Nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa của cao chiết nấm Cordyceps sp.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HUỲNH THƯ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HOÁ CỦA CAO CHIẾT NẤM Cordyceps sp Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm (hướng Hoá Sinh) Mã số chuyên ngành: 604230 LUẬN VĂN THẠC SĨ: Hoá Sinh NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Ngô Đại Nghiệp Tp Hồ Chí Minh, năm 2012 LỜI CẢM ƠN Xin chân thành gởi lời cảm ơn đến tất người thân yêu bên cạnh động viên, giúp đỡ suốt thời gian thực luận văn - Em vô biết ơn tận tâm dạy bảo hướng dẫn nhiệt tình thầy Đinh Minh Hiệp thầy Ngô Đại Nghiệp Chúc hai thầy vui khoẻ ngày thành công đường khoa học - Em vô biết ơn thầy cô truyền đạt kiến thức, dẫn dắt em đường học vấn - Xin gởi lời cảm ơn chân thành đến Trần Văn Khuê, Trình Mai Duy Lưu, Trần Đăng Khoa toàn cán Bộ mơn Sinh Hóa tạo điều kiện cho thực luận văn - Cảm ơn bạn Mỹ Nương Hoàng Quyên đồng hành thời gian thực đề tài - Chị cảm ơn tất em phòng Hợp chất có hoạt tính sinh học giúp chị thực luận văn Chị chúc tất em thành công sống - Cảm ơn tất bạn bè lớp SH20 chia sẻ buồn vui với hai năm học vừa qua - Cảm ơn gia đình người thân ln bên cạnh thương yêu Huỳnh Thư iii MỞ ĐẦU 30 Ngày nay, nhân tố bất lợi ô nhiễm môi trường, tia tử ngoại, thức ăn độc hại, sức ép công việc gia đình ngày tăng cao, điều làm gia tăng đáng kể số lượng gốc tự hoạt động gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ người Đây nguyên nhân phá hủy nhiều hệ thống sinh học, gây đứt gãy DNA, phá vỡ màng tế bào, biến tính protein; làm phát sinh nhiều bệnh nghiêm trọng liên quan đến thóai hóa gan, thận, thần kinh, tim mạch,…Việc sử dụng chất kháng oxy hóa đề xuất ứng dụng từ lâu Tuy nhiên, nghiên cứu gần cho thấy chất kháng oxy hóa tổng hợp có hoạt tính kháng oxy hóa cao lại có nguy gây hại đến thể người Điều đòi hỏi nhà khoa học phải nghiên cứu hoạt chất kháng oxy có nguồn gốc tự nhiên nhằm giải vấn đề Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu nhắm đến đối tượng nấm Cordyceps loại nấm quý sở hữu nhiều hoạt tính sinh học Các nghiên cứu chứng minh Cordyceps chứa nhiều hoạt chất cordycepin, adenosin, hydroxyethyl-adenosin, nucleosid, ergosterol, polysaccharid, nguyên tố đa vi lượng nhiều hoạt chất khác Các nghiên cứu lâm sàng cho thấy Cordyceps có khả lớn việc điều trị nhiều bệnh tác dụng bồi bổ thể Các nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa Cordyceps thực nhiều khơng châu Á mà toàn giới, kết cho thấy Cordyceps có khả kháng oxy hóa cao, nghiên cứu chủ yếu thực hai loài C sinensis C militaris Tại Việt Nam, hướng nghiên cứu chưa có nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa Cordyceps cơng bố Mặt khác, nhận thấy Việt Nam, vài vùng có địa hình khí hậu hồn tồn phù hợp với điều kiện sinh trưởng Cordyceps Chính lý đó, nhóm nghiên cứu định