thành mục tiêu triển vọng trong điều trị khối u.
Từ các thư viện dữ liệu, chúng tôi thấy đã có một số báo cáo được công bố về việc sản xuất nanobody tái tổ hợp trong hệ thống các vật chủ khác nhau. Tuy nhiên khi nói đến nanobody trong điều trị ung thư vú chỉ có nghiên cứu nanobody tái tổ hợp kháng lại marker MUC1, nanobody đã được tổng hợp trong tế vi khuẩn
Escherichia coli và trong Pichia pastoris [42], biểu hiện trong cây thuốc lá [26, 30]. Ngoài ra, Rajabi Bazl và cộng sự đã báo cáo những nghiên cứu đầu tiên về sản xuất nanobody tái tổ hợp trên dòng tế bào CHO kháng lại marker MUC1 trong tế bào ung thư vú [6]. Năm 2013 có hai báo cáo, một của Xavier C và cộng sự sử dụng kháng thể nanobody kháng HER2 được tổng hợp bằng cách tiêm kháng nguyên HER2 của người vào lạc đà có bướu sau đó tách chiết và tinh chế để thu được kháng thể này, kháng thể kháng nanobody sau đó được gắn thêm nguyên tố phóng xạ nhằm mục đích điều trị các khối u trên chuột, thông qua đó để tính liều điều trị khối u trên người [53]. Nghiên cứu thứ hai là của của Pruszynski và cộng sự sử dụng kháng thể nanobody kháng HER2 được tổng hợp dựa trên kỹ thuật phage display để đánh giá tình trạng biểu hiện HER2 trên bệnh nhân ung thư vú dương tính với HER2 trước khi điều trị với Trastuzumab [39]. Cả hai nghiên cứu trên đều cho thấy kháng thể nanobody có ái lực cao với các khối u có biểu hiện quá mức HER2, tuy nhiên cách thu kháng thể nanobody thông qua tiêm trực tiếp kháng nguyên HER2 của người vào lạc đà sẽ không cho ta thu được số lượng lớn, mặt khác để thu được kháng thể nanobody kháng HER2 với mục đích làm thuốc điều trị trên người thì sử dụng kỹ thuật phage display sẽ không phù hợp.Trong nghiên cứu này, chúng tôi báo cáo nghiên cứu về việc tổng hợp kháng thể nanobody với mục tiêu là kháng nguyên HER2 trong tế bào động vật.
53
4.2. Xây dựng plasmid biểu hiện pEGFP-C2 và tế bào vật chủ HEK293
Việc lựa chọn vector biểu hiện thích hợp sử dụng trong thâm chuyển vào tế bào động vật là rất khó và có nhiều yếu tố cần được tính toán. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng vector pEGFP-C2 là vector biểu hiện cho gen Nb- antiHER2 trong tế bào động vật HEK 293. Vector biểu hiện này có chứa vị trí MCS (multi coloning sites) - vị trí đa điểm và chứa gen mã hóa protein kháng kháng sinh kanamycin cho phép ta chọn dòng và tách trong E. coli. Ngoài ra để sản xuất một số lượng lớn protein tái tổ hợp phục vụ cho việc tinh chế protein, ELISA, thử độc tính sau này vector biểu hiện có chứa đoạn promoter CMV 35S, là một promoter có cấu trúc virus mạnh mẽ, giúp biểu hiện gen cao trong tế bào động vật. Trước đó chúng tôi đã đã sử dụng vector pCR2.1 có vị trí MCS để thuận lợi cho việc nhân dòng. Đoạn mồi M13 xung quanh vị trí đa điểm thuận lợi cho việc xác định trình tự gen sau khi nhân bản. Kết quả giải trình tự trong hình 13 chứng tỏ chúng tôi đã chèn đúng các gen Nb-antiHER2 vào trong vector biểu hiện pEGFP-C2 với vị trí khung đọc chính xác và không có mã kết thúc. Điều đó cho phép chúng tôi kỳ vọng sẽ hiểu hiện thành công kháng thể đích sau khi thâm chuyển vào tế bào động vật. Hơn thế nữa, sự gắn thành công đoạn oligonucleotid 6-histidin vào gen tạo điều kiện cho việc kết hợp với kháng nguyên đích sau này, giúp tiến hành phản ứng ELISA để thử hoạt tính kháng thể. Việc gắn thêm đoạn oligonucleotid 6-histidin cũng làm tăng độ hòa tan của protein tái tổ hợp và thuận lợi cho việc tinh sạch protein sau này.
Một protein đích cần đáp ứng được các thông số về năng suất, độ hòa tan cao, gây đáp ứng miễn dịch thấp. Các tế bào động vật là một hệ thống vật chủ hoàn hảo vì chúng có sự tương đồng về cấu trúc và chức năng với người mà không bị đào thải với các cải biến sau dịch mã, sự biểu hiện của chaperon để nâng cao khả năng gập xoắn protein. Trong lĩnh vực biểu hiện kháng thể nanobody tái tổ hợp, các dòng tế bào của chuột (CHO) và dòng tế vào ung thư vú của người (MFC-7) đã được sử dụng để sản xuất thành công kháng nguyên MUC1 từ tế vào ung thư vú. Các dữ liệu này có thể là cơ sở để chúng ta biểu
54
hiện thành công kháng thể nanobody tái tổ hợp trong tế bào động vật.
