Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn sâu răng của một số loài thực vật

Nghiên cứu khả kháng khuẩn sâu số loài thực vật Nguyễn Thị Thúy Anh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên; Khoa Sinh học Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30 Người hướng dẫn: TS Nguyễn Quang Huy Năm báo vệ: 2011 Abstract Tổng quan Bệnh sâu chế gây bệnh sâu răng; Vi khuẩn Streptococcus mutans khả gây bệnh sâu răng; Các biện pháp phòng ngừa sâu răng; Hợp chất thứ cấp thực vật Trình bày nguyên liệu phương pháp nghiên cứu: Nuôi cấy vi khuẩn chuẩn bị mẫu tế bào; Chiết rút hợp chất tự nhiên dịch chiết thực vật; Nghiên cứu định tính thành phần số hợp chất tự nhiên có dịch chiết thực vật; Phân tách thành phần chất dịch chiết thực vật; Xác định tính kháng khuẩn sâu phương pháp đục lỗ; Xác định mức độ sinh axit vi khuẩn thí nghiệm giảm pH; Xác định mức độ sống sót vi khuẩn… Đưa kết nghiên cứu: Nghiên cứu sàng lọc số thuốc có khả kháng khuẩn sâu răng; Phân tích số hợp chất thực vật thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn từ Lấu Ba Vì xồi Keywords Khả kháng khuẩn; Sâu răng; Thực vật; Vi khuẩn; Dịch chiết thực vật Content Mở đầu Sâu bệnh phổ biến giới, lứa tuổi, tầng lớp xã hội Bệnh sâu có tỷ lệ mắc cao cộng đồng, việc điều trị sâu tốn cho cá nhân xã hội kinh phí thời gian Bệnh sâu Tổ chức Y tế giới (WHO) nhiều quốc gia giới đặc biệt quan tâm Bệnh sâu xem ba mối nguy hại cho sức khỏe người sau bệnh tim mạch ung thư, nay, bệnh sâu săng nỗi lo mà xem thường Theo số liệu điều tra Viện Răng Hàm Mặt Trung Ương năm 2003, khoảng 90% dân số Việt Nam mắc bệnh răng, miệng, phổ biến sâu viêm quanh Nguyên nhân gây bệnh sâu vi khuẩn, đặc biệt vi khuẩn nhóm Streptococci có mặt mảng bám sinh axit gây ăn mòn men Cách tốt để phòng chống bệnh sâu vệ sinh miệng thường xuyên cách với hạn chế đồ ăn có nhiều đường Các sản phẩm bảo vệ miệng sử dụng thường bổ sung chất kháng khuẩn fluor, axit yếu, peroxit hydro, muối kim loại Tuy nhiên, việc sử dụng lâu dài chất kháng khuẩn fluor, axit yếu… mang lại hậu không mong muốn Hiện nay, việc tìm kiếm hợp chất có tác dụng bảo vệ răng, đặc biệt hợp chất từ thiên nhiên thu hút quan tâm nhà khoa học doanh nghiệp Việt Nam nước nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật phong phú đa dạng, có nhiều lồi có chứa hợp chất có hoạt tính cao, sử dụng việc chữa bệnh Ở Việt Nam, việc tìm kiếm hợp chất từ thiên nhiên ý, nhiên chưa mang lại hiệu mong đợi, nhiều nghiên cứu ứng dụng thực tiễn cịn hạn chế Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu phòng chống bệnh răng, đặc biệt sâu răng, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khả kháng khuẩn sâu số loài thực vật” Với đối tượng nghiên cứu vi khuẩn sâu S mutans, Việt Nam có số cơng trình nghiên cứu Sao Đen, Sắn thuyền, Kim ngân, Sài đất [9, 10] Để bổ sung nguồn liệu khoa học thuốc Việt Nam, lựa chọn số thuốc khác có tính kháng khuẩn sở tài liệu Những thuốc vị thuốc Việt Nam Đỗ Tất Lợi [11] Đồng thời, lựa chọn thêm số thuốc chưa nghiên cứu thường sử dụng thuốc dân gian để chữa bệnh sâu Các thuốc đề tài gồm có: Duối (Streblus asper); Húng quế (Ocimum basilicum L.); Lấu Ba Vì (Psychotria baviensis); Lược vàng (Callisi fragrans L.); Xoan (Melia azedarach L.); Xoài (Mangifera indica L.) Nguyên liệu phương pháp 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Chủng vi sinh vật Chủng vi khuẩn Streptococcus mutans GS5, quà tặng giáo sư Robert Marquis, Đại học Rochester, Mỹ Chủng vi khuẩn Streptococcus mutans 74, phân lập từ mẫu bệnh phẩm người Việt Nam lấy Khoa Răng Hàm Mặt, Bệnh viện Bạch Mai, Hà Nội Chủng S mutans 74 giữ bảo quản phịng thí nghiệm Enzym học Phân tích hoạt tính Sinh học, Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein 2.1.2 Mẫu thực vật nghiên cứu Các mẫu