thực đề tài: “Nghiên cứu khả kháng oxy hóa cao chiết nấm Cordyceps sp.” đối tượng chủng Cordyceps phân lập Việt Nam nhằm khảo sát hoạt tính sinh học chủng giống chọn, tập trung khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa; tạo sở cho việc khai thác ứng dụng mở rộng phạm vi nghiên cứu, hướng tới phát triển số dạng sản phẩm phục vụ sức khỏe cộng đồng Mục đích: Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro phân đoạn cao chiết từ sinh khối nấm Cordyceps sp thu nhận Việt Nam Ý nghĩa: Cung cấp số liệu thực nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa mơ hình in vitro, từ lựa chọn phân đoạn cao chiết có hoạt tính kháng oxy hóa cao để nghiên cứu kháng oxy hóa mơ hình in vivo tạo tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng sâu MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa ii Lời cảm ơn iii Lời cam đoan iv Mục lục v Danh mục chữ viết tắt ix Danh mục bảng x Danh mục hình, đồ thị biểu đồ xi MỞ ĐẦU Chương - TỔNG QUAN 1.1 Sự oxy hóa 1.1.1 Các khái niệm oxy hóa 1.1.2 Các đặc trưng phản ứng chuỗi 1.1.2.1 Độ bền hóa trị tự 1.1.2.2 Điều kiện chu kỳ chuyển đổi điện tử 1.1.2.3 Sự cạnh tranh phản ứng chuỗi phản ứng phân tử 1.2 Sự kháng oxy hóa 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Phân loại chất kháng oxy hóa 1.2.3 Cơ chế ức chế q trình oxy hóa chuỗi 1.3 Tác hại oxy hóa 1.3.1 Khái niệm stress oxy hóa 1.3.2 Các gốc tự gây hại cho thể 1.3.2.1 Khái niệm 1.3.2.2 Các dạng gốc tự chứa oxy 1.3.3 Tác động lên DNA 10 1.3.4 Tác động lên protein 12 1.3.5 Tác động lên lipid 13 v 1.4 Giới thiệu Cordyceps 14 1.4.1 Phân loại khoa học 14 1.4.2 Lịch sử nghiên cứu 14 1.4.3 Phân bố 15 1.4.4 Đặc điểm 15 1.4.5 Hiệu sử dụng 15 1.4.6 Các hoạt chất 16 1.4.6.1 Cordycepin 16 1.4.6.2 Acid cordyceptic 17 1.4.6.3 Polysaccharid 18 1.4.6.4 Ergosterol 19 1.4.6.5 Nucleotide 19 1.4.6.5 Protein acid amin 20 1.5 Tình hình nghiên cứu Cordyceps 20 1.5.1 Các nghiên cứu nước 20 1.5.2 Các nghiên cứu nước 23 Chương – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 25 26 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.1.1.1 Sinh khối Cordyceps 26 2.1.1.2 Dịng tế bào 28 2.1.2 Hóa chất 28 2.1.3.Thiết bị - Dụng cụ 28 2.2 Quy trình chiết cao 30 2.3 Phương pháp xác định hoạt tính bắt gốc tự DPPH 32 2.3.1 Nguyên tắc 32 2.3.2 Thực 32 2.4 Phương pháp xác định lực khử 2.4.1 Nguyên tắc 33 33 vi 2.4.2 Thực 34 2.5 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenolic 35 2.5.1 Nguyên tắc 35 2.5.2 Thực 35 2.6 Phương pháp xác định hàm lượng polysaccharid 36 2.6.1 Nguyên tắc 36 2.6.2 Thực 36 2.7 Phương pháp xác định khả gây độc tố tế bào 37 2.7.1 Nguyên tắc 37 2.7.2 Thực 37 2.8 Phương pháp xác định khả bảo vệ tế bào 38 2.8.1 Nguyên tắc 38 2.8.2 Thực 38 2.9 Phương pháp xác định ảnh hưởng oxy hóa DNA 39 2.9.1 Nguyên tắc 39 2.9.2 Phương pháp ly trích DNA 39 2.9.3 Phương pháp xác định hư hại DNA tác nhân oxy