Plasmid tái tổ hợp pEGFP-Nb-antiHER2 đã được thâm chuyển vào tế bào động vật sử dụng Lipofectamine. Đây là một kỹ thuật thao tác đơn giản, tiết kiệm thời gian, giá thành thấp hơn so với các phương pháp khác, được sử dụng phổ biến trong thâm chuyển gen vào tế bào động vật ở các phòng thí nghiệm trên thế giới.
4.3. Kết quả biểu hiện kháng thể kháng HER2 trong tế bào động vật
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xây dựng thành công vector tái tổ hợp pEGFP-Nb-antiHER2 đã được kiểm tra bằng phương pháp PCR, cắt enzym giới hạn và giải trình tự. Quan trọng nhất là chúng tôi đã biểu hiện thành công kháng thể mục tiêu trong tế bào động vật HEK 293. Kháng thể nanobody kháng HER2 đã cho phản ứng dương tính với kháng nguyên đặc hiệu HER2 được cung cấp bởi phòng Công nghệ tế bào động vật khi tiến hành phản ứng ELISA. Tuy nhiên lượng protein đích thu được quá ít nên chưa thấy xuất hiện băng trên điện di đồ protein tổng số và cũng không thể tinh sạch thu được lượng protein này. Một vấn đề nữa là chúng tôi đã chưa thành công trong việc xây dựng trình tự dẫn với mục đích biểu hiện protein ra ngoài tế bào, giúp thuận lợi cho quá trình sản xuất và thu hồi protein sau này. Cả hai trình tự dẫn trên NbG-antiHER2 và NbA- antiHER2 đều không thành công. Tuy nhiên, việc biểu hiện thành công protein đích có gắn kèm protein phát quang GFP đóng vai trò quan trọng trong việc xây dựng kit chuẩn đoán ung thư vú dương tính với HER2 sau này. Phân tích nguyên nhân dẫn đến hiệu suất biểu hiện protein thấp có nhiều yếu tố cần được xem xét như: thao tác thâm chuyển, môi trường nuôi, xử lý thu protein kiểm tra. Trên thực tế chúng tôi gặp nhiều các yếu tố bất lợi như: tình trạng nhiễm mẫu, mất điện dẫn đến sự chết hàng loạt tế bào sau quá trình thâm chuyển 2 ngày, thời gian thu hoạch ngắn nên có thể dẫn đến protein không được biểu hiện nhiều. Chúng tôi cũng đang nỗ lực để khắc phục những thiếu sót trên. Quan trọng hơn về lâu dài chúng tôi mong đợi có được dòng tế bào ổn định, thông thường sẽ kéo dài trong thời gian từ 3 đến 6 tháng.
55
KẾT LUẬN
1.Đã nhân dòng thành công gen mã hóa kháng thể nanobody kháng HER2.
2.Đã xây dựng thành công vector biểu hiện kháng thể nanobody kháng HER2 là pEGFP-Nb-antiHER2. Đã biến nạp thành công vector biểu hiện vào tế vào động vật HEK 293.
3. Đã bước đầu biểu hiện thành công kháng thể nanobody kháng HER2 trong tế bào động vật HEK 293 đặc hiệu với kháng nguyên HER2.
56
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa các điều kiện nhằm nâng cao hiệu suất biểu hiện kháng thể nanobody kháng HER2 trong tế bào động vật, hướng đến thu được lượng kháng thể lớn phục vụ cho công tác chẩn đoán và điều trị ung thư vú sau này.
PHỤ LỤC Cấu trúc vector pCR2.1
Cấu trúc vector pEGFP-C2
Kết quả giải trình tự gen kháng thể nanobody kháng HER2 từ vector pEGFP-Nb-antiHER2 (trang sau)
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1.Nguyễn Bá Đức (2009), Ung thư học đại cương, tr, Nxb Giáo Dục, Hà Nội 2.Nguyễn Bá Đức, Đặng Thế căn, Trần Văn Thuấn, Nguyễn Văn Định, Bùi
Diệu, Tạ Văn Tờ (2003), Bệnh ung thư vú, tr, Nxb Y học, Hà Nội. 3.Nguyễn Bá Đức và cộng sự (2010), Báo cáo sơ bộ kết quả thực hiện dự án
quốc gia về phòng chống ung thư giai đoạn 2008 – 2010, Tạp chí ung thư học Việt Nam, số 1, trang 21 – 26.
