Nghiên cứu chiết xuất ethyl p methoxycinnamat từ địa liền

ĐẶT VẤN ĐỀNƣớc Việt Nam ta đƣợc thiên nhiên ƣu đãi với những cánh rừng nguyên sinh chạy dọc đất nƣớc. Thống kê có hơn 5000 loại cây thuốc trong đó có nhiều cây có tiềm năng rất to lớn trong việc chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ nhân dân.Trong hệ thống đa dạng và phong phú cây thuốc Nam, Địa liền đƣợc xem là mộtcây thuốc quý đƣợc dân gian, cộng đồng sử dụng nhiều để dùng chữa ngực bụng lạnh đau, tiêu chảy, thuốc kiện vị, giúp tiêu hóa chữa chứng ăn uống khó tiêu, đau dạ dày, cảm, ho, nôn mửa, hen suyễn và một số tác dụng khác 2. Thân rễ Địa liền khô chứa 2,4 3,9% tinh dầu. Thành phần chủ yếu là acid pmethoxycinamic, ethyl cinamat và ethylpmethoxycinnamat 2. Trong đó, ethyl pmethoxycinnamat (EPMC) chiếm chủ yếu và có nhiều tác dụng có ứng dụng lớn trong việc chữa bệnh và mỹ phẩm, nổi bật là tác dụng chống viêm tƣơng tự nonsteroidal antiinflammatory drugs (các thuốc chống viêm không steroid) do ức chế cyclooxygendase và tác dụng làm trắng da 2,8, chống nắng do ức chế enzyme tổng hợp sắc tố da melamintyrosinase và có khả năng hấp phụ UVVIS 12. Ngoài ra, chất EPMC còn có tác dụng nhƣ một chất ức chế men monoaminoxydase, có thể dùng làm thuốc chữa trầm cảm, gây giãn khí phế quản, có phổ kháng nấm khá rộng 2.Từ những ứng dụng quan trọng đó của EPMC, việc chiết xuất EPMC từ Địa liền là cần thiết nhằm phục vụ nhu cầu phòng và chữa bệnh của cộng đồng . Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “ Chiết xuất EPMC từ Địa liền” với mục tiêu: Khảo sát và so sánh được hiệu quả chiết xuất EPMC từ Địa liền bằng phương pháp cất kéo hơi nước và phương pháp Soxhlet.

1 Bộ môn Công Nghiệp Dược

2 Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia

HÀ NỘI – 2015

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian hoàn thành khóa luận này tại Bộ môn Công Nghiệp Dược

và Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc gia – Trường Đại học Dược Hà Nội , tôi

đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, ủng hộ, hướng dẫn của thầy cô, bạn bè và gia đình

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Công Nghiệp Dược và Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc gia đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian làm thực nghiệm

Tôi cũng xin gửi tới toàn thể giảng viên, cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội lời cảm ơn chân thành vì sự dạy bảo, dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường

Và cuối cùng, lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin được gửi tới:

TS Nguyễn Văn Hân – giảng viên Bộ môn Công Nghiêp Dược – Trường

Đại Học Dược Hà Nội đã nhiệt tình hướng dẫn, chỉ bảo, luôn nhắc nhở và bỏ qua những sai sót của tôi, giúp tôi tự tin hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Hà Nội, ngày 6 tháng 5 năm 2015 Sinh viên

Cao Thị Thương

DANH MỤC BẢNG BIỂU

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về cây Địa liền 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 3

1.1.3 Phân bố và sinh thái 3

1.1.4 Cách trồng 4

1.1.5 Bộ phận dùng 5

1.1.6 Thành phần hóa học 5

1.1.7 Tác dụng dược lí 6

1.1.8 Tính vị, công năng 7

1.1.9 Công dụng 7

1.2 Tổng quan về Ethyl-p-methoxycinnanat 8

1.2.1 Công thức hóa học, tính chất lý hóa 8

1.2.2 Công dụng của Ethyl-p-methoxycinnamat 9

1.2.3 Các phương pháp chiết xuất EPMC từ Địa liền 11

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị 13

2.1.3 Máy móc, thiết bị 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.2.1 Thu hái và xác định tên khoa học của cây 14

2.2.2 Khảo sát biến đổi hàm lượng EPMC trong quá trình làm khô liệu 14

2.2.3 So sánh các phương pháp chiết xuất EPMC từ thân rễ Địa liền 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Phương pháp xác định tên cây 116

2.3.2 Phương pháp chiết tinh dầu bằng cất kéo hơi nước 17

2.3.3 Chiết xuất trong thân rễ Địa liền bằng Soxhlet 18

2.3.4 Định lượng EPMC trong thân rễ Địa liền 19

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Xác định tên khoa học mẫu cây 21

3.2 Xác định hàm lượng EPMC trong dược liệu 22

3.3 Chiết xuất EPMC bằng cất kéo hơi nước 25

3.4 Chiết xuất EPMC bằng Soxhlet 28

3.5 So sánh các phương pháp chiết xuất 30

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

DĐVN : Dược điển Việt Nam

ESI-MS : Electro Spray Ionization - Mass spectrometry

(Khối phổ - Ion hóa bằng phương pháp phun mù điện tử) EPMC : Ethyl-p-methoxycinnamat

