- Xử lý dƣợc liệu, cân dƣợc liệu
- Lắp bộ cất, cất tinh dầu bằng hơi nƣớc - Xử lý hỗn hợp tinh dầu thu đƣợc
- Kết tinh dịch vừa xử lý, lọc thu tủa, xác định khối lƣợng tủa thu đƣợc - Xác định phổ, nhiệt độ nóng chảy chất thu đƣợc.
Hình 2.2 Bộ cất tinh dầu bằng cất kéo hơi nước
1. Bình cất dung dịch: bình cầu 2000 ml 2. Bầu bảo hiểm
3 Ống sinh hàn 4. Bình hứng 500 ml
6. Bếp đun 7. Nhiệt kế 8. Sừng bò
2.3.3 Chiết xuất EPMC từ thân rễ Địa liền bằng Soxhlet
- Xử lí dƣợc liệu, cân dƣợc liệu, chuẩn bị dung môi - Lắp bộ Soxhlet, chiết EPMC từ dƣợc liệu khô - Cô dịch chiết bằng máy cô quay
- Kết tinh dịch cô trong dung môi chiết với thể tích thích hợp - Lọc thu tủa, xác định khối lƣợng tủa thô, định tính chất thu đƣợc - Rửa tạp, kết tinh lại
- Xác định khối lƣợng sau kết tinh - Đo nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm.
2.3.4 Định lượng EPMC trong thân rễ Địa liền
Định lƣợng EPMC trong thân rễ Địa liền bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng, cách tiến hành nhƣ sau:
Bản mỏng: silica gel 60F254
Hệ dung môi: Aceton – n-Hexan (20:80)
Dung dịch thử:
Mẫu thử là dược liệu tươi: Nghiền củ Địa liền tƣơi thành bột nhão. Cân 2 g bột nhão cho vào bình định mức 10 ml. Thêm 5 ml ethanol 96%, siêu âm 15 phút. Thêm ethanol 96% đến vạch, lắc kỹ. Lọc qua giấy lọc, lấy dịch trong để chấm sắc ký.
Mẫu thử là dược liệu khô: Cân lƣợng 456,6 mg bột dƣợc liệu (tƣơng đƣơng với 2 g dƣợc liệu tƣơi), cho vào bình định mức 10 ml. Thêm 5 ml ethanol 96%, siêu âm 15 phút. Thêm ethanol 96% đến vạch, lắc kỹ. Lọc qua giấy lọc, lấy dịch trong chấm sắc ký.
Dung dịch chuẩn: cân chính xác 20,0 mg EPMC chuẩn, hòa tan trong bình định mức 10 ml bằng ethanol 96%.
EPMC chuẩn là sản phẩm tự tinh chế và sơ bộ chứng minh độ tinh khiết bằng SKLM và các dữ liệu phổ 1
H-NMR và 13C-NMR.
Bản mỏng silica gel 60F254 (10 cm×10 cm) đã đƣợc hoạt hóa ở 110°C
trong 2 giờ đƣợc chia vạch thành 6 băng, chấm lần lƣợt mỗi băng 10 microlit dung dịch chuẩn từ bình 1 (băng 1) đến bình 6 (băng 6) chấm thành vạch dài 1cm, rộng 0,5 cm.
Tiến hành sắc ký: sau khi triển khai sắc ký đến khi dung môi chạy đƣợc 9 cm, lấy bản mỏng ra, sấy nhẹ trong tủ sấy để bay dung môi. Phun thuốc thử hiện màu đều cả bản mỏng, sấy bản mỏng trong tủ sấy ở nhiệt độ 900
C, sau khoảng 20 phút, các vết EPMC sẽ hiện màu. Đƣa bản mỏng đã hiện vết vào máy soi vết, dùng đèn bƣớc sóng 366 nm ta thu đƣợc các sắc ký đồ của vết chuẩn. Từ kết quả của các diện tích Pic của mẫu chuẩn xây dựng đƣờng chuẩn, tính đƣợc nồng độ trong dung dịch mẫu thử.