hóa 40 2.9.4 Phương pháp xác định khả bảo vệ DNA mẫu 41 Chương - KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 42 3.1 Khảo sát khối lượng cao chiết 43 3.2 Hàm lượng chất có cao chiết 44 3.2.1 Hàm lượng polyphenol 44 3.2.2 Hàm lượng polysaccharid 46 3.3 Khả kháng oxy hóa phương pháp hóa học phân đoạn cao chiết từ Cordyceps 47 3.3.1 Khả bắt gốc DPPH tự 47 3.3.2 Năng lực khử 49 3.3.3 Nhận xét chung 51 3.4 Khảo sát ảnh hưởng cao chiết tế bào Hep G2 vii 54 3.4.1 Khảo sát khả gây độc tế bào 54 3.4.2 Khả bảo vệ tế bào 55 3.4.3 Khả bảo vệ DNA 58 Chương – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61 4.1 Kết luận 62 4.2 Đề nghị 62 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC viii CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bảng 3.4 Giá trị IC50 hoạt tính bắt gốc DPPH tự Tên chủng DL0004 DL0006 DL0015 DL0038A DL0038B DL0050 DL0067 DL0069 DL0075 DL0077 Cao cồn 308,93 177,08 551,24 887,98 491,42 426,08 598,98 674,03 >1000 >1000 Giá trị IC50 (µg/ml) Cao PE Cao ET Cao BU 718,12 153,00 360,98 373,08 130,70 244,08 >1000 155,86 197,13 870,18 105,93 106,80 >1000 101,95 139,17 >1000 167,83 189,98 881,49 99,81 182,71 748,64 97,26 188,83 >1000 114,43 218,97 465,48 109,45 174,09 Cao nước 404,77 156,16 277,38 59,45 134,01 200,76 177,57 134,02 316,00 221,51 Ghi chú: >1000: IC50 có giá trị 1000 µg/ml Nhận xét Đối chứng dương khảo sát vitamin C có giá trị IC50 2,3043 (µg/ml), thấp tất mẫu khảo sát Ở phân đoạn cồn chứa đầy đủ hợp chất lại có IC50 cao (cao DL0075 DL0077 có giá trị IC50 lớn 1000 µg/ml, thấp DL0006 có giá trị IC50 177,08 µg/ml) Điều hợp chất cao dạng phức hợp nên thành phần kháng oxy hóa khơng hoạt động tốt Ở phân đoạn PE, giá trị IC50 cao (thấp DL0006 có giá trị IC50 373,08 µg/ml) phân đoạn, cao chứa hợp chất không phân cực nên chứa nhóm chức linh động có khả bắt gốc tự Mặc khác, cao PE hợp chất không phân cực nên khả hòa tan độ hoạt động hợp chất methanol (dung môi phản ứng) kém, ngun nhân kiến hoạt tính bắt gốc DPPH cao thấp Theo kết khảo sát hàm lượng polyphenol polysaccharid phân đoạn chứa hai hợp chất có khả kháng oxy hóa Ở phân đoạn ET, giá trị IC50 thấp so với phân đoạn khác (trừ chủng DL0038A) (cao DL0050 có giá trị IC50 167,83 µg/ml thấp DL0069 có giá trị IC50 97,26 µg/ml) chứng tỏ phân đoạn có chứa nhiều hợp chất có khả kháng oxy hóa cao Đây phân đoạn chứa hàm lượng 48 polyphenol cao so với phân đoạn khác Các nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa phân đoạn khơng nhiều, nhiên Russell Paterson (2008) khẳng định phân đoạn có chứa nhiều hợp chất khác biệt so với phân đoạn methanol nước [48] Ở phân đoạn BU nước, giá trị IC50 thấp, thua phân đoạn ET, cho thấy hai phân đoạn chứa nhiều hợp chất có khả kháng oxy hóa cao Đây hai phân đoạn chứa hàm lượng polyphenol polysaccharid cao Kết thống kê: Frows = 0,99 < Fcrit = 2,15 => Sự khác biệt chủng Cordyceps không ảnh