thực vật Cau, Ruối, Xoan, Xồi thu thập từ tỉnh Hải Phịng Mẫu Lược vàng, Húng quế thu thập tỉnh Hưng Yên Mẫu Chè, Ngũ sắc, Lấu Ba Vì thu thập Chương Mỹ, Hà Nội Các mẫu thực vật xác định tên TS Nguyễn Trung Thành, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Hà Nội Nguyên liệu thực vật sau thu thập về, rửa sạch, sấy khơ, sau nghiền thành bột mịn ngâm chiết dung môi nghiên cứu với tỷ lệ 1g nguyên liệu: 10 thể tích dung mơi 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Ni cấy vi khuẩn chuẩn bị mẫu tế bào Các mẫu vi khuẩn nuôi cấy môi thạch tryptic soy agar (TSA) cấy chuyển tuần lần, giữ 4oC Vi khuẩn nuôi cấy lắc 37oC môi trường TY (tryptone 3%, cao nấm men 0,5%) có bổ sung glucose 1%; thời gian ni cấy từ 12-14 Tế bào vi khuẩn thu lại ly tâm, sau hịa tan lại muối khoáng (KCl 50mM, MgCl2 1mM) Mẫu vi khuẩn lưu giữ lâu dài -80oC glycerol 50% 2.2.2 Chiết rút hợp chất tự nhiên dịch chiết thực vật Các mẫu chuẩn bị theo phương pháp chiết ngâm Các mẫu thực vật rửa sấy khơ, nghiền nhỏ, sau chiết nước hay dung môi ethanol 96o theo tỷ lệ 1:10 (1g nguyên liệu: 10ml dung môi) Sau chiết xong ly tâm bỏ cặn 2.2.3 Phân tách thành phần chất dịch chiết thực vật Phương pháp sắc kí mỏng sử dụng để phân tách thành phần dịch chiết Sắc ký lớp mỏng (TLC) thực mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) Dịch chiết thực vật tiến hành chạy sắc ký mỏng chiều (7x13cm) với hệ dung môi TEAF (Toluen: ethylacetat: axeton: axit formic 5:3:1:1), phát sắc ký đồ điều kiện ánh sáng thường không phun thuốc thử có phun thuốc thử đặc trưng dung dịch H2SO4 10% phun lên mỏng, sấy khơ hơ nóng bề mặt bếp điện từ từ đến màu Từ màu sắc sắc ký đồ cho phép xác định có mặt chất dịch chiết 2.2.4 Xác định tính kháng khuẩn sâu phương pháp đục lỗ Dịch chiết, sau phân tách sắc kí thu lại số băng vạch, hòa tan methanol, ly tâm thu dịch trong, loại bỏ cặn Vi khuẩn S.mutans cấy trải môi trường thạch TSA Sau đó, đĩa thạch đục lỗ, lỗ bổ sung vào 0,25ml dịch chiết Nuôi vi khuẩn tủ ấm 37oC qua đêm Quan sát vòng kháng khuẩn 2.2.5 Xác định mức độ sinh axit vi khuẩn thí nghiệm giảm pH Tế bào vi khuẩn sau ni cấy hịa lại dung dịch muối khoáng 1x cho mật độ cuối tương đương A700 = 10 pH huyền dịch tế bào chỉnh đến 7,2 NaOH 0,1N Glucose bổ sung cho nồng độ cuối 1%, đảm bảo mơi trường dư thừa chất cho q trình đường phân Sự giảm pH môi trường theo dõi máy pH meter thời điểm định Độ giảm pH môi trường phản ánh khả sinh axit tế bào 2.2.6 Xác định mức độ sống sót vi khuẩn Xác định mức độ sống sót tế bào vi khuẩn tiến hành theo phương pháp Phan cộng [15] Tế bào vi khuẩn rửa hòa tan dung dịch peptone 1% cho mật độ tế bào cuối tương đương A700 = (khoảng 109 tế bào/ml) Các chất bổ sung để đạt nồng độ cuối mong muốn Hút 100l dịch tế bào pha loãng peptone 1% theo nồng độ nhỏ dần 10 lần cấy trải đĩa thạch TSA Các đĩa thạch cất 37oC khuẩn lạc hình thành rõ rệt đếm mắt thường Tác dụng gây chết dịch chiết đánh giá giá trị D, thời gian cần thiết để 50% quần thể vi khuẩn bị giết chết Tác dụng đánh giá giá trị LogN/N0 với N0 số vi khuẩn ban đầu, N số vi khuẩn thời điểm nghiên cứu Giá trị D tương ứng với LogN/N0 = -1/2 2.2.7 Phương pháp xác định ảnh hưởng dịch chiết lên khả hình thành biofilm vi khuẩn Nguyên tắc: điều kiện dinh dưỡng thích hợp mơi trường nuôi cấy tĩnh bề mặt giá thể chủng vi sinh vật hình thành biofilm bề mặt giá thể Phát hiện, quan sát biofilm cách nhuộm với tím kết tinh – chất có khả bắt màu với tế bào vi khuẩn Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp O’Toole cộng [50] Các chủng vi khuẩn lắc kích hoạt bình tam giác chứa môi trường TYG 24 37oC cho mật độ tế bào đo bước sóng 620nm vào khoảng 0,2- 0,3 Hút 100µl dịch ni cấy vi khuẩn bổ sung vào 700µl TYG lỏng ống effendorf khử trùng ủ điều kiện tĩnh 37oC 24 Ống đối chứng bổ sung