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Xác định tên khoa học mẫu cây
Sau khi thực hiện quá trình giám định mẫu cây:
Nơi thu mẫu: Xã Ngọc Sơn, huyện Hiệp Hòa, tỉnh Bắc Giang. Mô tả mẫu: Mẫu gồm cây tƣơi mang lá.
Hình 3.1 Mẫu cây tươi Địa liền
Kết quả giám định: Căn cứ vào các tài liệu có tại trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội (bao gồm: Cây cỏ Việt Nam - Phạm Hoàng Hộ, tập 3; Từ điển thực vật thông dụng – Võ Văn Chi, tập 2; Flora of China, Vol. 24) và các mẫu lƣu tại
phòng tiêu bản Herbier Muséum Paris – Muséum National d’ Histoire Naturelle (P) với các đặc điểm của các bộ phận mẫu cây, để xác định mẫu trên có:
- Tên khoa học: Kaempferia galanga L. - Họ: Zingiberaceae
- Tên thƣờng gọi: Địa liền
3.2 Xác định hàm lƣợng EPMC trong dƣợc liệu
- Tỷ lệ khối lượng khô/ tươi
Cách tiến hành: Cân dƣợc liệu tƣơi: 1000,06 g. Sấy trong 24 giờ ở nhiệt độ 49 – 500
C. Do nhiệt độ nóng chảy của EPMC khá thấp: 47 – 500C, có khả năng bay hơi cùng hơi nƣớc. Vì vậy phải sấy dƣợc liệu ở nhiệt thấp < 500C để đảm bảo không bị giảm hàm lƣợng một cách tối đa do nhiệt.
Khối lƣợng dƣợc liệu tƣơi và dƣợc liệu khô thu đƣợc tƣơng ứng là 1000,06 g và 228, 32 g.
Tỉ lệ khối lƣợng khô/ tƣơi =
= = Nhƣ vậy, từ dƣợc liệu Địa liền tƣơi thành dƣợc liệu khô giảm 4,38 lần. - Lập đường chuẩn
Mối quan hệ giữa lƣợng chất chấm lên vết và diện tích pic đã đƣợc khảo sát trong khoảng từ 2 µg đến 12 µg.
Cách tiến hành pha dãy chất chuẩn: chuẩn bị 6 bình định mức 10 ml sạch, khô. Đánh dấu bình theo thứ tự lần lƣợt các số 1, 2, 3, 4, 5, 6. Tƣơng ứng với số đếm của bình là số ml hút từ dung dịch chuẩn gốc (ở mục 2.3.4) vào các bình là 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml. Thêm Ethanol 96% tới vạch định mức của các bình. Dùng các dung dịch thu đƣợc để chấm sắc ký của mẫu chuẩn (dung dịch chuẩn dùng trong ngày). Tiến hành sắc ký tƣơng tự mục 2.3.4.
Bảng 3.1 Kết quả thu được khi đo 6 mẫu chuẩn Mẫu chuẩn số 1 2 3 4 5 6 Nồng độ các mẫu (mg/ml) 19,9 39,8 59,7 79,6 99,5 119,4 Lƣợng chất trên vết (µg) 1,99 3,98 5,97 7,96 9,95 11.94 Diện tích Pic (mA.s) 6217,282 13256,09 19089,3 25432,6 28195,22 33249,07 Phƣơng trình đƣờng chuẩn y = 2675x + 2274 R2 0,9840
Từ kết quả đó, ta xây dựng đƣợc đƣờng chuẩn đƣợc biểu thị ở hình vẽ sau đây:
Hình 3.2 Đường chuẩn thể hiện mối liên quan tuyến tính giữa lượng chất và diện tích pic.