1

H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

IR : Infrared (Hồng ngoại)

MITF : Microphthalmia-associated transcription factor

(yếu tố chính phiên mã và kiểm soát biểu hiện của tyrosinase) α-MSH : α -melanocyte stimulating hormon

(enzym tổng hợp sắc tố da melamin) NMR : Nuclear magnetic resonanc

(Cộng hưởng từ hạt nhân) NSAIDs : Non-steroidal anti-inflammatory drugs

(Các thuốc chống viêm không steroid)TLC : Thin Layer Chromatography

(Sắc ký bản mỏng) UV-VIS : Ultraviolet –visible (Tử ngoại khả kiến)

Bảng 2.1 Danh mục các hóa chất dùng trong thí nghiệm 13 Bảng 3.1 Kết quả thu được khi đo 6 mẫu chuẩn 23 Bảng 3.2 Kết quả định lượng của mẫu tươi và mẫu khô 24 Bảng 3.3 Kết quả phân tích và so sánh 13C NMR và 1

H NMR 27 Bảng 3.4 Kết quả của phương pháp Soxhlet bằng 2 dung môi n-hexan và ethyl acetat 30 Bảng 3.5 Bảng so sánh các phương pháp nghiên cứu chiết xuất EPMC từ Địa liền 30

Hình 2.3 Bộ chiết Soxhlet 18

Hình 3.1 Mẫu cây tươi Địa liền 21

Hình 3.2 Đường chuẩn thể hiện mối liên quan tuyến tính 23

Hình 3.3 Công thức cấu tạo của EPMC 26

ĐẶT VẤN ĐỀ

 -

Nước Việt Nam ta được thiên nhiên ưu đãi với những cánh rừng nguyên

sinh chạy dọc đất nước Thống kê có hơn 5000 loại cây thuốc trong đó có nhiều cây có tiềm năng rất to lớn trong việc chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ nhân dân Trong hệ thống đa dạng và phong phú cây thuốc Nam, Địa liền được xem là một cây thuốc quý được dân gian, cộng đồng sử dụng nhiều để dùng chữa ngực bụng lạnh đau, tiêu chảy, thuốc kiện vị, giúp tiêu hóa chữa chứng ăn uống khó tiêu, đau dạ dày, cảm, ho, nôn mửa, hen suyễn và một số tác dụng khác [2]

Thân rễ Địa liền khô chứa 2,4 -3,9% tinh dầu Thành phần chủ yếu là acid p-methoxycinamic, ethyl cinamat và ethyl-p-methoxycinnamat [2] Trong

đó, ethyl p-methoxycinnamat (EPMC) chiếm chủ yếu và có nhiều tác dụng có ứng dụng lớn trong việc chữa bệnh và mỹ phẩm, nổi bật là tác dụng chống viêm tương tự non-steroidal anti-inflammatory drugs (các thuốc chống viêm không steroid) do ức chế cyclooxygendase và tác dụng làm trắng da [2],[8], chống nắng do ức chế enzyme tổng hợp sắc tố da melamin-tyrosinase và có khả năng hấp phụ UV-VIS [12] Ngoài ra, chất EPMC còn có tác dụng như một chất ức chế men monoaminoxydase, có thể dùng làm thuốc chữa trầm cảm, gây giãn khí phế quản, có phổ kháng nấm khá rộng [2]

Từ những ứng dụng quan trọng đó của EPMC, việc chiết xuất EPMC từ Địa liền là cần thiết nhằm phục vụ nhu cầu phòng và chữa bệnh của cộng đồng

Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “ Chiết xuất EPMC từ Địa liền” với mục tiêu:

Khảo sát và so sánh được hiệu quả chiết xuất EPMC từ Địa liền bằng phương pháp cất kéo hơi nước và phương pháp Soxhlet

Phân họ Phân họ Gừng (Zingiberoideae)

 Tên khoa học của vị thuốc: Rhizoma Kaempferia [3], [6]

 Tên đồng nghĩa: Kaempferia rotunda Ridl [3]

 Tên khác: sơn nại, tam nại, thiền liền, sa khương, faux galanga,

co xá choóng (Thái) [1], [3], [4], [5], [6]

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Cây thảo, sống lâu năm, không có thân Thân rễ gồm nhiều củ nhỏ, hình trứng mọc nối tiếp nhau, có nhiều vân ngang Lá, 2-3 cái hình trứng gần tròn, xòe rộng sát mặt đất, đầu tù rồi thuôn nhọn, gốc thuôn hẹp thành một cuống ngắn rộng có rãnh, mặt trên nhẵn bóng, mặt dưới hơi có lông mịn, mép lông màu đỏ, hai mặt có nhiều chấm hình vòng tròn, phiến lá dài 8-10 cm, rộng 6-7

cm [1], [6]