thêm H2O lúc với dịch nuôi cấy vi khuẩn Đối với ống effendorf nghiên cứu tác dụng dịch chiết dịch chiết bổ sung lúc với dịch nuôi cấy vi khuẩn Sau 48 màng dịch nuôi cấy loại bỏ cẩn thận khỏi ống effendorf Quan sát khả hình thành biofilm: Mỗi ống effendorf rửa lần nước cất khử trùng Bổ sung vào ống effendorf 1ml dung dịch tím tinh thể 1% giữ 20 phút nhiệt độ phòng Loại bỏ dung dịch nhuộm quan sát bắt màu tế bào bám trên thành ống với tím kết tinh Định lượng mức độ tạo biofilm: Sau rửa lần nước cất khử trùng tinh thể tím bám thành effendorf hòa tan 1ml etanol 70o Mật độ tế bào biofilm xác định cách đo độ hấp thụ bước sóng 570nm 2.2.8 Phương pháp xác định hoạt độ số enzym quan trọng vi khuẩn gây bệnh sâu 2.2.8.1 Chuẩn bị tế bào thấm Tế bào nuôi qua đêm rửa lần dung dịch muối khoáng 1x (50mM KCl, 1mM MgCl2) hòa lại đệm Tris– HCl 50mM, pH 7,5 có bổ sung 1mM MgCl2, 50mM KCl cho mật độ tế bào tương đương OD700 = 14 Dung dịch tế bào chia vào ống falcon (5ml/ống), bổ sung thêm 10% toluen, trộn mạnh máy Vortex Sau đó, hỗn hợp ủ 37oC bể ổn nhiệt phút chuyển sang làm đông đá nitơ lỏng phút Lặp lại pha làm ấm đông đá tế bào lần Cuối cùng, dung dịch tế bào ủ 37oC tan đá hoàn toàn Loại bỏ toluen dư ly tâm rửa lại lần với dung dịch muối khống 1x Hịa kết tủa tế bào trở lại đệm Tris– HCl pH 7,5 với thể tích 1/10 thể tích ban đầu Việc xử lý tế bào với toluen kết hợp với việc chuyển tế bào qua pha ấm pha đơng đá có tác dụng làm tổn thương cục màng tế bào, làm cho tế bào thấm chất có khối lượng phân tử lớn khơng làm tổn thương enzym màng Vì vậy, dịch tế bào chuẩn bị theo phương pháp gọi dịch tế bào thấm, sử dụng thiết bị thí nghiệm với enzym 2.2.9 Phương pháp xác định phổ hồng ngoại hợp chất Các dịch chiết nghiên cứu phân tách sắc ký mỏng để phân tách thành phân đoạn khác Sau phân đoạn có hoạt tính mạnh xác định phổ hấp thụ hồng ngoại Sử dụng máy quang phổ hồng ngoại, máy làm việc miền xạ hồng ngoại, vê nguyên lý giống máy quang phổ hấp thụ khác Phân đoạn dịch chiết sau chạy sắc ký mỏng, cạo, hòa tan trở lại methanol Ly tâm lần thu dịch trong, thấm phân đoạn dịch chiết lên chất KBr đưa vào máy xác định phổ hấp thụ Phổ hồng ngoại đo máy quang phổ hồng ngoại FTIR, khoa Cơng nghệ Hóa học Môi trường, Đại học Sư Phạm Kỹ thuật Hưng Yên Kết thảo luận 3.1 Nghiên cứu sàng lọc số thuốc có khả kháng khuẩn sâu 3.1.1 Khả ức chế sinh axit từ dịch chiết số thuốc Bảng So sánh tác dụng dịch chiết thực vật chiết H2O ethanol lên sinh axit vi khuẩn S mutans 74 với nồng độ 10% (v/v) Giá trị pH cuối STT Tên dịch chiết Chiết ethanol Chiết nước LVL 5,51 4,80 HUN 5,42 4,98 LAU 6,12 4,45 DUL 5,06 4,87 LVT 4,94 4,88 XOA 5,08 5,19 Lx 5,87 4,45 Tx 5,78 5,17 Kết bảng cho thấy dịch chiết thuốc ethanol có tác dụng ức chế sinh axit vi khuẩn mạnh so với mẫu loại chiết nước Điều chứng tỏ hoạt chất gây ức chế sinh axit vi khuẩn S mutans 74 hòa tan tốt ethanol, mặt khác dịch chiết ethanol thuận lợi cho việc tách chiết [10] Do vậy, lựa chọn ethanol cho thí nghiệm Kết nghiên cứu ảnh hưởng dịch chiết thuốc lên sinh axit vi khuẩn S mutans 74 trình bày hình Hình Ảnh hưởng dịch chiết thực vật lên sinh axit vi khuẩn S.mutans 74 Trong môi trường không bổ sung dịch chiết thuốc, pH huyền dịch tế bào giảm nhanh (mẫu đối chứng ethanol nước), mẫu có bổ sung dịch chiết vào huyền dịch tế bào làm cho sản xuất axit vi khuẩn S mutans 74 bị ức chế thể qua giảm pH chậm lại Sau 90 phút thí nghiệm, kết cho thấy mẫu đối chứng (ĐC), pH cuối nằm khoảng 4,0 - 4,6 có khác biệt mẫu đối chứng nước hay ethanol Trong mẫu có bổ sung dịch chiết thực vật pH cuối cao hơn, với giá trị tương ứng từ 4,9 đến 6,2 Trong mẫu dịch chiết thực vật làm thí nghiệm, dịch chiết Lấu Ba Vì (LAU) Xoài (Tx, Lx) thể khả ức chế sinh axit tốt Giá trị pH giảm hai mẫu cho thấy dịch chiết từ xoài Lấu