y = 2675.1x + 2274.6 R² = 0.9849 0 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000 35,000 40,000 0 2 4 6 8 10 12 14 Lƣợng chất trên pic mcg
Nhận xét:
Mối quan hệ giữa lƣợng chất chấm lên vết và diện tích pic đã đƣợc khảo sát trong khoảng từ 2 µg đến 12 µg. Kết quả đánh giá thực nghiệm cho thấy trong khoảng nồng độ này có tƣơng quan tuyến tính chặt chẽ (với R2
= 0,9840) giữa lƣợng chất EPMC trên vết và đáp ứng diện tích pic của EPMC khi phân tích bằng TLC trong điều kiện đã thiết lập. Nhƣ vậy ta có thể định lƣợng EPMC trong mẫu thử có nồng độ trong khoảng 2 µg đến 12 µg.
- Định lượng lượng EPMC trong các mẫu dược liệu
Thí nghiệm:
Tiến hành chuẩn bị mẫu nhƣ ở mục 2.3.4, bản mỏng silica gel 60F254 (6 cm×10 cm) đã đƣợc hoạt hóa ở 110°C trong 2 giờ đƣợc chia vạch thành 2 băng, chấm lần lƣợt mỗi băng 10 microlit dung dịch thử tƣơi và khô, chấm thành vạch dài 1cm, rộng 0,5 cm và phân tích vết sắc ký nhƣ mô tả trong mục 2.3.4. Kết quả hàm lƣợng EPMC trong các mẫu dƣợc liệu thu đƣợc trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Kết quả định lượng của mẫu tươi và mẫu khô
Nội dung Mẫu tƣơi Mẫu khô
Khối lƣợng mẫu (mg) 2001,6 456,6
Thể tích chấm sắc ký (µl) 10 10
Diện tích Pic 32137,4 29987,8
Hàm lƣợng EPMC trong dƣợc liệu (%) 0,56 2,27
Tỷ lệ hàm lƣợng EPMC sau sấy/ trƣớc sấy
Nhƣ vậy theo kết quả, hàm lƣợng EPMC trong dƣợc liệu thu đƣợc là > 2%, hàm lƣợng EPMC trong dƣợc liệu khô bằng 93,03% trong dƣợc liệu tƣơi, giảm 6,97%.
3.3 Chiết xuất EPMC bằng cất kéo hơi nƣớc
Phƣơng pháp cất kéo tinh dầu bằng hơi nƣớc đƣợc sử dụng tƣơng đối phổ biến trong việc chiết tinh dầu và các chất trong hỗn hợp tinh dầu. Trong cất kéo tinh dầu bằng hơi nƣớc cần lựa chọn điều kiện: thời gian lâu hơn, nhiệt độ cao hơn để có thể tăng tối đa khả năng tách đƣợc tinh dầu ra khỏi dƣợc liệu. Ngoài ra, dƣợc liệu cần phải xay nhỏ để giảm kích thƣớc bột, phá vỡ tế bào, tăng khả năng thấm của nƣớc cũng nhƣ dung môi. Nguyên liệu dùng trong phƣơng pháp này là dƣợc liệu tƣơi và khô, tuy nhiên đối với dƣợc liệu khô cần phải ngâm no nƣớc để nƣớc ngấm sâu vào trong dƣợc liệu, tăng khả năng cất kéo của hơi nƣớc.
