Nghiên cứu các hợp chất ngoại bào của một số vi sinh vật đáy biển Bắc Bộ

- Khảo sát hoạt tính chống ung thư và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chất phân lập được làm cơ sở khoa học định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng các hợp chất này... Vi s

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TSKH Phạm Văn Cường

Hà Nội - 2014

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn:

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc nhất của mình tới TSKH Phạm Văn Cường đã chỉ ra hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện của luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hóa học, Hội đồng Khoa học,

Bộ phận đào tạo và các phòng chức năng đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi

để tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hoá Sinh biển đã cổ vũ, động viên, tạo điều kiện cho tôi học tập và làm việc để tôi có thể thực hiện tốt các công việc của luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Đoàn Thị Mai Hương và TS Trịnh Thị Thanh Vân cùng các anh chị, các bạn đồng nghiệp của phòng Tổng hợp Hữu cơ và Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển thuốc – Viện Hóa Sinh biển đã giúp đỡ, đóng góp nhiều ý kiến quý báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi hoàn thành tốt bản luận văn này

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả

Vũ Văn Nam

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT………

DANH MỤC CÁC BẢNG………

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ………

DANH MỤC CÁC HÌNH………

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC………

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về vi sinh vật biển 3

1.1.1 Vi sinh vật 3

1.1.2 Vai trò của vi sinh vật trong tự nhiên 4

1.1.3 Vai trò của vi sinh vật trong đời sống 5

1.1.4 Vi sinh vật biển 5

1.2 Nghiên cứu về đa dạng vi sinh vật biển Việt Nam 6

1.3 Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của vi sinh vật biển trên thế giới 11

1.3.1 Hoạt tính kháng lao 13

1.3.2 Hoạt tính chống ung thư 14

1.3.3 Hoạt tính khác 16

1.4 Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học vi sinh vật biển Việt Nam 18

1.5 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu vi khuẩn Photobacterium 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu, xác định tên khoa học 22

2.2 Phương pháp lấy mẫu 22

2.3 Phương pháp phân lập chủng vi sinh vật biển 22

2.4 Phương pháp nuôi cấy 22

2.5 Phương pháp tách chiết các hợp chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy vi

sinh vật 24

2.6 Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Photobacterium sp 24

2.7 Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật 25

2.8 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 25

2.8.1 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào 25

2.8.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 26

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 28

3.1 Xử lý mẫu và tách chiết, phân lập các chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp 28

3.2 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp 31

3.2.1 Các chất phân lập được từ dịch chiết MeOH 31

3.2.2 Các chất phân lập được từ dịch chiết Etyl axetat 33

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ dịch chiết MeOH 37

4.1.1 Hợp chất 1-(pyrrolidine-2’-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamide (FM8.4) 37

4.1.2 Hợp chất Uracil (FM7.3) 42

4.1.3 Hợp chất Cyclo-(Pro-Gly) (FM4.2) 42

4.2 Các chất phân lập được từ cặn Etyl acetat 43

4.2.1 N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide (F5.5) 44

4.2.2 Hợp chất Cyclo-(Pro-Ala) (F5.4) 48

4.2.3 Hợp chất Cyclo-(Leu-Pro) (F5.1) 49

4.2.4 Hợp chất indole-3-carbonitrile (F3.3.1) 50

4.2.5 Hợp chất Thymine (F7.2) 51

4.2.6 Hợp chất 3-metyl pipererazine-2,5 dion (F8.2) 52

4.2.7 Hợp chất Axit benzoic (F2.2) 53

4.2.8 Hợp chất 4-(2-hydroxyethyl) phenol (F3.3.2) 53

4.3 Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được 54

4.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào của các chất được phân lập 54

4.3.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của chất được phân lập 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN TỚI LUẬN VĂN 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NMR: Nuclear Magnetic Resonance (phổ cộng hưởng từ hạt nhân)

1

H-NMR: Phổ cộng hưởng từ proton

13

C-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C

DEPT: Distortionles Enhancement by Polarization Transfer (phổ DEPT)

COSY: Homonuclear Correlated Spectroscopy

HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation (phổ HMBC)

HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence (phổ HMQC)

HSQC: Heteronuclear Single Quantum Coherence (phổ HSQC)