Ba Vì làm chậm tốc độ giảm pH môi trường, giá trị pH cuối sau 90 phút thí nghiệm dịch chiết thân xồi 5,78, dịch chiết xoài 5,87 dịch chiết Lấu Ba Vì 6,12 Vì vậy, chúng tơi lựa chọn dịch chiết xồi, thân xồi dịch chiết Lấu Ba Vì để tiếp tục nghiên cứu 3.1.2 Khả diệt S mutans dịch chiết số thực vật 3.1.2.1 Khả giết vi khuẩn Streptococcus mutans pH 4,0 Thí nghiệm tiến hành pH 4,0, giá trị pH bắt đầu gây mịn men Đây mơi trường mà vi khuẩn S mutans có khả sinh trưởng tốt, chủng vi khuẩn khác phát triển [23] Hình Khả giết vi khuẩn S.mutans dịch chiết pH 4,0 Kết hình cho thấy, với nồng độ 15%, thời gian 90% quần thể tế bào vi khuẩn bị giết chết tương ứng với giá trị logN/No= -1 13 phút dịch chiết thân xoài với dịch chiết xoài 19 phút Đối với dịch chiết từ Lấu Ba Vì (LAU), 50% quần thể tế bào bị giết sau khoảng 20 phút xử lý So sánh với kết nghiên cứu với số nghiên cứu công bố dịch chiết số nguồn thực vật khác từ vỏ măng cụt [18], vỏ đen sắn thuyền [7, 17] cho thấy hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết thân xoài xoài cao 3.1.2.2 Khả giết vi khuẩn Streptococcus mutans pH 7,0 Giá trị pH 7,0 giá trị pH trung tính khoang miệng chúng tơi tiến hành thử nghiệm với dịch chiết Kết cho thấy pH 7,0, dịch chiết có tác dụng diệt vi khuẩn S mutans Tuy nhiên, so với khả diệt khuẩn pH 4,0 khả giết vi khuẩn pH 7,0 thấp với nồng độ dịch chiết Thời gian để diệt 50% số lượng tế bào quần thể vi khuẩn S mutans 74 dịch chiết từ Lấu Ba Vì từ 23 đến 25 phút Cịn với dịch chiết thân xoài, xoài 23 phút 25 phút 90% số lượng tế bào quần thể bị tiêu diệt (Hình 7) So sánh với kết nghiên cứu trước Nguyễn Quang Huy cộng [10, 11] cho thấy dịch chiết ethanol từ xoài, thân xoài Lấu Ba Vì có khả giết S mutans 74 thấp so với dịch chiết từ Sao đen hay sắn thuyền Tuy nhiên, kết nghiên cứu đối tượng vi khuẩn S mutans 74, chủng vi khuẩn phân lập từ người Việt Nam Hình Khả giết vi khuẩn S mutans 74 dịch chiết pH 7,0 (a) (b) Hình 12 Khả ức chế hình thành biofilm chủng S mutans 74 dịch chiết thân xoài (a) Lấu Ba Vì (b) Kết cho thấy dịch chiết mẫu nghiên cứu có tác dụng ức chế hình thành biofilm chủng S mutans 74 thể giá trị OD570 giảm so với giá trị OD570 đối chứng (hình 12) Đối với chủng S mutans GS-5, kết cho thấy hình thành biofilm có phần yếu so với chủng S mutans 74 Tuy nhiên, mẫu có bổ sung dịch chiết cho thấy có ức chế hình thành biofilm (hình 13) (a) (b) Hình 13 Khả ức chế hình thành biofilm chủng S mutans GS-5 dịch chiết thân xồi (a) Lấu Ba Vì (b) 3.1.5 Phân tách hợp chất sắc ký lớp mỏng Bước tiếp theo, phân tách hợp chất phương pháp sắc kí lớp mỏng Theo kết nghiên cứu Nguyễn Quang Huy cộng [10] cho thấy hệ dung môi TEAF với tỷ lệ 5:3:1:1 cho khả tách chiết hợp chất thứ cấp dịch chiết thực vật tốt Vì vậy, lựa chọn hệ dung môi TEAF với tỷ lệ 5:3:1:1 cho thí nghiệm sắc kí mỏng với dịch chiết Từ dịch chiết ethanol qua sắc ký mỏng với hệ dung môi TEAF (5:3:1:1) nhận thấy xồi có phân đoạn (hình 14c), nhiều phân đoạn dịch chiết thân xoài phân đoạn (hình 14b) Trong băng vạch xuất dịch chiết thân xồi băng có hệ số Rf = 0,57 thấy xuất thân xồi, ký hiệu M5 (a) (b) (c) Hình 14 Ảnh sắc ký mỏng từ dịch chiết Lấu Ba Vì (a), thân xồi (b), xồi (c) Từ phân đoạn sắc ký mỏng thu được, chúng tơi tiến hành đánh giá kiểm tra hoạt tính ức chế phát triển chủng Streptococci từ phân đoạn tách từ sắc ký (hình 14) Các phân đoạn tách từ sắc ký lá, vỏ xoài Lấu Ba Vì có tác dụng ức chế phát triển chủng Streptococci mức độ khác Trong thấy phân đoạn M5 (có hệ số Rf = 0,57) có hoạt tính mạnh ức chế phát triển chủng vi khuẩn S mutans GS-5, chủng S mutans 74 phân lập từ người Việt Nam (hình 15) Tuy nhiên, lượng tách chiết chưa nhiều nên việc đánh giá bước đầu, cần có thí nghiệm để thu hồi lượng mẫu từ phân đoạn lớn (a) (b) Hình 15 Khả ức chế phát