Nghiên cứu chiết xuất Methoxyflavon của thân rễ địa liền đen ( Kaenmpferia Wall.ex Baker), họ Gừng (Zingiberaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HÀ VĂN HUÂN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT METHOXYFLAVON CỦA THÂN RỄ ĐỊA LIỀN ĐEN (Kaempferia parviflora Wall ex Baker), họ Gừng (Zingiberaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HÀ VĂN HUÂN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT METHOXYFLAVON CỦA THÂN RỄ ĐỊA LIỀN ĐEN (Kaempferia parviflora Wall ex Baker), họ Gừng (Zingiberaceae) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯƠC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đỗ Quyên HÀ NỘI 2019 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tơi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Đỗ Quyên người hướng dẫn tạo điều kiện cho tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô môn Dược Liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội tận tình giảng dạy, truyền đạt tri thức giúp tơi áp dụng vào thực nghiệm để hoàn thiện luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến ThS Phạm Tuấn Anh anh chị kỹ thuật viên - môn Dược Liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội, em sinh viên K69 nghiên cứu khoa học môn Dược Liệu - Trường Đại Học Dược Hà Nội hỗ trợ phối hợp với tơi q trình thực Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Ds Hà Văn Huân MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT…………………………… ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Vị trí, đặc điểm thực vật phân bố loài Kaempferia parviflora Wall.ex Baker 1.2 Thành phần hóa học 1.3 Tác dụng sinh học 1.4 phương pháp chiết xuất methoxyflavon thân rễ Địa liền đen (Kaempferia parviflora Wall.ex Baker) 10 1.5 Phương pháp định lượng methoxyflavon thân rễ Địa liền đen (Kaempferia parviflora Wall.ex Baker) 10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên liệu phương tiện nghiên cứu 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .23 3.1 Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc 2-3 hợp chất methoxyflavon từ thân rễ Địa liền đen (Kaempferia parviflora Wall ex Baker) 23 3.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất methoxyflavon 30 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN .45 4.1 Về chiết xuất, phân lập 2-3 hợp chất methoxyflavon thân rễ Địa liền đen 45 4.2 Xây dựng quy trình định lượng methoxyflavon thân rễ Địa liền đen phương pháp HPLC 46 4.3 Về xác định số yếu tố ảnh hưởng chiết xuất methoxyflavon thân rễ Địa liền đen 48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………… PHỤ LỤC……………………………………………………………………… DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các methoxyflavon phân lập từ thân rễ Địa liền đen Bảng 1.3 Các điều kiện định lượng methoxyflavon thân rễ Địa liền đen HPLC .12 Bảng 2.1 Các thí nghiệm chiết xuất methoxyflavon thân rễ Địa liền đen21 Bảng 3.1 Bảng số liệu phổ NMR KP1, KP2 KP5 29 Bảng 3.2 Chương trình gradient pha động theo chương trình sắc ký 30 Bảng 3.3 Chương trình gradient pha động theo chương trình sắc ký 31 Bảng 3.4 Chương trình gradient pha động theo chương trình sắc ký 32 Bảng 3.5 Chương trình gradient pha động chương trình sắc ký sử dụng phân tích 35 Bảng 3.6 Thời gian lưu mẫu thẩm định độ đặc hiệu 35 Bảng 3.7 Thời gian lưu diện tích pic chất chuẩn (1); (2) thẩm định tiêu độ phù hợp hệ thống 36 Bảng 3.8 Kết khảo sát độ phương pháp định lượng .39 Bảng 3.9 kết hàm lượng methoxyflavon thân rễ Địa liền đen theo chất chuẩn (1); (2) 41 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức hóa học chung flavon Địa liền đen Hình 1.2 Cấu trúc chung số flavonoid khác Bảng 1.2 Cấu trúc số flavonoid thân rễ địa liền đen Hình 2.1 Mẫu nghiên cứu Địa liền đen 14 Hình 3.1 Sắc ký lớp mỏng Địa liền đen chất chuẩn .23 Hình 3.2 Cấu trúc hợp chất 5-hydroxy-7-methoxyflavon .26 Hình 3.3 phổ 'H-NMR hợp chất KP2 .27 Hình 3.4 Cấu trúc hợp chất 3,5,7-trimethoxyflavon 27 Hình 3.5 phổ 'H-NMR hợp chất KP5 .28 Hình 3.6 Cấu trúc