Tài liệu tiếng Anh
4.Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., and Muyldermans, S. (1997). Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy- chain antibodies. FEBS Lett 414, 521-526
5.Baral, T.N., Magez, S., Stijlemans, B., Conrath, K., Vanhollebeke, B., Pays, E., Muyldermans, S., and De Baetselier, P. (2006). Experimental therapy of African trypanosomiasis with a nanobody- conjugated human trypanolytic factor. Nat Med 12, 580-584.
6.Bazl, M.R., Rasaee, M.J., Foruzandeh, M., Rahimpour, A., Kiani, J., Rahbarizadeh, F., Alirezapour, B., and Mohammadi, M. (2007). Production of chimeric recombinant single domain antibody-green fluorescent fusion protein in Chinese hamster ovary cells. Hybridoma (Larchmt) 26, 1-9.
7.Biscardi, J.S., Ishizawar, R.C., Silva, C.M. and Parsons, S.J. (2000), “Tyrosine kinase signalling in breast cancer: epidermal growth factor receptor and c- Src interactions in breast cancer”, Breast Cancer Res 2, 203-210.
8.Cho, H. S, Mason, K., Ramyar, K. X., Stanley, A. M., Gabelli, S. B., Denney, D. W., Jr., & Leahy, D. J, (2003), “Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab”, Nature 421, 756-760.
9.Cortez-Retamozo, V., Backmann, N., Senter, P.D., Wernery, U., De Baetselier, P., Muyldermans, S., and Revets, H. (2004). Efficient cancer therapy with
a nanobody- based conjugate. Cancer Res 64, 2853-2857
10.D Faratian & J Bartlett, (2008), “Predictive markers in breast cancer – the future”, Endocrine Cancer Group, Edinburgh Cancer Research Centre, Edinburgh, UK, Histopathology 52, 91–98.
11.Daniel Harari1 and Yosef Yarden, (2000), “Molecular mechanisms underlying ErbB2/HER2 action in breast cancer”, Oncogene 19, 6102 ± 6113.
12.Dean-Colomb, W., and Esteva, F.J. (2008). Her2-positive breast cancer: Herceptin and beyond. European journal of cancer (Oxford, England : 1990) 44, 2806-2812
13.Desmyter A, Decanniere K, Muydermans S, Wyns L (2001). Antigen specific and high affinity provided by one single loop of camel single- domain antibody. J Biol Chem 276: 26285-26290.
14.Drebin JA, Link VC, Stern DF et al, (1985). Down-modulation of an oncogene protein product and reversion of the transformed phenotype by monoclonal antibodies. Cell; 41: 695-706. 21
15.El Khattabi, M., Adams, H., Heezius, E., Hermans, P., Detmers, F., Maassen, B., van der Ley, P., Tommassen, J.,Verrips, T., and Stam, J. (2006). Llama single-chain antibody that blocks lipopolysaccharide binding and signaling: prospects for therapeutic applications. Clin Vaccine Immunol 13, 1079-1086
16.ElBakri, A., Nelson, P.N., and Abu Odeh,R.O. (2010a). The state of antibody therapy. Human Immunology 71, 1243-1250.
17.Feldman, A.M., Koch, W. J & Force, T. L (2007), “Developing strategies to link basic cardiovascular sciences with clinical drug development: another opportunity for translational sciences”, Clin Pharmacol Ther 81, 887-892. 18.Ferlay, J., Shin, H.R., Bray, F., Forman, D., Mathers, C., and Parkin,
D.M. (2010). Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008. Int J Cancer 127, 2893- 2917.
19.Frenken, L.G.J., van der Linden, R.H.J., Hermans, P.W.J.J., Bos, J.W., Ruuls, R.C., de Geus, B., and Verrips, C.T. (2000). Isolation of antigen
specific Llama VHH antibody gments and their high level secretion by Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biotechnology 78, 11-21.
20.Gao, C., Mao, S., Kaufmann, G., Wirsching, P., Lerner, R. A., Janda, K. D. (2002) “A method for the generation of combinatorial antibody libraries using pIX phage display”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, PP. 12612-12616. 132.
21.Gueorguieva D, Li S, Walsh N, Mukerji A, Tanha J, Pandey S.(2006). Identification of single-domain, Bax-specific intrabodies that confer resistance to mammalian cells against oxidative-stress-induced apoptosis. FASEB J 20:2636-2638
22.Guinn, B.A., Kasahara, N., Farzaneh, F., Habib, N.A., Norris, J.S., and Deisseroth, A.B. (2007). Recent advances and current challenges in tumor immunology and immunotherapy. Mol Ther 15, 1065-1071. 23.Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G.,
Hamers, C., Songa, E.B., Bendahman, N., and Hamers, R. (1993). Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature 363, 446-448. 24.Harmsen, M.M., and Haard, H.J. (2007). Properties, production, and
applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology 77, 13-22
25.Horan, T. P., Wen, J., Arakawa, T., Liu, N., Brankow, D., Hu, S., Ratzkin, B.,
and Philo, J. S, (1995), "Binding of Neu differentiation factor with the