Cụm hoa không cuống, nằm ẩn trong bẻ lá; lá bắc hình mũi mác nhọn; hoa 6-12 cái, xếp thành hình bánh xe, màu trắng có đốm tím ở giữa; đài có 3 răng dài, hẹp và nhọn; tràng có ống dài, mang 3 thùy; nhị không có chỉ nhị, bao phấn có 2 ô song song; có nhị lép, cánh môi to chẻ đôi thành 2 thùy Toàn cây nhất là thân rễ có mùi thơm và vị nóng [1], [4], [6]

Mùa hoa quả: tháng 5-7 [1]

Tránh nhầm lẫn với cây Kaempferia angustifolia Roscoe mà nhân dân

Phú Thọ cũng gọi là Địa liền [2]

1.1.3 Phân bố và sinh thái

Chi Kaempferia L có 9-10 loài ở Việt Nam Loài Địa liền phân bố ở Ấn

Độ, Malaysia, Indonesia, Philippin, Thái Lan, Lào, Campuchia và Trung Quốc

Ở Việt Nam có, loài Địa liền lá hẹp mọc tự nhiên dưới các rừng thưa, rụng lá hoặc nựa rụng lá ở Đắc Lắc, Đồng Nai và ngoại thành thành phố Hồ Chí Minh Địa liền là cây vốn mọc tự nhiên ở Tây Nguyên, một số tỉnh miền núi như Hà Giang, Yên Bái, Sơn La Cây đã được trồng ở nhiều nơi vùng đồng bằng sông Hồng (Hưng Yên, Hải Dương, Bắc Ninh, Quảng Ninh, Bắc Giang ), Nghệ An

và Thanh Hóa Địa liền là cây ưa sáng, ưa ẩm và có khả năng chịu hạn Hằng năm, cây mọc lá non vào tháng 4-5, sinh trưởng nhanh trong mùa hè và sau đó

ra hoa Hoa nở mỗi ngày một cái vào lúc sáng sớm, rồi tàn lúc 10 giờ Địa liền

có khả năng đẻ nhánh khỏe Từ một củ con (mẫu thân rễ) lúc mới trồng, sau đó một năm đã tạo thành một khóm lớn Toàn bộ phần trên mặt đất tàn lụi vào mùa đông

Đầu những năm 90, các tỉnh phía Bắc trồng nhiều Địa liền để xuất khẩu Hiện nay, cây trồng chủ yếu cho nhu cầu sử dụng trong nước Nguồn Địa liền tự nhiên ở Tây Nguyên cũng cần được chú ý để tận thu [1]

1.1.4 Cách trồng

Địa liền là loại cây quen thuộc và được trồng ở khắp nơi để làm thuốc Thông thường, cây được trồng phân tán ở các vườn gia đình Gần đây, khi thị trường có nhu cầu, cây mới được trồng trên quy mô sản xuất Nông trường Hữu Nghị (Hoành Bồ - Quảng Ninh) và Trại nghiên cứu kỹ thuật trồng Địa liền

Cây được nhân giống bằng rễ củ Khả năng tái sinh của rễ củ Địa liền rất mạnh Chỉ cần một nhánh nhỏ cũng có thể mọc thành cây Tuy nhiên, để đảm bảo năng suất, cần chọn những nhánh củ chưa mọc thành cây, có đường kính 1,5-2 cm, không bị nhiễm bệnh, không dập nát

Địa liền trồng được trên nhiều loại đất, nhưng phải tơi xốp, cao ráo, thoát nước, đủ ánh sáng Cây hơi chịu bóng nên có thể trồng xen với các cây khác Ở các vườn gia đình, trong điều kiện bị che bóng một phần, cây vẫn sinh trưởng tốt Đất cần làm cho nhỏ, để ải, vơ sạch cỏ, bón phân lót, lên luống rồi trồng Củ Địa liền ăn nông trên mặt đất nên luống chỉ cần cao 20 - 30 cm Mặt luống rộng hay hẹp tùy theo việc chăm sóc Trung bình, mỗi hécta dùng 20 - 25 tấn phân chuồng hoai mục, 250 kg supe lân, 150 kg kali và có thể thêm 3 -5 tạ tro bếp để bón lót Riêng đối với kali bón lót một nửa và một nửa để bón thúc Phân có thể bón lót theo hốc, theo hàng hay trộn đều với đất trên mặt luống Mầm được trồng với mật độ 15×20 hoặc 20×20 (cm) phủ đất dày 1-2 cm, cho trấu hoặc rơm

rạ lên trên rồi tưới nước giữ ẩm hàng ngày Mỗi hecta cần 1,5- 2 tấn củ giống

Thời kì đầu, cần xới xáo nhẹ để giữ cho mặt luống thông thoáng Từ tháng 5 đến tháng 8, dùng nước phân, nước giải hoặc đạm pha loãng để bón thúc cho cây, cứ 25 - 30 ngày bón một lần

Địa liền ít bị sâu bệnh Tuy nhiên, cần đặc biệt lưu ý thoát nước sau mưa Cây bị úng dễ thối cả củ