- Cách tiến hành: Cân 300 g bột dƣợc liệu Địa liền tƣơi, cho vào bình cầu 2 lít, lắp vào bộ cất tinh dầu có gắn ống sinh hàn, thêm nƣớc cho ngập dƣợc liệu, để nhiệt 120 – 1500C cất trong 10 giờ kể từ khi nƣớc sôi. Đây là điều kiện phù hợp để tăng khả năng chiết tinh dầu trong thân rễ Địa liền. Ở bình hứng trong quá trình cất, tinh dầu đƣợc kéo ra cùng hơi nƣớc, tuy nhiên lƣợng nƣớc đi ra lớn hơn rất nhiều so với lƣợng tinh dầu, ngoài ra do tỷ trọng của tinh dầu trong Địa liền chênh lệch không đáng kể so với nƣớc (d gần bằng 0,9) còn tỷ trọng EPMC lại khá lớn 1,205 > 1 nên sự phân tách của lớp tinh dầu không rõ rệt [15]. Vì vậy cần 1 dung môi để có thể hòa tan EPMC và tinh dầu để kéo tinh dầu và EPMC ra khỏi lớp nƣớc. Ở đây, ta sử dụng n-hexan có khả năng hòa tan và bay hơi tốt. Trong quá trình cất cạn nƣớc ta bổ sung thêm nƣớc đảm bảo đủ nƣớc ngập dƣợc liệu, tránh bị cạn nƣớc và cháy dƣợc liệu.
Sau khi cất xong để nguội, tháo bộ dụng cụ. Đổ dịch thu đƣợc ở bình hứng vào bình gạn 50 ml, lắc kĩ, đều trong 5 phút rồi để yên 10 phút để tách lớp
hoàn toàn. Chiết lấy lớp trên. Đổ lớp này vào cốc có mỏ 100ml, dùng giấy ni lông bọc lại bỏ vào ngăn lạnh của tủ lạnh qua đêm, sáng ngày hôm sau thấy xuất hiện tủa. Lọc chân không để lấy tủa. Xác định khối lƣợng chất rắn thu đƣợc.
Cân 70 g dƣợc liệu khô (tƣơng ứng với 300 g dƣợc liệu tƣơi). Trƣớc khi tiến hành cất, ngâm nƣớc (trong 3 giờ) để nƣớc ngấm sâu vào trong dƣợc liệu, tăng khả năng cất kéo của hơi nƣớc. Rồi tiến hành cất tƣơng tự mẫu tƣơi.
Những hôm trời lạnh, dịch chiết để ở nhiệt độ phòng đã xuất hiện tủa kết tinh. Tủa đƣợc kết tinh lại để đảm bảo độ tinh khiết và đƣợc xác định phổ và nhiệt độ nóng chảy.
Kết quả thu được:
- Khối lƣợng kết tủa thu đƣợc ở dƣợc liệu tƣơi và khô lần lƣợt là 1,22 g và 1,05 g
- Hiệu suất chiết bằng phƣơng pháp cất kéo từ dƣợc liệu tƣơi và khô lần lƣợt là: 73% và 61%.
- Chất lƣợng kết tủa thu đƣợc: Kết tủa thu đƣợc là tinh thể không màu, trong hay màu trắng, dài, trông giống hạt mì chính hoặc to hơn. Chất lƣợng kết tủa thu đƣợc có chất lƣợng, độ tinh khiết cao.
Giải phổ EPMC (C12H14O3, MW 206,24)
Hình 3.3 Công thức cấu tạo của EPMC
4' 3' 2' H3CO O O CH3 1' 6' 3 5' 2 1 6 7 5 C12H14O3 M=206,24
- Tinh thể trắng.
- Nhiệt độ nóng chảy: 48,6°C (tài liệu [14]: 49,35°C) - Rf: 0,46 (pha động n-hexan: aceton: 80: 20)
- IR (KBr), υmax (cm-1): 2983,95; 2883,77 (CH2, CH3); 1705,74 (C=O); 1509,29 (C=C thơm)
- ESI-MS (m/z) positive: 206,0 (M+, ion phân tử); 178,0; 161,0; 133,1.