NOE: Nuclear Overhauser Effect (hiệu ứng NOE)

NOESY: Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy (phổ NOESY)

b: broad dd: doublet of doublets dt: doublet of triplets dq: doublet of quartets

δ H , δ C : Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon

ppm: part per million (phần triệu)

EIMS: Electron Inoniziation Mass Spectroscopy (phổ khối phun mù điện tử) HRMS: High Resolution Mass Spectroscopy (phổ khối phân giải cao)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Số lượng một số nhóm vi sinh vật trong các mẫu nước biển và trầm tích tại Cát Bà 7Bảng 1.2 Kết quả phân loại một số chủng vi khuẩn thuộc Cát Bà 8Bảng 1.3 Kết quả phân loại một số chủng nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn tại Cát Bà8

Bảng 1.4 Số lượng và số chủng vi sinh vật tách được trong các mẫu nước biển Việt Nam 9Bảng 1.5.Xạ khuẩn từ đảo Cát Bà 11

Bảng 4.1 Dữ kiện phổ 1H-NMR (CD3OD; 500 MHz) và 13C-NMR (CD3OD; 125 MHz) của FM8.4 39

Bảng 4.2 Dữ kiện phổ 1H-NMR (CD3OD; 500 MHz) và 13C-NMR (CD3OD; 125 MHz) của F5.5 45Bảng 4.3 Hoạt tính gây độc tế bào của các chất được phân lập 54Bảng 4.4.Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của chất được phân lập 55

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1.Hình ảnh một số vi sinh vật 4

Hình 2.1 Một số hình ảnh trong quá trình phân lập chủng vi sinh vật 23

Hình 3.1.Sơ đồ chiết mẫu nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp 28

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập cặn chiết MeOH 29

Hình 3.3.Sơ đồ phân lập cặn chiết EtOAc 30

Hình 4.1 Cấu trúc các hợp chất được phân lập từ cặn MeOH 37

Hình 4.2 Phổ khối của FM8.4 38

Hình 4.3 Phổ 1H-NMR giãn rộng của FM8.4 39

Hình 4.4 Phổ 13C-NMR giãn rộng của chất FM8.4 40

Hình 4.5 Phổ COSY của chất FM8.4 40

Hình 4.6 Phổ HMBC của chất FM8.4 41

Hình 4.7 Một số tương tác chính trên phổ HMBC và COSY của chất FM8.4 41

Hình 4.8 Một số tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất FM4.2 43

Hình 4.9 Cấu trúc các hợp chất phân lập được từ cặn Etyl acetat 44

Hình 4.10 Phổ khối của chất F5.5 45

Hình 4.11 Phổ 1H-NMR của chất F5.5 46

Hình 4.12 Phổ 13C-NMR của chất F5.5 47

Hình 4.13 Phổ COSY của chất F5.5 47

Hình 4.14 Phổ HMBC của chất F5.5 47

Hình 4.15 Tương tác chính trên phổ COSY ( ) , HMBC ( ) của chất F5.5 48

Hình 4.16 Tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất F5.4 49

Hình 4.17 Tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất F5.1 50

Hình 4.18 Tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất F3.3.1 51

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Phổ của hợp chất 1-(pyrrolidine-2’-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamide

(FM8.4) PL1 Phụ lục 2 Phổ của hợp chất Uracil (FM7.3) PL5 Phụ lục 3 Phổ của hợp chất Cyclo-(Pro-Gly) (FM4.2) PL7 Phụ lục 4 Phổ của hợp chất N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide (F5.5) PL11 Phụ lục 5 Phổ của hợp chất Cyclo-(Pro-Ala) (F5.4) PL15 Phụ lục 6 Phổ của hợp chất Cyclo-(Leu-Pro) (F5.1) PL19 Phụ lục 7 Phổ của hợp chất Indole-3-carbonitrile (F3.3.1) PL23 Phụ lục 8 Phổ của hợp chất Thymine (F7.2) PL27 Phụ lục 9 Phổ của hợp chất 3-methylpiperazine-2,5-dione (F8.2) PL29 Phụ lục 10 Phổ của hợp chất Axit benzoic (F2.2) PL31 Phụ lục 11 Phổ của hợp chất 4-(2-hydroxyethyl)phenol (F3.3.2) PL34