Sau tháng mười hai, cây bắt đầu tàn lụi Lúc này có thể thu hoạch củ hoạch để đến tháng giêng Củ đào về, rửa sạch, thái nhỏ, sấy lưu huỳnh qua một đêm rồi phơi hoặc sấy nhẹ đến khô Năng suất củ tươi đạt trung bình 15- 20 tấn/ha Tỷ lệ tươi/ khô dao động trong khoảng 3,5- 4 [1]

, 30D 14773- 14855

Ngoài ra, thân rễ còn có các hợp chất n- pentadecan, A3 – caren, o- methoxy ethylcinamat, borneol, p-methoxystyren, acid transcinamic, aldehyd cinamic, cineol, kaempferol và kaempferid, monotepen keton: 3-caren-5-on, carvon, eucalyptol [1]

1.1.7 Tác dụng dược lí

- Tác dụng hạ Giảm đau

Trên mô hình gây đau nội tạng bằng cách tiêm dung dịch acid acetic 0,6% vào xoang bụng chuột nhắt trắng để tạo nên những cơn đau quặn, Địa liền dùng với liều 5g/kg thể trọng, bằng đường uống, một giờ sau khi dùng thuốc làm giảm 69% số lần xuất hiện cơn đau Còn trên mô hình gây đau bằng sức nóng, Địa liền không thể hiện tác dụng giảm đau kiểu morphin [1]

- Tác dụng chống viêm

Trên mô hình gây phù bàn chân chuột cống trắng bằng cách tiêm nhũ dịch kaolin 10%, Địa liền có tác dụng chống viêm rõ rệt, dạng cao cồn với liều 10g/kg thể trọng ức chế viêm 63,8%, dạng cao nước với liều 10g/kg thể trọng cũng ức chế viêm 60% Tinh dầu và dạng tinh thể chiết từ Địa liền cũng có tác dụng chống viêm tương tự [1]

“Kapurkachari” là một loại thuốc Ayurvedic (thảo dược Ấn Độ) nổi tiếng với việc điều trị các bệnh khác nhau như ho, viêm loét, Ngoài ra, chúng còn được sử dụng để chữa đầy hơi, chướng bụng và dùng làm mỹ phẩm, bao gồm

thân rễ của ba cây cụ thể là: Hedychium spicatum Buch Ham ex Smith., Kaempferia galanga Linn và Curcuma zedoaria Rosc (nghệ đen) Tất cả ba

cây trên đều thuộc một phân lớp Scitaminae, họ Zingiberaceae Tất cả các cây này đều chứa các loại tinh dầu, nhựa, tinh bột như phytoconsituents Trong số

ba cây, hoạt động chống viêm của hedychium spicatum được nghiên cứu chi tiết hơn cả Trong khi hai cây khác cũng được bán tại các thị trường dưới tên thương mại, người ta nghĩ đến việc đánh giá để xác định hiệu quả chống viêm

của các loại thuốc Thí nghiệm đã chứng tỏ rằng dịch chiết ethanol của tất cả ba thân rễ ức chế sự hình thành phù nề chân có ý nghĩa trong điều trị cấp với tác

nhân carageenan gây phù nề ở chuột Hedychium spicatum ức chế 55,54%, Kaempferia galanga 50,98% trong khi Curcuma zedoaria là 39,78% Kết quả

cho thấy rằng, dịch chiết ethanol của Kapurkachari có khả năng kháng viêm mạnh, có thể ức chế đợt viêm cấp tính ở chân chuột gây ra bởi carageenan [8]

- Tác dụng hạ sốt

Trên thỏ gây sốt thực nghiệm bằng pyrogen chuẩn (natri nucleinat) Địa liền với liều 5g/kg bằng đường uống, 2 giờ sau khi dùng thuốc, làm hạ sốt 0,4 – 0,50C so với lô đối chứng

Theo tài liệu nước ngoài, Địa liền còn có một số tác dụng khác.Trên ống nghiệm, nước sắc thân rễ có tác dụng ức chế sự phát triển của một số nấm thường gây bệnh ngoài da; chất EPMC có phổ kháng nấm khá rộng Cao chiết bằng cloroform từ thân rễ trên ống kính có tác dụng ức chế co thắt giải động mạch chủ chuột cống trắng gây nên do K+ hoặc do phenylephrin Thí nghiệm trên chuột lang, chất EPMC gây giãn khí phế quản, chứng tỏ việc sự dụng Địa liền trong điều trị bệnh hen suyễn là có cơ sở Chất EPMC còn có tác dụng như một chất ức chế men MAO, có thể dùng làm thuốc chữa trầm cảm

Cao chiết bằng ethanol từ Địa liền có tác dụng độc tế bào đối với tế bào carcinom cổ tử cung (Hela) và diệt amip Các thành phần ethyl cinnamat, p- methoxy cinnamat và acid p-methoxy cinnamic, có tác dụng diệt dòi bọ Borneol

có tác dụng làm ra mồ hôi, gây hưng phấn, giải co thắt [1]

1.1.8 Tính vị, công năng

Theo tài liệu cổ, Địa liền có vị cay, tính ôn, vào các kinh tâm, tỳ, vị, có tác dụng ôn trung, tán hàn, trừ thấp, tiêu thực, bạt khí độc [1]