hưởng đến hoạt tính bắt gốc DPPH tự Fcolumns = 30,58 > Fcrit = 2,63 => Sự khác biệt phân đoạn cao chiết ảnh hưởng đến hoạt tính bắt gốc DPPH tự → Kết cho thấy tất mẫu khảo sát chứa hoạt tính kháng oxy hóa hoạt tính cao hay thấp có mối tương quan rõ rệt chủng phân đoạn cao chiết Điều giải thích phân đoạn cao chiết chứa hoạt chất có độ phân cực giống nên chứa chất kháng oxy hóa có độ phân cực gần nhau, việc phân bố gốc kháng oxy hóa phân đoạn cao chiết tùy thuộc vào độ phân cực chúng, điều liên quan đến hoạt tính kháng oxy hóa chúng Tuy nhiên, khơng có khác biệt giá trị IC50 chủng Cordyceps, cho thấy chủng có khả kháng oxy hóa gần tương tự 3.3.2 Năng lực khử Năng lực khử đặc tính quan trọng thể khả kháng oxy hóa mẫu, cho thấy có diện chất khử khả nhường nguyên tử hydrogen tạo nên sản phẩm ổn định nhằm kết thúc phản ứng chuỗi điện tử tự Kết khảo sát lực khử dựa giá trị ∆OD nồng độ 1000 µg/ml thể bảng 3.5 49 Bảng 3.5 Giá trị ∆OD nồng độ 1000 µg/ml lực khử Ký hiệu chủng DL0004 DL0006 DL0015 DL0038A DL0038B DL0050 DL0067 DL0069 DL0075 DL0077 Cao cồn 0,16 0,13 0,21 0,22 0,21 0,13 0,20 0,15 0,19 0,16 Giá trị ∆OD Cao ET 0,19 0,09 0,16 0,31 0,27 0,22 0,26 0,23 0,17 0,18 Cao PE 0,17 0,17 0,22 0,22 0,24 0,27 0,28 0,21 0,21 0,23 Cao BU 0,13 0,18 0,10 0,22 0,16 0,16 0,12 0,11 0,09 0,10 Cao nước 0,10 0,08 0,05 0,19 0,06 0,12 0,19 0,03 0,05 0,05 Nhận xét Ở mẫu khảo sát, kết cho thấy toàn mẫu sở hữu hoạt tính lực khử, nhiên lực cao hay thấp lại không tương quan với kết khảo sát khả bắt gốc DPPH Giá trị ∆OD nồng độ 1000 µg/ml lực khử giảm dần theo độ phân cực dung môi (cao PE > cao ET > cao BU > cao nước) chứng tỏ hàm lượng chất khử Cordyceps có độ phân cực yếu nhiều chất khử có độ phân cực mạnh Đặc biệt, chủng DL0038A, giá trị ∆OD nồng độ 1000 µg/ml cao tất phân đoạn cao chiết chứng tỏ khả kháng oxy hóa chủng cao So sánh với đối chứng dương vitamin C có ∆OD nồng độ 1000 µg/ml 2,722 cho thấy giá trị cao tất mẫu khảo sát ∆OD đối chứng dương cao ∆OD mẫu cao (cao ET chủng DL0038A) 8,8 lần Mặt khác, dãy nồng độ khảo sát, hoạt tính lực khử mẫu tăng tuyến tính cho thấy giá trị khảo sát chưa đạt ngưỡng cực đại Cần khảo sát dãy nồng độ cao để xác định rõ thông số động học phản ứng 50 Kết thống kê: Frows = 3,6564 > Fcrit = 2,1526 => Chủng Cordyceps khác có liên quan đến giá trị ∆OD Fcolumns = 18,6650 > Fcrit = 2,6335 => Các phân đoạn cao chiết khác có liên quan đến giá trị ∆OD → Kết cho thấy giá trị ∆OD nồng độ 1000 µg/ml mẫu khác phân đoạn cao chiết chủng Cordyceps Điều cho thấy phân đoạn cao chiết chủng Cordyceps khác có chứa lượng chất khử khác 3.3.3 Nhận xét chung Kết khảo sát bảng 3.4 3.5 cho thấy tất mẫu sở hữu hoạt tính kháng oxy hóa hai khảo sát khả bắt gốc DPPH lực khử Hoạt tính mẫu tăng dần theo dãy nồng độ xử lý mẫu Bảng 3.2 3.3 cho thấy có diện polyphenol polysaccharid tất phân đoạn Vì hai hợp chất có khả nhường hydrogen nhận