Bảng 3.3 Kết quả phân tích và so sánh 13C NMR và 1
H NMR giữa mẫu thực nghiệm và tài liệu
13 C NMR 1H NMR C Thực nghiệm (500 MHz, MeOD, ppm) Tài liệu [11] (125 MHz, MeOD, ppm) Thực nghiệm (500 MHz, MeOD, ppm) Tài liệu [11] (500 MHz, MeOD, ppm) 1 168,89 169,10 2 116,27 116,29 7,59 (2H, d, J = 16 Hz) 7,62 (2H, d, J = 16 Hz) 3 145,75 145,92 6,39 (1H, d, J =15,5Hz) 6,35 (1H, d, J = 16 Hz) 5 55,80 55,85 3,79 (3H, s) 3,82 (3H, s) 6 61,38 61,47 4,20 (2H, dd, J = 7,5 Hz) 4,84 (2H, s) 7 14,63 14,62 1,30 (3H, t, J = 7,0 Hz) 1,30 (3H, t, J = 7,0 Hz) 1’ 128,23 128,35 2’ 130,86 130,93 6,90 (2H, dd, J = 2,5 Hz) 6,95 (2H, dd, J = 2,0 Hz) 3’ 115,34 115,41 7,47 (2H, dd, J = 2,5 Hz) 7,54 (2H, dd, J = 2,0 Hz) 4’ 162,97 163,15 5’ 115,34 115,41 7,47 (2H, dd, J = 2,5 Hz) 7,54 (2H, dd, J = 2,0 Hz) 6’ 130,86 130,93 6,90 (2H, dd, J = 2,5 Hz) 6,95 (2H, dd, J = 2,0 Hz)
Phổ 1H-NMR có 7 tín hiệu của 14 proton. Các tín hiệu trong vùng 6,39 ppm đến 7,59 ppm là đặc trƣng cho các proton không no và thơm. Trong đó 2 tín hiệu ở 6,9 ppm (2H) và 7,47 ppm (2H) là của hydro ở vòng thơm. Tín hiệu ở 3,79 ppm (3H) đặc trƣng cho nhóm CH3 trong -OCH3. Còn tín hiệu ở 1,30 ppm (3H) và 4,20 ppm (2H) là các nhóm CH3 và CH2 trong -OCH2CH3. Các tín hiệu ở 6,39 ppm (J=15,5, CH-3) và 7,59 ppm (J=16, CH-2) cho thấy đây là các hydro của nhóm olefin ở vị trí trans.
Phổ 13
C-NMR có 10 tín hiệu C. Trong đó tín hiệu ở 115,34 ppm là của C3’ và C5’. Tín hiệu ở 130,86 ppm là của C2’ và C6’.
Tóm lại, từ các tính chất vật lý và dữ liệu phổ cho thấy sản phẩm đúng là EPMC.
3.4 Chiết xuất EPMC bằng Soxhlet
Chiết Soxhlet là phƣơng pháp đƣợc nhiều nghiên cứu lựa chọn trong việc tạo ra dịch chiết của cây Địa liền để kiểm tra tác dụng, hoạt tính sinh học của nó. Phƣơng pháp này có nhiều lợi thế hơn so với phƣơng pháp ngấm kiệt (tốn ít dung môi và rút ngắn thời gian chiết) và sử dụng dƣợc liệu khô.
Điều kiện thực nghiệm của đề tài có thể dùng dung môi là diethyl ether, toluen, ether dầu hỏa, ethanol, methanol, cloroform, dicloromethan… Do điều kiện phòng thí nghiệm sẵn có, và có thêm một số ƣu điểm nên chúng tôi chọn n- hexan và ethyl acetat đều có ƣu điểm là khả năng hòa tan hoạt chất và tinh dầu khá tốt, khá chọn lọc và ít độc.
Cách tiến hành:
Cân 69 g bột dƣợc liệu khô, lắp đặt bộ dụng cụ Soxhlet, đổ 200ml n- hexan từ trên xuống qua sinh hàn, xuống phần chứa nguyên liệu, dung môi ngấm vào dƣợc liệu. Đến một mức nhất định sẽ chảy xuống bình cầu phía dƣới. Chiết trong 6 giờ ở nhiệt độ 70-80 0C. Thời gian một vòng của dung môi là 9 phút.