hợp chất 3,5,7,4’-tetramethoxyflavon 29 Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu chứa chất chuẩn theo chương trình sắc ký 30 Hình 3.8 Sắc ký đồ chất chuẩn theo chương trình sắc ký 31 Hình 3.9 Sắc ký đồ chất chuẩn (1), (2) theo chương trình sắc ký 32 Hình 3.10 Sắc ký đồ chất chuẩn 3,5,7-trimethoxyflavon (1) theo chương trình sắc ký 33 Hình 3.11 Sắc ký đồ chất chuẩn 3,5,7,4’-tetramethoxyflavon (2) theo chương trình sắc ký .33 Hình 3.12 Sắc ký đồ dịch chiết thân rễ Địa liền đen theo chương trình sắc ký 34 Hình 3.13 sắc ký đồ độ đặc hiệu 36 Hình 3.14 đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích pic nồng độ chất chuẩn 3,5,7-trimethoxyflavon (1) 38 Hình 3.15 đồ thị biểu diễn mối tương quan diện tích pic nồng độ chất chuẩn 3,5,7,4’-tetramethoxyflavon (2) 38 Hình 3.16 kết phân tích điều kiện tối ưu phần mềm modde 42 Hình 3.17 Đồ thị biểu diễn yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết xuất methoxyflavon thân rễ Địa liền đen 43 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT H-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton C-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon I3 ACN: Acetonitril d: Tín hiệu duplet DMF: 5,7- dimethoxyflavon EtOH: Ethanol EOAC: Ethyl acetat TMF: 5,7,4'-trimethoxyflavon PMF: 3,5,7,3’,4’- pentamethoxyflavon HPLC: sắc ký lỏng hiệu cao J: Đại lượng tương tác spin spin RSM: Phương pháp bề mặt đáp ứng s: Tín hiệu singlet δ: Độ dịch chuyển hóa học ĐẶT VẤN ĐỀ Chi Địa liền (Kaempferia L.) chi thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), có khoảng 100 loài, phân bố chủ yếu Trung Quốc, Ấn độ nước Đông Nam Á Ở Việt Nam, có 9-10 lồi thuộc chi Kaempferia L [4] Trước phát Địa liền đen (Kaempferia parviflora Wall ex Baker) có mặt Việt Nam, nguồn dược liệu chủ yếu nhập từ Thái Lan Lào Địa liền đen vị thuốc quý y học cổ truyền Thái Lan với nhiều công dụng như: tăng cường sinh dục nam, rối loạn tiêu hóa, thuốc bổ [35], [37], [38] Cho đến Địa liền đen (Kaempferia parviflora Wall ex Baker) chưa ghi nhận danh lục Thực vật Việt Nam Trong giai đoạn 2014 – 2016, nghiên cứu phân loại thực vật thuộc họ Gừng miền Trung Việt Nam phát loài Địa liền đen (Kaempferia parvifolia Wall ex Baker) xã Yang Mao, huyện Krông Bông, tỉnh Đắk Lắk [3] Nhận thấy thuốc quý, số tỉnh phía Bắc Việt Nam giáp biên giới với Lào trồng Địa liền đen Thanh Hóa, Lai Châu, Sơn La Mặt khác, nhiều nhà khoa học Thái Lan Nhật Bản nghiên cứu Địa liền đen theo hướng tăng lực, tăng cường chức sinh dục nam, hạ lipid máu [10], [30] cho thấy tác dụng có liên quan đến thành phần methoxyflavon Địa liền đen Chính vậy, chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chiết xuất methoxyflavon thân rễ Địa liền đen (Kaempferia parviflora Wall.ex Baker)” Việt Nam với mục tiêu sau:  Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc số hợp chất methoxyflavon từ thân rễ Địa liền đen  Xác định số yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất methoxyflavon từ thân rễ Địa liền đen PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT CHƯƠNG TRÌNH PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT CHƯƠNG TRÌNH PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ MẪU CHUẨN PHỤ LỤC 10 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ PHÙ HỢP HỆ THỐNG PHỤ LỤC 10 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ PHÙ HỢP HỆ THỐNG PHỤ LỤC 10 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ PHÙ HỢP HỆ THỐNG PHỤ LỤC 10 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ PHÙ HỢP HỆ THỐNG PHỤ LỤC 10 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ PHÙ HỢP HỆ THỐNG PHỤ LỤC 10 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ PHÙ HỢP HỆ THỐNG PHỤ LỤC 11 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ ĐẶC HIỆU PHỤ LỤC 11 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ ĐẶC HIỆU PHỤ LỤC 11 SẮC KÝ ĐỒ ĐỘ ĐẶC HIỆU PHỤ LỤC 12 SẮC KÝ ĐỒ MỘT SỐ MẪU CAO PHỤ LỤC 12 SẮC KÝ ĐỒ MỘT SỐ MẪU CAO PHỤ LỤC 12 SẮC KÝ ĐỒ MỘT SỐ MẪU CAO