điện tử tự nên hoạt chất tạo hoạt tính kháng oxy hóa phân đoạn khảo sát Các nghiên cứu Yu cs (2006) [67], Zheng cs (2008) [70] Xiao cs (2011) [63] chứng minh có mặt hợp chất Cordyceps Ở phân đoạn cồn, hai hoạt tính bắt gốc DPPH tự lực khử thấp Đây cao tổng cho phân đoạn cịn lại nên chứa tồn hợp chất, hợp chất hoạt động tốt Mặt khác, chứa nhiều hợp chất nên tỷ lệ chất có khả kháng oxy hóa cao thấp, ảnh hưởng đến hoạt tính cao Kết khảo sát cho thấy cao này, hàm lượng polyphenol chiếm tỷ lệ không cao Phân đoạn PE có hoạt tính bắt gốc DPPH tự thấp lực khử lại cao Kết khảo sát cho thấy hàm lượng polyphenol polysaccharid cao thấp Như vậy, hoạt tính lực khử cao khơng tác động polyphenol polysaccharid mà hợp chất khác 51 Ở phân đoạn nước, chủng DL0038B có hàm lượng polyphenol polysaccharid cao hoạt tính bắt gốc DPPH tự lực khử lại thấp, điều liên quan đến cấu trúc trọng lượng phân tử hai hợp chất Tính toán tương quan hàm lượng chất hoạt tính kháng oxy hóa dựa vào hệ số tương quan r thực phần mềm Excel So sánh hệ số tương quan hàm lượng polyphenol, polysaccharid hoạt tính bắt gốc DPPH tự do, lực khử, kết cho thấy hàm lượng chất tương quan cao với hoạt tính bắt gốc DPPH tự khơng tương quan với lực khử Như vậy, hoạt tính bắt gốc DPPH tự tạo nên polyphenol polysaccharid Tuy nhiên, hoạt tính kháng oxy hóa Cordyceps khơng tạo hai chất này, cần nghiên cứu thêm thành phần chất thông số động học để biết rõ thêm hoạt động kháng oxy hóa Cordyceps Bảng 3.6 Hệ số tương quan hoạt tính kháng oxy hóa hàm lượng chất Hàm lượng polysaccharid Hàm lượng polysaccharid Hàm lượng polyphenol Hoạt tính bắt gốc DPPH tự Năng lực khử Hàm lượng polyphenol Hoạt tính bắt gốc DPPH tự Năng lực khử 0,470765 0,50984 0,717404 -0,147 0,072785 -0,35657 Ở phân đoạn cao chiết, chọn mẫu có hoạt tính cao dựa vào giá trị IC50 kết khảo sát khả bắt gốc DPPH ∆OD nồng độ 1000 µg/ml kết khảo sát lực khử Mẫu có giá trị IC50 thấp ∆OD nồng độ 1000 µg/ml cao chọn tiếp tục khảo sát khả bảo vệ tế bào tác động oxy hóa Dựa vào đồ thị 3.1, phân đoạn cao cồn, nhận thấy mẫu DL0006 có giá trị IC50 thấp giá trị ∆OD cao nên ta chọn mẫu DL0006 52 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 800 600 400 200 Hoạt tính bắt gốc DPPH tự Năng lực khử D L0 03 8A D L0 03 8B D L0 05 D L0 06 D L0 06 D L0 07 D L0 07 L0 01 D D D L0 00 L0 00 ∆OD Giá trị IC50 (µg/ml) 1000 Ký hiệu chủng Đồ thị 3.1 Kết khảo sát khả kháng oxy hóa phân đoạn cao cồn Dựa vào đồ thị 3.2, phân đoạn cao PE nhận thấy mẫu DL0006 có giá Giá trị IC50 (µg/ml) 1000 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 800 600 400 200 Hoạt tính bắt gốc DPPH tự Năng lực khử D L0 06 D L0 06 D L0 07 D L0 07 L0 05 D D L0 00 D L0 01 D L0 03 8A D L0 03 8B D L0 00 ∆OD trị IC50 thấp giá trị ∆OD cao nên ta tiếp tục chọn mẫu DL0006 Ký hiệu chủng Đồ thị 3.2 Kết khảo sát khả kháng oxy hóa phân đoạn cao PE Dựa vào đồ thị 3.3, phân