Chiết xong để nguội. Cất thu hồi dung môi bằng máy cô quay chân không thu đƣợc dịch màu vàng nâu. Đổ dịch vào ống đong, cho dung môi vào tráng sạch bình cầu với lƣợng vừa đủ càng ít càng tốt, cho dịch tráng vào ống đong. Tráng lại nhiều lần và đổ vào ống đong đủ 14 ml. Đổ sang cốc có mỏ, tráng sạch ống đong bằng 1ml dung môi. Bịt kín miệng cốc bằng giấy ni lông và cho vào tủ lạnh để qua đêm.
Hôm sau, trong cốc xuất hiện sản phẩm kết tinh, lọc thu tủa. Định tính xác định đƣợc là EPMC. Tuy nhiên, tủa thu đƣợc có màu vàng trong khi đó tủa thu đƣợc ở cất kéo hơi nƣớc là không màu chứng tỏ tủa thu đƣợc bằng phƣơng pháp này lẫn nhiều tạp hơn. Vì vậy, cần phải kết tinh lại trong dung môi. Càng thực hiện nhiều lần kết tinh lại trong dung môi thì tủa càng sạch. Tuy nhiên, quá trình này cũng sẽ làm mất đáng kể một lƣợng hoạt chất. Ta chỉ kết tinh lại một lần.
Tủa thô thu đƣợc rửa qua bằng 3 ml dung môi, dàn đều tủa trên phễu lọc, nhỏ từ từ dung môi đều lên tủa để loại bỏ bớt tạp. Tủa sau tủa đƣợc kết tinh lại trong 8 ml dung môi. Sau kết tinh, lọc thu sản phẩm, xác định khối lƣợng và nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm.
Sản phẩm tạo ra vẫn còn hơi vàng (còn lẫn tạp). Đối với ethyl acetat cũng tiến hành tƣơng tự. Kết quả thu đƣợc thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.4 Kết quả của phương pháp Soxhlet bằng 2 dung môi n-hexan và ethyl acetat
Dung môi
Nội dung n-hexan Ethyl acetat
Khối lƣợng dƣợc liệu nghiên cứu (g) 69,6g 68,5g
Thể tích n-hexan dùng để kết tinh EPMC (ml) 15 15
Khối lƣợng EPMC thô (g) 1,69 1,20
Khối lƣợng sau kết tinh lại (g) 1,47 1,06
Nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm sau kết tinh lại (0C) 46,3 44,6
Hiệu suất chiết (%) 86 63
3.5 So sánh các phƣơng pháp chiết xuất
Từ những kết quả thu đƣợc ở các phƣơng pháp chiết xuất. Ta có bảng so sánh sau đây:
Bảng 3.5 Bảng so sánh các phương pháp nghiên cứu chiết xuất EPMC từ Địa liền
Phƣơng pháp
Nội dung
Cất kéo hơi nƣớc từ dƣợc liệu tƣơi
Chiết Soxhlet bằng dung môi hữu cơ
n-hexan Ethyl acetat
Thể tích dung môi hữu cơ sử
dụng (ml) 15 226 226 Thể tích n-hexan dùng để kết tinh EPMC (ml) 15 15 15 Khối lƣợng kết tủa thu đƣợc (g) 1,22 1,47 1,06
Hiệu suất chiết (%) 73 86 63 Nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm (0C) 48,6 46,3 44,6 Chất lƣợng kết tủa thu đƣợc
Kết tủa thu đƣợc là tinh thể không màu, trong hay màu trắng, dài, trông giống hạt mì chính nguyên hoặc to hơn. Chất lƣợng kết tủa thu đƣợc có độ tinh khiết cao. Kết tủa thu đƣợc vụn, nhỏ hơn phƣơng pháp cất kéo hơi nƣớc, có