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đại dương chiếm 70% diện tích bề mặt trái đất, là nơi có sự đa dạng về sinh học lớn nhất trên trái đất Đây là nơi sinh sống của 34 trên 36 ngành động thực vật trên trái đất với hơn 300000 loài sinh vật đã được biết đến Môi trường biển đã được biết đến như một nguồn phong phú cung cấp các hợp chất thiên nhiên, nó như một kho dược liệu khổng lồ đang chờ được khai thác và khám phá Đặc thù môi trường sống khắc nghiệt dưới biển sâu chính là điều kiện để hình thành các hợp chất hữu cơ với những đặc điểm cấu trúc hóa học độc đáo và hoạt tính sinh học quý giá [1,2]

Việc nghiên cứu các hoạt chất thứ cấp được sản sinh từ vi sinh vật biển trên thế giới đã thu được nhiều thành tựu đáng kể Trong số rất nhiều các hợp chất thứ cấp với cấu trúc hóa học đặc biệt đã có nhiều hợp chất thể hiện hoạt tính sinh học rất phong phú Đồng thời nhiều hợp chất trong số này đã đang được thử nghiệm sâu hơn nhằm ứng dụng trong y dược Trong khi đó, nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ nguồn vi sinh vật biển của Việt Nam mới chỉ được bắt đầu, có rất ít các nghiên cứu

đã công bố, mặc dù nguồn đa dạng vi sinh vật biển của nước ta là rất lớn nhờ vị trí địa lý tiếp giáp với biển [1,2,10]

Việt Nam có tiềm năng to lớn về tài nguyên biển, với hệ sinh vật biển đa dạng và phong phú Đất nước ta nằm trong khu vực biển Thái Bình Dương, sở hữu hơn 1 triệu km2 vùng biển [1] Do vậy, việc tiến hành nghiên cứu các hợp chất thứ cấp của nguồn vi sinh vật biển Việt Nam nhằm phát hiện các chất có hoạt tính sinh học cao có thể nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực y dược là hướng nghiên cứu cần thiết, hứa hẹn nhiều triển vọng Ngoài ra, trong rất nhiều nghiên cứu về các đối tượng sinh vật biển như hải miên, san hô , các hợp chất phân lập được đã được xác định là do chính các vi sinh vật cộng sinh tạo ra Việc thu lượng lớn các đối tượng sinh vật biển này cho nghiên cứu hóa học là rất khó khăn, đòi hỏi nhiều công sức và kinh phí Do vậy, nếu tiến hành nghiên cứu các hợp chất từ vi sinh vật, chỉ cần thu 1 lượng mẫu nhỏ phục vụ việc phân lập vi sinh vật, sau đó tiến hành sinh khối với lượng lớn trong phòng thí nghiệm phục vụ việc nghiên cứu hóa học

2

Trong khuôn khổ của Đề tài nghiên cứu khoa học: “Nghiên cứu phát hiện

các hợp chất chống lao từ nguồn vi sinh vật đáy biển vùng đông bắc bộ Việt Nam”, mã số: VAST TĐ ĐAB 04/13-15 Kết quả sàng lọc cho chủng vi khuẩn

Photobacterium sp được phân lập từ đất bùn Vịnh Hạ Long thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đối với chủng Staphylococcus aureus, Echerichia coli

và nấm Fusarium oxysporum [50] Cho đến nay, trên thế giới chưa có công trình

nghiên cứu kỹ về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất ngoại

bào của các loài thuộc chi Photobacterium Do vậy, chúng tôi lựa chọn chủng vi khuẩn Photobacterium sp này làm đối tượng nghiên cứu của luận văn với mục tiêu:

- Nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc các chất từ dịch ngoại bào của chủng vi khuẩn Photobacterium sp

- Khảo sát hoạt tính chống ung thư và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chất phân lập được làm cơ sở khoa học định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng các hợp chất này

- Nhóm chưa có cấu tạo tế bào bao gồm các loại virút

- Nhóm có cấu tạo tế bào nhưng chưa có cấu trúc nhân rõ ràng (cấu trúc nhân nguyên thủy) được gọi là nhóm Procaryotes, bao gồm vi khuẩn, xạ khuẩn

và tảo lam

- Nhóm có cấu tạo tế bào và có cấu trúc nhân phức tạp được gọi là Eukaryotes bao gồm nấm men, nấm sợi (gọi chung là vi nấm) một số động vật nguyên sinh và tảo đơn bào