đoạn cao ET nhận thấy mẫu DL0038A có giá trị 800 600 400 200 L0 03 8A D L0 03 8B D L0 05 D L0 06 D L0 06 D L0 07 D L0 07 Hoạt tính bắt gốc DPPH tự Năng lực khử D L0 01 D D D L0 00 ∆OD 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 1000 L0 00 Giá trị IC50 (µg/ml) IC50 thấp giá trị ∆OD cao nên ta chọn mẫu DL0038A Ký hiệu chủng Đồ thị 3.3 Kết khảo sát khả kháng oxy hóa phân đoạn cao ET 53 Dựa vào đồ thị 3.4, phân đoạn cao BU nhận thấy mẫu DL0038A có giá trị 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 Giá trị IC50 (µg/ml) 1000 800 600 400 200 Hoạt tính bắt gốc DPPH tự Năng lực khử L0 03 8A D L0 03 8B D L0 05 D L0 06 D L0 06 D L0 07 D L0 07 D L0 01 L0 00 D D D L0 00 ∆OD IC50 thấp giá trị ∆OD cao nên ta chọn mẫu DL0038A Ký hiệu chủng Đồ thị 3.4 Kết khảo sát khả kháng oxy hóa phân đoạn cao BU Dựa vào đồ thị 3.5, phân đoạn cao nước nhận thấy mẫu DL0038A có giá Giá trị IC50 (µg/ml) 1000 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 800 600 400 200 Hoạt tính bắt gốc DPPH tự Năng lực khử D L0 05 D L0 06 D L0 06 D L0 07 D L0 07 L0 00 D L0 01 D L0 03 8A D L0 03 8B D D L0 00 ∆OD trị IC50 thấp giá trị ∆OD cao nên ta chọn mẫu DL0038A Ký hiệu chủng Đồ thị 3.5 Kết khảo sát khả kháng oxy hóa phân đoạn cao nước 3.4 Khảo sát ảnh hưởng cao chiết tế bào Hep G2 3.4.1 Khả gây độc tế bào Kết khảo sát khả gây độc tế bào mẫu nghiên cứu thể bảng 3.7 Kết xử lý cho thấy tồn mẫu khơng gây độc cho tế bào nồng độ từ 2,0 đến 10,0 mg/ml nên sử dụng cho thử nghiệm 54 Bảng 3.7 Khả sống sót tế bào Hep G2 Nồng độ xử lý mẫu (mg/ml) 10 Cao cồnDL0006 100,00 88,78 92,96 107,54 115,58 118,59 Tỷ lệ sống tế bào (%) Cao PECao ETCao BUDL0006 DL0038A DL0038A 100,00 100,00 100,00 83,75 103,52 145,73 85,43 104,52 153,27 87,44 105,03 156,45 89,78 107,54 159,13 96,48 109,55 158,12 Cao nướcDL0038A 100,00 92,46 94,97 97,49 97,49 99,50 3.4.2 Khả bảo vệ tế bào Các tác nhân oxy hóa tác động bất lợi lên tế bào, cần khảo sát khả bảo vệ tế bào mẫu nghiên cứu Kết khảo sát ảnh hưởng gốc hydroxyl tế bào Hep G2 cho thấy nồng độ FeSO4 10mM H2O2 1M, tế bào có tỷ lệ sống so với nhóm khơng xử lý 48,65% cao tỷ lệ 30,6% Zheng cs (2008) thực xử lý tế bào PC12 với H2O2 150µM [70] Kết thể tỷ lệ sống tế bào Hep G2 sau xử lý với tác nhân oxy hóa mẫu nghiên cứu thể bảng 3.8 Bảng 3.8 Khả bảo vệ tế bào Hep G2 cao Cordyceps Nồng độ xử lý mẫu (mg/ml) 10 Cao cồnDL0006 48,65 65,32 76,35 81,42 84,46 88,51 Tỷ lệ sống tế bào (%) Cao PECao ETCao BUDL0006 DL0038A DL0038A 48,65 48,65 48,65 64,86 73,20 68,47 72,30 81,08 78,38 79,73 91,89 86,71 85,14 99,32 96,85 89,19 102,70 106,76 Cao nướcDL0038A 48,65 59,80 68,28 77,70 87,61 92,57 Nhận xét Kết khảo sát khả bảo vệ tế bào tác động tác nhân oxy hóa mẫu chọn cho thấy tất mẫu có khả tăng mức độ sống sót tế bào Đây kết mà Zheng cs (2008) đạt nghiên cứu Tolypocladium sp [70] 55 120 100 80 Tỷ lệ sống tế 60 bào (%) 40 20 0 10 Nồng