1.1.9 Công dụng

Theo kinh nghiệm dân gian, Địa liền được dùng chữa ngực bụng lạnh đau, tiêu chảy, thuốc kiện vị, giúp tiêu hóa chữa chứng ăn uống khó tiêu, đau dạ dày,

cảm, ho, nôn mửa, hen suyễn

Liều dùng: ngày 3-6 g dưới dạng thuốc sắc, thuốc bột, thuốc viên, thuốc

hãm [1] Rượu Địa liền (ngâm củ Địa liền trong rượu 40 – 500

, trong 5 – 7 ngày)

có thể dùng xoa bóp hoặc uống làm bớt nhức mỏi gân cốt, đau lưng và làm cho máu huyết thông hoạt Cũng dùng trị nhức đầu và phù thũng Nước chiết củ dùng trị ho, làm bớt hôi miệng, làm cao dán trị nhức mỏi Lá và củ cũng dùng ngậm cho bớt ho và làm hết hôi miệng Rễ còn dùng chế mỡ xức tóc cho thơm [6]

Ngoài ra, tinh dầu Địa liền để chế nước hoa, mỹ phẩm, làm vị điều hương trong thực phẩm Bột Địa liền có tác dụng bảo vệ quần áo chống nhậy cắn

Ở Philippin, nước sắc Địa liền chữa ăn uống khó tiêu, sốt rét Lá Địa liền giã nát hơ nóng, đắp chữa tê thấp Ở Malaysia, thân rễ Địa liền được dùng chữa cao huyết áp, lở loét, hen suyễn Lá và thân rễ nhai ngậm chữa ho và đau họng Thân rễ dùng riêng chữa cảm lạnh Một vài nơi dùng lá và thân rễ Địa liền làm rau ăn sống [1]

1.2 Tổng quan về Ethyl–p-methoxycinnanat

1.2.1 Công thức hóa học, tính chất lý hóa

Công thức cấu tạo:

Danh pháp hóa học: ethyl-3-(4-methoxyphenyl)-2-propenoat; methoxycinnamat; ethyl-4-methoxycinnamat; ethyl-p-methoxycinnamat; (E)-3-(4-methoxyphenyl)-2-propenoic acidethyl ester; 3-(4'-methoxyphenyl)-(E)-

ethyl(E)-4-propenoic acid ethyl ester; (E)-3-(4-methoxyphenyl) ethyl(E)-4-propenoic acid ethyl ester

Tên IUPAC: ethyl 3-(4-methoxyphenyl)-2-propenoat

Tỷ trọng: 1,205g/cm3 [14]

Nhiệt độ nóng chảy: 48 - 500

C [15], 39,350C [14]

1.2.2 Tác dụng của Ethyl-p-methoxycinnamat

EPMC có nhiều tác dụng đã và đang được nghiên cứu và chứng minh:

- Gây độc cho tế bào gây bệnh bạch cầu promyelocytic HL-60 ở người với IC50= 35,69 μmol/l, gây độc cho tế bào gây bệnh bạch cầu cấp tính monocytic THP-1 ở người với IC50 = 41.23 μmol/l, tế bào u ác tính A375 ở người IC50 = 31.59 μmol/l, tế bào gây ung thư phổi A-549 ở người với IC50 = 50.35 μmol/l [17], [9]

- Ức chế 1 số loại nấm: Candida albicans [21], Trichophyton rubum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum gypseum…[9]; vi khuẩn: Mycobacterium tuberculosi…[13]

- Ức chế 1 số loại enzym: COX1, COX2 [21], MAO [16], nấm men bánh

mì α-glucosidase…[7]

- Ức chế tổng hợp melamin do ức chế enzym tổng hợp sắc tố da melamin: α-melanocyte stimulating hormon (α-MSH), tyrosinase Ngoài ra, EPMC cấu tạo hóa học có chứa nhân thơm và nối đôi dễ bị oxy hóa có khả năng hấp thụ UV-VIS Vì vậy, EPMC là thành phần hay được sử dụng trong kem chống nắng và làm trắng da [22], [12], [9]

- Cảm ứng enzym gan cytP450s: CYP1A và CYP2B [19]

Trong đó, nổi bật là tác dụng chống viêm tương tự NSAIDs do ức chế COX và tác dụng làm trắng da, chống nắng do ức chế enzym tổng hợp sắc tố da melamin – tyrosinase và có khả năng hấp phụ UV-VIS

Trong một nghiên cứu invitro chống viêm, EPMC đã được tìm thấy để ức chế cả COX-1 và COX-2 không chọn lọc Tuy nhiên, sự ức chế COX-2 là rõ rệt hơn (57,82%) so với COX-1 (42,9%) Indomethacin là một chất ức chế COX không chọn lọc, chống viêm bằng cách ức chế cả COX-1 và COX-2 Tuy nhiên, indomethacin đã được ghi nhận là có tác dụng ức chế trên COX-1 là tương đối mạnh và sâu sắc hơn tác động của nó trên COX-2 Ví dụ, trong một nghiên cứu trước đây, IC50 của indomethacin đã được tìm thấy là 18 ± 3 nM cho COX-1 và

