Cơ sở của phương pháp PCR là dựa vào đặc tính hoạt động của DNA- polymerase. Trong thực nghiệm, sử dụng đoạn mồi có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA-polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Các đoạn ADN mới lại được sử dụng làm khuôn, sau một chu kỳ thì số lượng đoạn ADN được nhân lên theo cấp số nhân. Một gen trong một thời gian ngắn có thể được nhân lên hàng triệu lần.
Đoạn gen kháng thể nanobody kháng HER2 (Nb-antiHER2) được khuếch đại bằng phản ứng PCR từ plasmid tái tổ hợp pENo8H (Entelechon, Germany) và pBSK (Epoch Life Science, Texax, US). Trong đó sử dụng cặp mồi đặc hiệu chứa enzym giới hạn BglII tại đầu 5’ và EcoRI tại đầu 3’ (vị trí cắt enzym giới hạn được thể hiện bằng chữ có gạch chân). Đặc biệt ở đây chúng tôi có 2 gen Nb-antiHER2 khác nhau về trình tự dẫn, do vậy hai gen này khác nhau về mồi xuôi Fw nhưng có chung mồi ngược Rv. Trình tự của mồi như sau:
NbG-Fw: 5’-GTC GAC AGA TCT ATG AAA CAT CTG TGG -3’ (BglII) NbA-Fw: 5’-GTC GAC AGA TCT ATG GGC GTG AAA G-3’ (BglII) Nb-Rv: 5’-TGA ATT CGG TGA CCT GGG TCC CCT GG-3’ (EcoRI)
Cách tiến hành
Trộn phản ứng PCR với khuôn là pENo8H và pBSK mang gen mã hóa kháng thể nanobody kháng HER2. Thành phần của phản ứng PCR như sau:
Bảng 2.1: Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen Nb-anti Her2
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 pBSK hoặc pENo8H 0,5 2 Nb-Fw 10pmol 1 3 Nb-Rv 1 4 dNTPs 2mM 2.5 5 Taq polymerase 0,5
26
6 Đệm Taq polymerase 2,5
7 Dd H2O 17
Tổng thể tích 25
Chạy máy PCR với chu trình nhiệt được thực hiện trên máy Veriti® thermocycler (Applied Biosystem, US) như sau: Biến tính ở 940C: 3 phút; Thực hiện 30 chu kỳ phản ứng liên tiếp với chu trình nhiệt: biến tính 940C – 45 giây, bắt cặp 500C – 30 giây, kéo dài 720C - 45 giây; Cuối cùng để ở 720C – 8 phút để hoàn tất phản ứng; sau đó sản phẩm được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.