độ xử lý mẫu (mg/ml) Biểu đồ 3.1 Khả bảo vệ tế bào Hep G2 cao cồn – DL0006 Biểu đồ 3.1 cho thấy tỷ lệ sống sót tế bào tăng dần theo nồng độ xử lý mẫu có xu hướng tiếp tục tăng Tỷ lệ sống tế bào nồng độ xử lý mẫu 10 mg/ml 88,51%, thấp mẫu khảo sát 120 100 80 Tỷ lệ sống tế 60 bào (%) 40 20 0 10 Nồng độ xử lý mẫu (mg/ml) Biểu đồ 3.2 Khả bảo vệ tế bào Hep G2 cao PE– DL0006 Biểu đồ 3.2 cho thấy cao PE – DL0006 có hoạt tính tương tự cao cồn – DL0006, tỷ lệ sống tế bào nồng độ xử lý mẫu 10 mg/ml 89,19% (gần cao cồn – DL0006) Vì hai mẫu có hoạt tính bắt gốc DPPH tự lực khử thấp nên hiệu xử lý hệ thống tế bào thấp mẫu lại 56 120 100 80 Tỷ lệ sống tế 60 bào (%) 40 20 0 10 Nồng độ xử lý mẫu (mg/ml) Biểu đồ 3.3 Khả bảo vệ tế bào Hep G2 cao ET – DL0038A Biểu đồ 3.3 cho thấy hiệu bảo vệ tế bào cao ET – DL0038A cao có xu hướng tiếp tục tăng Tại nồng độ xử lý mẫu 10 mg/ml, tỷ lệ sống tế bào 102,70% cao gấp 2,11 lần so với đối chứng cao tỷ lệ sống nhóm khơng xử lý tác nhân oxy hóa 120 100 80 Tỷ lệ sống tế 60 bào (%) 40 20 0 10 Nồng độ xử lý mẫu (mg/ml) Biểu đồ 3.4 Khả bảo vệ tế bào Hep G2 cao BU – DL0038A Cao BU – DL0038A có khả bảo vệ tế bào tốt nhất, tỷ lệ sống tế bào nồng độ xử lý mẫu 10 mg/ml 106,76% cao gấp 2,19 lần so với đối chứng Vì mẫu có khả kích thích tế bào phát triển tốt (theo biểu đồ 3.4) nên dù hoạt tính bắt gốc DPPH tự lực khử thấp cao ET – DL0038A, hiệu bảo vệ tế bào tốt 57 120 100 80 Tỷ lệ sống tế 60 bào (%) 40 20 0 10 Nồng độ xử lý mẫu (mg/ml) Biểu đồ 3.5 Khả bảo vệ tế bào Hep G2 cao nước – DL0038A Cao nước – DL0038A có hiệu bảo vệ tế bào Hep G2 cao cao cồn – DL0006, cao PE – DL0006 thấp cao ET– DL0038A, caoBU– DL0038A Tỷ lệ sống sót tế bào nồng độ xử lý mẫu 10 mg/ml 92,57% 3.4.3 Khả bảo vệ DNA tế bào Hep G2 Kết khảo sát khả phá vỡ DNA gốc hydroxyl sinh phản ứng Fenton cho thấy phản ứng phá vỡ xảy tốt nồng độ H2O2 1M cố định FeSO4 nồng độ 400µM Tiếp tục cố định nồng độ H2O2 1M, khảo sát nồng độ FeSO4 thích hợp xúc tác phản ứng xảy Kết cho thấy nồng độ FeSO4 60mM DNA bắt đầu bị phá vỡ, nồng độ FeSO4 80mM 100mM DNA bị phá vỡ hồn tồn Do đó, để phá vỡ DNA, nồng độ thích hợp cho phản ứng H2O2 1M FeSO4 60mM Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ FeSO4 khác lên phá vỡ DNA nồng độ H2O2 1M 58 Chú thích: Band 1: DNA ban đầu Band 2: Xử lý FeSO4 20mM Band 3: Xử lý FeSO4 40mM Band 4: Xử lý FeSO4 60mM Band 5: Xử lý FeSO4 80mM Band 6: Xử lý FeSO4 100mM Tiến hành khảo sát khả bảo vệ DNA mẫu, kết cho thấy nồng độ từ 0,5 đến 2,0 mg/ml, mẫu khảo sát có khả bảo vệ DNA Hình 3.2 Khảo sát khả bảo vệ DNA cao Cordyceps 59 Chú thích: Band 1: Mẫu cao cồn chủng DL0006 – nồng độ 0,5 mg/ml Band 2: Mẫu cao cồn chủng DL0006 – nồng độ 1,0 mg/ml Band 3: Mẫu cao cồn chủng DL0006 – nồng độ 1,5 mg/ml Band 4: Mẫu cao cồn chủng DL0006 – nồng độ 2,0 mg/ml Band 5: Mẫu cao PE chủng DL0006 – nồng độ 0,5 mg/ml Band 6: Mẫu cao PE chủng