triển S mutans GS-5 (a), S mutans 74 (b) cuả dịch chiết xồi (a) (b) Hình 16 Khả ức chế phát triển S mutans GS-5 (a), S mutans 74 (b) cuả dịch chiết Lấu Ba Vì Kết cho thấy dịch chiết từ Lấu Ba Vì có phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh chủng S mutans từ người Việt Nam phân đoạn tương ứng với Rf 0,78 0,98; Các phân đoạn có tác dụng chủng chuẩn S mutans GS5 Kết sở để tiến hành xác định hợp chất có tác dụng diệt vi khuẩn sâu S mutans dịch chiết từ Lấu Ba Vì xoài cho nghiên cứu 3.1.6 Nghiên cứu tác dụng số phân đoạn dịch chiết lên số enzym S mutans Các phân đoạn thu từ sắc lý lớp mỏng có hoạt tính kháng khuẩn mạnh sử dụng cho nghiên cứu ảnh hưởng lên enzym vi khuẩn S mutans Với dịch chiết Lấu Ba Vì, phân đoạn có hoạt tính mạnh phân đoạn có Rf= 0,98, dịch chiết xoài thân xoài có phân đoạn có Rf= 0,57 có hoạt tính mạnh 3.1.6.1 Ảnh hưởng lên enzym ATPase ATPase enzym màng tế bào, có vai trị quan trọng q trình vận chuyển proton qua màng, enzym có vai trị định khả chịu axit vi khuẩn sâu Kết nghiên cứu ảnh hưởng phân đoạn M5 có tác dụng ức chế hoạt tính enzym ATPase Ngay nồng độ thấp 2,5%, khoảng gần 50% hoạt tính enzym bị ức chế chủng S mutans 74 Tác dụng ức chế enzym ATPase phân đoạn giải thích phần tác dụng diệt vi khuẩn S.mutans giá trị pH axit dịch chiết thân xồi (a) (b) Hình 17 Ảnh hưởng phân đoạn dịch chiết xoài (a), phân đoạn dịch chiết Lấu Ba Vì (b) lên hoạt độ ATPase S mutans 74 3.1.6.2 Ảnh hưởng lên enzym NADH oxidase NADH oxidase chịu trách nhiệm cho q trình hô hấp vi khuẩn gây sâu Kết thu ức chế enzyme hình 18 (a) (b) Hình 18 Ảnh hưởng phân đoạn dịch chiết xoài (a), phân đoạn dịch chiết Lấu Ba Vì (b) lên hoạt độ NADH oxidase S mutans 74 So sánh khả ức chế enzyme NADH oxidase, dịch chiết xoài nồng độ 2% ức chế 50% hoạt độ enzyme, dịch chiết lấu Ba Vì nồng độ 1% ức chế 50% hoạt độ enzym, theo kết nghiên cứu Nguyễn Quang Huy dịch chiết sắn thuyền đen nồng độ 3% ức chế 50% hoạt độ enzyme Như khả ức chế enzyme NADH oxidase hai dịch chiết nghiên cứu cao kết nghiên cứu trước Điều bước đầu giải thích trình sinh axit tế bào vi khuẩn S mutans bị ức chế dịch chiết thân xồi, dịch chiết Lấu Ba Vì 3.1.6.2 Ảnh hưởng lên enzym phosphoryl hóa đường (PTS) Hệ thống enzym PTS đóng vai trị chủ yếu việc phosphoryl hóa đường từ bên ngồi vào tế bào chất Kết kiểm tra ảnh hưởng phân đoạn số dịch chiết xồi Lấu Ba Vì lên hoạt tính enzym PTS Kết hình 19 cho thấy hợp chất với nồng độ dịch chiết xồi 1%, dịch chiết Lấu Ba Vì 2% ức chế 50% hoạt độ enzyme vận chuyển đường (a) (b) Hình 19 Ảnh hưởng phân đoạn dịch chiết xoài (a), phân đoạn dịch chiết Lấu Ba Vì (b) lên hoạt độ enzym PTS S mutans 74 3.1.7 Phổ hấp thụ hồng ngoại số phân đoạn dịch chiết Để bước đầu tìm hiểu cấu trúc phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn sâu Streptococcus mutans mạnh từ dịch chiết Lấu Ba Vì thân, xồi, đánh giá qua khả hấp thụ bước sóng hồng ngoại Hình 20 Phổ hấp thụ hồng ngoại phân đoạn dịch chiết xồi Nhìn kết hình 20 ta thấy xuất số đỉnh hấp thụ hồng ngoại phân đoạn dịch chiết xồi Đỉnh hấp thụ bước sóng mức độ vừa phải khoảng 3200- 3700 cm-1 vùng hấp thụ liên kết –OH Ngồi cịn xuất đỉnh hấp thụ mạnh bước sóng khoảng 1000- 1500 cm-1, hấp thụ thấp bước sóng khoảng 600 – 1000 cm-1 vùng hấp thụ liên kết C=C mạch vịng Từ kết thấy dịch chiết phân đoạn hợp chất mangiferin, loại polyphenol Cấu trúc Mangiferin [66] Mangiferin [66] sử dụng y học nhiều nước giới chống oxy hóa, kháng viêm, kháng virus, tăng cưỡng miễn dịch Thân xoài chứa mangiferin tới 3%, xoài chứa khoảng 1,6% mangiferin Chất xồi chất chống viêm, cịn có tác dụng diệt vi khuẩn gram dương mạnh, bảo vệ miêng, chống bựa mảng phủ quanh chân Mangiferin dễ tan nước nóng, để chiết xuất dùng dung mơi metylic, etylic, axeton, chloroform, n-butanol [14] Hình 21 