26 ± 6 nM cho COX-2 Indomethacin cho thấy xu hướng tương tự trong ức chế COX-1 và COX-2 trong điều kiện thử nghiệm với sự ức chế mạnh hơn của COX-1 (82,8%) so với COX-2 (54,6%) Ngoài các prostaglandin gây viêm, COX-1 có vai trò trong tổng hợp những prostaglandin cần thiết cho việc duy trì tính toàn vẹn của niêm mạc dạ dày và ruột Sự ức chế cao hơn của COX-1 làm tăng nguy cơ gây viêm loét dạ dày và các biến chứng liên quan của một số thuốc Theo các kết quả ức chế COX-2 bởi EPMC trong bài bào này, theo các

điều kiện tương tự, là tốt hơn so với indomethacin, trong khi sự ức chế COX-1 bởi EPMC (42,9%) cũng đã ít hơn bởi indomethacin (82,8%) Thay thế indomethacin bằng EPMC, cho thấy EPMC có lợi thế hơn indomethacin, trong điều trị viêm, đặc biệt ở bệnh nhân loét dạ dày [20]

Cơ chế ức chế sự tổng hợp melamin của EPMC: trong một hệ thống tế bào tự do, EPMC không có tác dụng trực tiếp trên hoạt động oxy hóa của enzym tyrosinase, trong khi axit kojic ức chế đáng kể hoạt động tyrosinase Tuy nhiên, EPMC ức chế hoạt động tyrosinase trong B16F10- tế bào hắc tố phụ thuộc liều

Do đó, phân tích được thực hiện để kiểm tra ảnh hưởng của EPMC trên Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) là yếu tố chính phiên

mã và kiểm soát biểu hiện của tyrosinase Điều trị bằng 25 mg/ml ethyl methoxycinnamat trong 24 giờ giảm đáng kể mức MITF và tyrosinase trong tế bào α-MSH-stimulated B16F10 [12]

p-1.2.3 Các phương pháp chiết xuất EPMC từ Địa liền

Một số phương pháp chiết EPMC từ Địa liền được sử dụng trong các nghiên cứu thử nghiệm về tác dụng dược lí của EPMC cũng như Địa liền Sau đây là một số phương pháp và kết quả

- Chiết bằng dung môi:

Theo Huyn Ju Ko (2014), thí nghiệm được tiến hành như sau: xay Địa liền, cân nguyên liệu khô (2,5 kg) chiết xuất với ethanol 100% trong hơn một ngày, lọc, lặp lại sáu lần Gộp dịch thu được và cô quay chân không được dịch chiết ethanol (109 g) Sau đó, dịch chiết được phân tán trong nước và chiết bằng chloroform tạo phần không phân cực Làm lạnh phần không phân cực này hình thành tinh thể được xác định là một hợp chất duy nhất (49 g) Từ phân tích cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) cho thấy các cấu trúc hóa học của hợp chất là EPMC Hiệu suất quá trình chiết và phân lập này là gần 1,96% [12]

Còn theo Wanna S (2011), quá trình thực hiện như sau: bột thân rễ khô

của K galanga L ngâm với dichloromethan (1 kg/ 2,5 lít) trong 7 ngày Sau đó

lọc qua giấy lọc Whatman 1, bốc hơi dung môi bằng máy cô quay (Eyela,

SB-1000, Nhật Bản) Được dịch chiết xuất dichloromethan của K galanga L (DEK) màu nâu thạch được bảo quản ở 40C đến khi sử dụng Để có được hợp chất EPMC, DEK được sắc ký cột silica gel (70-230 mesh) và tách rửa với gradient dichloromethan: hexan (70:30 đến 95:5) Các phần tách rửa được thu thập và kiểm tra bởi TLC (silica gel, GF 254) với dung môi là dichloromethan: hexan (95:5) Các đoạn có chứa EPMC được gộp chung và sấy khô Độ tinh khiết của EPMC được kiểm tra bằng cách sử dụng phương pháp HPLC như sau; HPLC (Agilent 1100 series và UV-VWD, Agilent Nhật Bản), sử dụng hệ dung môi, acetronitril: methanol: 20 mM NaH2PO4 (30:40:30 v / v / v) với tốc độ dòng chảy 1ml/phút, 5micron, 4.6x250mm (Agilent, Đức) và cột bảo vệ, μBondpack

10 micromet C18 (nước, U.S.A.) Tại bước sóng UV 270 nm DEK đã cho thấy đỉnh lớn có chứa 80 mg% EPMC [19]

- Cất kéo tinh dầu bằng hơi nước:

Phương pháp này được Luger P thực hiện năm 1996 có nội dung sau Các cây được thu hoạch vào tháng mười năm 1994, tại Đắc Lắc, Việt Nam Cất kéo tinh dầu bằng hơi nước từ thân rễ tươi trong 6 giờ với thiết bị, dụng cụ thủy tinh (hàm lượng dầu 3,1%) Tinh dầu hòa tan được cả trong chloroform và ethanol Dung dịch chloroform giữ tại nhiệt độ 277-2790

K (4- 60C) từ đó EPMC kết tinh Trong ethanol cho tinh thể hình đĩa không màu (mp 322,50