DL0006 – nồng độ 1,0 mg/ml Band 7: Mẫu cao PE chủng DL0006 – nồng độ 1,5 mg/ml Band 8: Mẫu cao PE chủng DL0006 – nồng độ 2,0 mg/ml Band 9: Mẫu cao ET chủng DL0038A – nồng độ 0,5 mg/ml Band 10: Mẫu cao ET chủng DL0038A – nồng độ 1,0 mg/ml Band 11: Mẫu cao ET chủng DL0038A – nồng độ 1,5 mg/ml Band 12: Mẫu cao ET chủng DL0038A – nồng độ 2,0 mg/ml Band 13: Mẫu cao BU chủng DL0038A – nồng độ 0,5 mg/ml Band 14: Mẫu cao BU chủng DL0038A – nồng độ 1,0 mg/ml Band 15: Mẫu cao BU chủng DL0038A – nồng độ 1,5 mg/ml Band 16: Mẫu cao BU chủng DL0038A – nồng độ 2,0 mg/ml Band 17: Mẫu cao nước chủng DL0038A – nồng độ 0,5 mg/ml Band 18: Mẫu cao nước chủng DL0038A – nồng độ 1,0 mg/ml Band 19: Mẫu cao nước chủng DL0038A – nồng độ 1,5 mg/ml Band 20: Mẫu cao nước chủng DL0038A – nồng độ 2,0 mg/ml DNA toàn mẫu xử lý nguyên vẹn so với mẫu DNA đứt gãy phản ứng phá vỡ DNA, mức độ nguyên vẹn tương dương so với DNA gen ban đầu Kết cho thấy mẫu chọn có khả kháng oxy hóa cao khả bảo vệ DNA tránh khỏi tác hại q trình oxy hóa tốt Đồng thời, mẫu khơng có tính độc tế bào mà cịn kích thích phát triển tế bào nên khẳng định mẫu tiêu biểu cho hoạt tính kháng oxy hóa cao phân đoạn cao chiết có tiềm dược học cao 60 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61 4.1 Kết luận - Quá trình chiết cao cồn có hiệu suất cao chủng DL0050 (48,48%) thấp chủng DL0004 (19,85%) Hiệu suất chiết cao lại từ cao cồn cao DL0004 (93,28%) thấp DL0050 (60,62%) - Tồn mẫu khảo sát có hoạt tính bắt gốc DPPH tự lực khử, đồng thời có chứa polyphenol polysaccharid - Hàm lượng polyphenol polysaccharid có mối tương quan cao với hoạt tính bắt gốc DPPH tự khơng tương quan với lực khử - Cả mẫu khảo sát không gây độc cho tế bào Hep G2 dãy nồng độ xử lý – 10 mg/ml - Cả mẫu khảo sát có khả bảo vệ tế bào Hep G2 DNA gen tế bào không bị gãy vỡ tác nhân oxy hóa 4.2 Đề nghị - Khảo sát khả bảo vệ protein lipid tế bào khỏi tác hại oxy hóa - Định danh chủng có hoạt tính kháng oxy hóa cao DL0006 DL0038A - Nghiên cứu kỹ thông số động học q trình kháng oxy hóa Cordyceps - Nghiên cứu chứng minh thành phần tạo khả kháng oxy hóa Cordyceps - Nghiên cứu khả kháng oxy hóa Cordyceps mơ hình in vivo - Nghiên cứu tiềm dược học Cordyceps việc phòng trị bệnh liên quan đến oxy hóa 62 ... kiện sinh trưởng Cordyceps Chính lý đó, nhóm nghiên cứu định thực đề tài: ? ?Nghiên cứu khả kháng oxy hóa cao chiết nấm Cordyceps sp.? ?? đối tượng chủng Cordyceps phân lập Việt Nam nhằm khảo sát hoạt... deoxyadenosin kinase 1.5 Tình hình nghiên cứu Cordyceps 1.5.1 Các nghiên cứu nước Trên giới, nghiên cứu Cordyceps, đặc biệt hoạt tính kháng oxy hóa, nhà khoa học quan tâm Rất nhiều nghiên cứu. .. 1.5 Tình hình nghiên cứu Cordyceps 20 1.5.1 Các nghiên cứu nước 20 1.5.2 Các nghiên cứu nước 23 Chương – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 25 26 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.1.1.1