Phổ hấp thụ hồng ngoại phân đoạn dịch chiết Lấu Ba Vì Kết hình 21 cho thấy, phổ hấp thụ phân đoạn dịch chiết Lấu Ba Vì xuất nhiều đỉnh hấp thụ, chứng tỏ phân tách phân đoạn chưa sạch, phân đoạn lẫn số phân đoạn khác Tuy nhiên, số đỉnh hấp thụ, có đỉnh hấp thụ khoảng 3200-3600, vùng chứa liên kết – OH, ta kết luận bước đầu phân đoạn chứa hợp chất polyphenol, để khẳng định cần phải có thêm kết nghiên cứu sâu References : Tài liệu tiếng Việt Đỗ Huy Bích, (2004) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam (2 tập), NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Lê Tự Hải, Phạm Thị Thùy Trang, Dương Ngọc Cầm, Trần Văn Thắm, (2010) “Nghiên cứu tách chiết, xác định thành phần hóa học hợp chất tanin từ chè xanh khảo sát tính ức chế ăn mịn kim loại nó” Trịnh Đình Hải (2004), “Giáo trình dự phịng sâu răng”, Nhà xuất Y học Trịnh Đình Hải, (2005) “Sâu người trưởng thành” Tạp chí Y học Việt Nam số 1/2005: 7-11 Nguyễn Dương Hồng (1997), “Sâu răng-Răng Hàm Mặt”, Tập Nxb Y học, pp 102-199 Lê Thị Thu Hiền, (2010) “Khảo sát tính kháng sinh chất chiết hành, tỏi, hẹ, móng tay vi khuẩn E coli”, LV-NLN-NN02, Đại học Nơng lâm Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Như Hiền, Chu Văn Mẫn, (2004), Cơ sở sinh học người, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Quang Huy (2008), “Nghiên cứu tác dụng số hợp chất thực vật thứ sinh lên vi khuẩn gây sâu răng”, Luận án tiến sĩ khoa học, pp 51-52 Nguyễn Quang Huy, Phạm Thanh Nga, Phan Tuấn Nghĩa (2005), “Tìm hiểu tác dụng chống sâu dịch chiết vỏ Sao Đen (Hopea odorata Roxb)”, Tạp chí Dược học, 45 (350), pp 13-19 10 Nguyễn Quang Huy, Ngô Văn Quang, Phạm Văn Kiệm, Phan Tuấn Nghĩa (2007), “Axít asiatic phân lập từ sắn thuyền Syzygium resinosum Gagnep tác dụng lên vi khuẩn Streptococcus mutans”, Tạp chí Dược học 47, pp 19-22 11 Đỗ Tất Lợi (1986), “Những thuốc vị thuốc Việt Nam”, Nxb Khoa học kĩ thuật, Hà Nội 12 Nguyễn Hoàng Lộc, “Sản xuất hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật”, Viện Tài nguyên Môi trường Công nghệ Sinh học, Đại Học Huế 13 Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga, Nguyễn Văn Mùi, (2007), “Điều tra hợp chất carotenoit số thực vật Việt Nam” Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 23: 130-134 14 Đoàn Suy Nghĩ, Nguyễn Thị Thu Thủy, (2009) “Nghiên cứu số số sinh hóa khả kháng khuẩn nấm Hoàng chi Ganoderma colossum” Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, số 55: 25 – 32 15 Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Thị Mai Phương, Robert E Marquis, (2003), “Cơ chế tác dụng peroxithydro lên vi khuẩn gây bệnh sâu Streptococcus mutans”, Tạp chí Sinh học, 25(2A): 104-110 16 Nguyễn Thị Mai Phương, Bùi Tuyết Ánh (2007), “Điều tra tác dụng kháng vi khuẩn sâu Streptococcus mutans số thực vật Việt Nam”, Tạp chí Dược liệu 12, pp 19-23 17 Nguyễn Thị Mai Phương, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Phan Tuấn Nghĩa, Đặng Minh Phương (2003), “Tác dụng polyphenol dịch chiết vỏ măng cụt (Garcinia mangostana L.) lên vi khuẩn gây sâu Streptococcus mutans”, Những vấn đề khoa học sống, pp 983-986 18 Nguyễn Thị Mai Phương, Vũ Thị Minh Đức, Nguyễn Thị Ngọc Dao, (2003), “Tìm hiểu thành phần mảng bám người Việt Nam”, Tap chí Y học Việt Nam, 8, trang 11-17 19 “Sinh lý học ”, Nhà xuất Trường đại học y Hà Nội, pp 1-13 20 Trần Thị Thanh (2006), “Nghiên cứu đáp ứng stress Streptococcus mutans”, Luận văn thạc sĩ Sinh học, pp 6-14 21 Trần Thu Thủy (2005), “Sâu răng-bệnh màng sinh học”, Tài liệu dịch, cập nhật nha khoa , Nhà xuất Y học thành phố Hồ Chí Minh, pp 22-26 22 Trần Văn Trường, Trịnh Đình Hải, Spencer, J A., Thomson R K (2002) “Điều tra sức khỏe miệng toàn quốc Việt Nam 1999-2000” Tạp chí Y học Việt Nam 240: 24-28 Tài liệu Tiếng Anh 23 Aeba T., Fejerskkov