K- 49,50C) Các sắc ký khí cho thấy tinh dầu thân rễ có chứa khoảng 66% EPMC [14]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Thân rễ Địa liền được thu hái ở xã Ngọc Sơn, huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc

Giang, thu hoạch vào tháng 12 năm 2014, được rửa sạch

2.1.2 Hóa chất

Bảng 2.1 Danh mục các hóa chất dùng trong thí nghiệm

2.1.3 Máy móc, thiết bị

Máy móc

- Máy cất quay chân không Büchi B-490 và R-220 (Thụy Sỹ)

- Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S (Thụy Sỹ)

- Cân kỹ thuật điện tử Sartorius BP 20015 (Đức)

- Tủ sấy MEMMERT (Đức)

- Mao quản chính xác 5 microlit

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Thu hái và xác định tên khoa học của cây

Mẫu cây được lấy ở xã Ngọc Sơn, huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang

Mô tả mẫu: Mẫu gồm cây tươi mang lá

Quá trình giám định tại bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội xác định tên khoa học của mẫu cây

2.2.2 Khảo sát biến đổi hàm lượng EPMC trong quá trình làm khô liệu

Để kiểm tra sự biến đổi về khối lượng khi sấy, từ dược liệu tươi thành dược liệu khô Cân dược liệu tươi, sấy, cân lại, và xác định khối lượng

Đồng thời với việc kiểm tra biến đổi về khối lượng, ta còn xét thêm sự biến đổi về hàm lượng EPMC trong thân rễ Địa liền từ tươi thành khô Định lượng EPMC trong thân rễ Địa liền tươi và khô bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC, xây dựng đường chuẩn và xác định được khoảng tuyến tính phù hợp

để xác định chính xác hàm lượng của 2 mẫu thử tươi và khô

2.2.3 So sánh các phương pháp chiết xuất EPMC từ thân rễ Địa liền

Ta thực hiện 2 phương pháp để chiết xuất EPMC là cất kéo hơi nước và chiết Soxhlet với dung môi là n-hexan và ethyl acetat Từ kết quả thực nghiệm,

ta xác định hiệu suất EPMC thu được của từng phương pháp So sánh ưu, nhược, đánh giá các phương pháp

Xác định một số tính chất của sản phẩm: điểm chảy, phổ IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối MS

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Từ những nghiên cứu đã được thực hiện, chúng tôi đã xây dựng phương pháp chiết xuất EPMC theo sơ đồ hình 2.1:

Phương pháp Phương pháp Soxhlet

Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xác định tên cây

Để xác định được tên khoa học của cây, ta tiến hành thu hái mẫu cây tươi

tại tại xã Ngọc Sơn, huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang Mẫu cây thu hái tốt nhất

là có đầy đủ: lá, hoa, quả (nếu có) Tuy nhiên do điều kiện thực nghiệm, chúng

tôi chỉ tìm được mẫu gồm cây tươi mang lá Lấy nguyên liệu để làm thực

nghiệm

Phương pháp xác định tên khoa học của mẫu cây: Căn cứ vào các tài liệu

có tại trường đại học Dược Hà Nội (bao gồm: Cây cỏ Việt Nam - Phạm Hoàng

Bột Địa liền

Hỗn hợp

EPMC

Củ Địa liền

Định lượng EPMC

Kiểm nghiệm Kết tinh lại

Hộ, tập 3; Từ điển thực vật thông dụng – Võ Văn Chi, tập 2; Flora of China,

Vol 24) và các mẫu lưu tại phòng tiêu bản Herbier Muséum Paris – Muséum National d’ Histoire Naturelle (P) với các đặc điểm của các bộ phận mẫu cây, để xác định mẫu cây Quá trình xác định được thực hiện tại Bộ môn thực vật, trường đại học Dược Hà Nội Được tiến hành bởi Ths Nghiêm Đức Trọng

2.3.2 Phương pháp chiết tinh dầu bằng cất kéo hơi nước

- Xử lý dược liệu, cân dược liệu

- Lắp bộ cất, cất tinh dầu bằng hơi nước

- Xử lý hỗn hợp tinh dầu thu được

- Kết tinh dịch vừa xử lý, lọc thu tủa, xác định khối lượng tủa thu được

- Xác định phổ, nhiệt độ nóng chảy chất thu được

Hình 2.2 Bộ cất tinh dầu bằng cất kéo hơi nước

6 Bếp đun

7 Nhiệt kế

8 Sừng bò

2.3.3 Chiết xuất EPMC từ thân rễ Địa liền bằng Soxhlet

- Xử lí dƣợc liệu, cân dƣợc liệu, chuẩn bị dung môi

- Lắp bộ Soxhlet, chiết EPMC từ dƣợc liệu khô

- Cô dịch chiết bằng máy cô quay

- Kết tinh dịch cô trong dung môi chiết với thể tích thích hợp

- Lọc thu tủa, xác định khối lƣợng tủa thô, định tính chất thu đƣợc

- Rửa tạp, kết tinh lại

- Xác định khối lƣợng sau kết tinh

- Đo nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm

Hình 2.3 Bộ chiết Soxhlet

2.3.4 Định lượng EPMC trong thân rễ Địa liền

Định lượng EPMC trong thân rễ Địa liền bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, cách tiến hành như sau:

Bản mỏng: silica gel 60F254

Hệ dung môi: Aceton – n-Hexan (20:80)

Dung dịch thử:

Mẫu thử là dược liệu tươi: Nghiền củ Địa liền tươi thành bột nhão Cân 2

g bột nhão cho vào bình định mức 10 ml Thêm 5 ml ethanol 96%, siêu âm 15 phút Thêm ethanol 96% đến vạch, lắc kỹ Lọc qua giấy lọc, lấy dịch trong để chấm sắc ký

Mẫu thử là dược liệu khô: Cân lượng 456,6 mg bột dược liệu (tương

đương với 2 g dược liệu tươi), cho vào bình định mức 10 ml Thêm 5 ml ethanol 96%, siêu âm 15 phút Thêm ethanol 96% đến vạch, lắc kỹ Lọc qua giấy lọc, lấy dịch trong chấm sắc ký

Dung dịch chuẩn: cân chính xác 20,0 mg EPMC chuẩn, hòa tan trong

bình định mức 10 ml bằng ethanol 96%

EPMC chuẩn là sản phẩm tự tinh chế và sơ bộ chứng minh độ tinh khiết bằng SKLM và các dữ liệu phổ 1

H-NMR và 13C-NMR

Bản mỏng silica gel 60F 254 (10 cm×10 cm) đã được hoạt hóa ở 110°C

trong 2 giờ được chia vạch thành 6 băng, chấm lần lượt mỗi băng 10 microlit dung dịch chuẩn từ bình 1 (băng 1) đến bình 6 (băng 6) chấm thành vạch dài 1cm, rộng 0,5 cm

Thuốc thử hiện màu: Dùng thuốc thử Ceri sulfat (pha theo DĐVN IV)

Tiến hành sắc ký: sau khi triển khai sắc ký đến khi dung môi chạy được 9

cm, lấy bản mỏng ra, sấy nhẹ trong tủ sấy để bay dung môi Phun thuốc thử hiện màu đều cả bản mỏng, sấy bản mỏng trong tủ sấy ở nhiệt độ 900

C, sau khoảng

20 phút, các vết EPMC sẽ hiện màu Đưa bản mỏng đã hiện vết vào máy soi vết, dùng đèn bước sóng 366 nm ta thu được các sắc ký đồ của vết chuẩn Từ kết quả của các diện tích Pic của mẫu chuẩn xây dựng đường chuẩn, tính được nồng độ trong dung dịch mẫu thử

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Xác định tên khoa học mẫu cây

Sau khi thực hiện quá trình giám định mẫu cây:

Nơi thu mẫu: Xã Ngọc Sơn, huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang

Mô tả mẫu: Mẫu gồm cây tươi mang lá

Hình 3.1 Mẫu cây tươi Địa liền

Kết quả giám định: Căn cứ vào các tài liệu có tại trường đại học Dược Hà

Nội (bao gồm: Cây cỏ Việt Nam - Phạm Hoàng Hộ, tập 3; Từ điển thực vật thông dụng – Võ Văn Chi, tập 2; Flora of China, Vol 24) và các mẫu lưu tại

phòng tiêu bản Herbier Muséum Paris – Muséum National d’ Histoire Naturelle (P) với các đặc điểm của các bộ phận mẫu cây, để xác định mẫu trên có:

- Tên khoa học: Kaempferia galanga L

- Họ: Zingiberaceae

- Tên thường gọi: Địa liền

3.2 Xác định hàm lượng EPMC trong dược liệu

- Tỷ lệ khối lượng khô/ tươi

Cách tiến hành: Cân dược liệu tươi: 1000,06 g Sấy trong 24 giờ ở nhiệt

độ 49 – 500

C Do nhiệt độ nóng chảy của EPMC khá thấp: 47 – 500C, có khả năng bay hơi cùng hơi nước Vì vậy phải sấy dược liệu ở nhiệt thấp < 500C để đảm bảo không bị giảm hàm lượng một cách tối đa do nhiệt

Khối lượng dược liệu tươi và dược liệu khô thu được tương ứng là 1000,06 g và 228, 32 g

Tỉ lệ khối lượng khô/ tươi =

= = Như vậy, từ dược liệu Địa liền tươi thành dược liệu khô giảm 4,38 lần

1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml Thêm Ethanol 96% tới vạch định mức của các bình Dùng các dung dịch thu được để chấm sắc ký của mẫu chuẩn (dung dịch chuẩn dùng trong ngày) Tiến hành sắc ký tương tự mục 2.3.4

Bảng 3.1 Kết quả thu được khi đo 6 mẫu chuẩn

Hình 3.2 Đường chuẩn thể hiện mối liên quan tuyến tính

giữa lượng chất và diện tích pic

y = 2675.1x + 2274.6 R² = 0.9849

0 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000 35,000 40,000

Lƣợng chất trên pic mcg