Q., (2002), “Dental fluorosis: chemistry and biology”, Crit Rev Oral Biol Med., 13(2), pp.155-170 24 Beegum, S.J.G.R.J (2007), “In vitro susceptibility of viridans streptococci to leaf extracts of Mangifera Indica”, Indian J Microbiol, 47, pp 160-163 25 Belli, W A., and Marquis, R E (1991), “Adaptation of Streptococcus mutans and Enterococcus hirae to acid stress in continuous culture”, Appl Environ Microbiol 57: 785-791 26 Belli W.A., Buckley D.H., Marquis R.E., (1995), “Week acid effects and fluorid inhibition of glycolysis by Streptococcus mutans GS-5”, Can J Microbiol., 41, pp.785-791 27 Bender, G.R., Marquis, R E (1987), “Membrane ATPase and acid tolerance of Actinomyces viscosus and Lactobacillus casei”, Appl Environ Microbiol., 53, pp 2124-2128 28 Bender, G.R., Sutton, S V W., Marquis, R E (1986), “Acid tolerance, proton permeabilities, and membrane ATPase of oral streptococci”, Infect Immun., 53, pp 331-338 29 Berow, L., Sage, H., Fridovich, I (1997), “The copper and zinc-containing superoxise dismutases from E coli: molecullar and weight stability”, Arch Biochem Biophys 340: 305-310 30 Bowen W H., (1972), “Dental caries”, Archives of Disease in Childhood, 47, 849 31 Burne, R A (1998), “Oral streptococci-products of their environment”, J Dent Res 77:445–452 32 Burne, R A., Marquis, R E (2001), “Alkali production by oral bacteria and protection against dental caries”, FEMS Microbiol Lett 193: 1-6 33 Cabisco, E., Tamart, J., Ros, J (2000), “Oxidative stress in bacteria and protein damage by reactive oxygen species”, Inter Microbiol 3: 3-8 34 Cvitkovitch D.G., Boyd D.A., Thevenot T., Hamilton I.R., (1995), “Glucose transport by a mutant of Streptococcus mutans unable to accumulate sugars via the phosphoenolpyruvate phosphotransferase system’, J Bacteriol, 177, pp 2251-2258 35 Cvitkovitch, D G., Boyd, D A., Hamilton, I R (1995), “Regulation of sugar transport via the multiple sugar metabolism operon of Streptococcus mutans by the phosphoenolpyruvate phosphotransferase system”, J Bacteriol 177: 5704– 5706 36 Dashper, S G., Reynolds, E C (1992), “pH regulation by Streptococcus mutans”, J Dent Res 71:1159–1165 37 Frostell G., Keyes P.H., Larson A.H., (1967), “Effect of various sugars and sugar substitutes on dental caries in Hamsters and Rats”, The journal of nutrition, 93: pp 65-76 38 Griswold, R A., Chen, M Y Y., Burne, R A (2004), “Analysis of an deiminase gene cluster in Streptococcus mutnas UA159”, J Bacteriol 186: 1902-1904 39 Hamilton-Miller, J.M.T (2001), “Anti-cariogenic properties of tea (Camellia sinnensis)”, J Med Microbiol, 50, pp 299-302 40 Hamilton, I R., Svensater, G (1998), “Acid-regulated proteins induced by Streptococcus mutans and other oral bacteria during acid shock”, Oral Microbiol Immunol 13: 292–300 41 Iwami Y., Abbe K., Takahashi-Abbe S., Yamada T., (1992), “Acid production by streptococci growing at low pH in a chemostat under anaerobic conditions”, Oral Microbiol Immunol, 7, pp 304-308 42 Jayaraman, G C., Burne, R A (1995), “DnaK expression in response to heat shock of Streptococcus mutans”, FEMS Microbiol Lett 131: 255–261 43 Jayaraman, G C., Penders, J E., Burne, R A (1997), “Transcriptional analysis of the Streptococcus mutans hrcA, grpE, and dnaK genes and regulation of expression in response to heat shock and environmental acidification”, Mol Microbiol 25: 329–341 44 Loesche, W J (1985), “Nutrition and dental decay in infants”, Am J Clin Nutr 44: 423-435 45 Loesche, W.J (1986), “Role of Streptococcus mutans in human dental decay”, Microbiol Rev 50, 353–380 46 Makimura M., Kobayashi K., Indi J., Sakanaka S., Taguchi T., Otake S (1993), “Inhibitory effects of tea catechins on collagenase activity”, J Periodontol, 74, pp 630-636 47 Marquis R.E., Clock S.A., Mota-Meira M., (2003), “Fluoride and organic acids as modulators of microbial physiology”, FEMS Microbiol Rev, 26, pp 493-510 48 Mormann J.E, Muhlemann H.R., (1981), “Oral starch degradation and its influence on acid production in human dental plaque”, Caries Res, 15, pp 166175 49 Murchison H., Larrimore S., Hull S., Curtiss R., (1982), “Isolation and characterization of Streptococcus mutans with altered cellular morphology or chain length”, Infect Immun, 38(1): pp 282–291 50 Paul, D., Cotter, P D., Hill, C (2003), “Surviving the Acid Test: Responses of Gram-Positive Bacteria to Low pH”, Microbiol Mol Biol Rev 67(3): 429–453 51 Postma, P W., Lengeler, J W., Jacobson, G R (1993), “Phosphoenolpyruvate: carbohydrate phosphotransferase systems of bacteria’, Microbiol Rev 57: 543-594 52 Poole, L.B., Claibome, A (1986), “Interactions of pyrimidine nucleotide with redox forms of the flavin-containing NADH peroxidase form from streptococcus faecalis”, J Biol Chem, 261, pp 14525 – 14533 53 Smith D J., Taubman M.A., (1974), “Effects of local immunization with Streptococcus induction of salivary immunoglobulin a antib experimental dental caries in Rats”, Infect Immun, pp 1079-1091 54 Sturr, M G., Marquis, R E (1992), “Comparative acid tolerances and inhibitor sensitivities of isolated F-ATPases of oral lactic acid bacteria’, Appl Environ Microbiol 58: 2287–2291 55 Svensater, G., Sjogreen, B., and Hamilton, I R (2000), “Multiple stress responses in Streptococcus mutans and the induction of general and stressspecific proteins”, Microbiology 146: 107–117 56 Takami, H., Nakasone, K., Hamad, S., Slade, H D (1980), “Biology, immunology, and cariogenicity of Streptococcus mutans”, Microbiol Rev 44: 331–384 57 Trahan L (1995), “Xylitol: a review of its action on mutans streptococci and dental plaque – its clinical significane”, Int Dent J., , 45, pp 77-92 58 Quivey R.G., Kuhnert W.L., Hahn K., (2000), “Adaptation of oral streptococci to low pH”, Adv Microb Physiol, 42, pp 240-272 59 Vadeboncoeur, C., Pelletier, M (1997), “The phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system of oral streptococci and its role in the control of sugar metabolism”, FEMS Microbiol Rev 19: 187–207 60 Van Houte, J (1994), “Role of micro-organisms in caries etiology”, J Dent Res, 73 (3), pp 672-681 61 Wilson, M (1996), “Susceptibility of oral bacterial biofilms to antimicrobial agents”, J Med Microbiol, 44, pp 79-87 62 Wilkins J C., Homer, K.A., Beighton, D (2002), “Analysis of Streptococcus mutans proteins modulated by culture under acidic conditions”, Appl Environ Microbiol 68: 2382–2390 63 Wilkins, J C., Homer, K., Beighton D (2001), “Altered protein expression of Streptococcus oralis cultured at low pH revealed by two dimensional gel electrophoresis”, Appl Environ Microbiol 67: 3396–3405 64 Xiao J., Z.Y., Liu Y., Li J., Hao Y., Zhou X (2007), “Effects of Nidus Vespae extract and chemical fraction on glucosyltranferases, adherence and biofilm formation of Streptococcus mutans”, Arch Oral Biol., 52, pp 869-875 Website 65 http://www.nhakhoacongdong.vn 66 http://www.wilipedia.com ... nhiều nghiên cứu ứng dụng thực tiễn cịn hạn chế Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu phòng chống bệnh răng, đặc biệt sâu răng, tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Nghiên cứu khả kháng khuẩn sâu số loài. .. luận 3.1 Nghiên cứu sàng lọc số thuốc có khả kháng khuẩn sâu 3.1.1 Khả ức chế sinh axit từ dịch chiết số thuốc Bảng So sánh tác dụng dịch chiết thực vật chiết H2O ethanol lên sinh axit vi khuẩn. .. kết nghiên cứu với số nghiên cứu công bố dịch chiết số nguồn thực vật khác từ vỏ măng cụt [18], vỏ đen sắn thuyền [7, 17] cho thấy hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết thân xoài xoài cao 3.1.2.2 Khả