Như vậy, vi sinh vật không có mặt trong hai giới động vật và thực vật Người

ta ước tính trong số 1,5 triệu loài sinh vật có khoảng 200000 loài vi sinh vật Tuy nhiên hàng năm, có thêm hàng nghìn loài sinh vật mới được phát hiện, trong đó có không ít loài vi sinh vật [2]

Vi khuẩn - Tiếng Anh và tiếng La Tinh là bacterium, đôi khi còn được gọi là

vi trùng Vi khuẩn là một nhóm sinh vật đơn bào, có kích thước nhỏ (kích thước hiển vi) và thường có cấu trúc tế bào đơn giản không có nhân, bộ khung tế bào (cytoskeleton) và các bào quan như ty thể và lục lạp [2,7]

4 Virút là một dạng đặc biệt chưa có cấu trúc cơ thể là những tác nhân gây nhiễm trùng có kích thước nhỏ nhất (đường kính từ 20-300 nm) và trong bộ gen của chúng chỉ chứa 1 loại axit nucleic (RNA hoặc DNA) Axit nucleic được bao bọc trong lớp vỏ protein và bên ngoài cùng có thể được bao quanh 1 màng lipid Toàn

bộ phân tử virút được gọi là virion Có 3 loại virus chính là Viroid (ARN có tính cảm nhiễm), Virusoid (ARN không có tính cảm nhiễm) và Virino Số virút đã được đặt tên là khoảng 4000 loài [2,7]

Xạ khuẩn - danh pháp khoa học là Actinobacteria, tiếng Anh là Actinomycetes

là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên Trước kia được xếp vào tản thực vật (tức nấm), nhưng ngày nay chúng được xếp vào vi khuẩn (Schizomycetes) Xạ khuẩn có nhiều nét khác với nấm nhưng giống vi khuẩn: có giai đoạn đơn bào và có giai đoạn đa bào, kích thước rất nhỏ, nhân giống với vi khuẩn, không có màng nhân và tiểu hạch, vách tế bào không chứa cellulose hoặc chitin, giống với vi khuẩn, phân chia tế bào giống với vi khuẩn (kiểu Amitose) Xạ khuẩn không có giới tính (không có tế bào đực cái), hoại sinh và ký sinh [2,5]

Vi khuẩn Escherichia

coli

Nấm men

Saccharomyces cerevisae

Nấm sợi Alternaria Vi tảo Chlorella

Hình 1.1.Hình ảnh một số vi sinh vật 1.1.2 Vai trò của vi sinh vật trong tự nhiên

Phân giải các hợp chất hữu cơ Làm nguồn thức ăn bổ dưỡng cho các sinh vật hóa dị dưỡng hữu cơ khác, tức là chuyển hóa nhanh các chất hữu cơ trong chu trình thức ăn Làm nguồn thức ăn cho các loại giun, sâu bọ tạo ra mạng lưới thức

5

ăn Biến đổi các chất để các cơ thể khác nhau có thể sử dụng được Biến đổi rất lớn các chất bằng cách hình thành các chất hòa tan và khí, từ đó tạo ra các chất tham gia vào con đường chuyển hóa trực tiếp hoặc biến đổi môi trường một cách gián tiếp Hình thành các chất ức chế làm giảm hoạt động của các vi sinh vật khác, của thực vật và động vật Số lượng và chủng vi sinh vật trong tự nhiên là rất lớn, rất đa dạng

và luôn biến đổi Ở một số nơi, số vi sinh vật phụ thuộc vào nguồn chất dinh dưỡng, các chất độc hại và các tác nhân tới hạn khác Vi sinh vật có vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn các nguyên tố C, N, S, P… và có khả năng chuyển hóa các hợp chất độc hại chứa kim loại nặng như bạc, vàng, thủy ngân, đồng… thành các dạng không độc hại hoặc ít độc hơn đối với cơ thể người động vật và cây trồng [7]

1.1.3 Vai trò của vi sinh vật trong đời sống

Sử dụng vi sinh vật trong lên men đồ uống, lên men lactic, ủ chua thức ăn gia súc, sử dụng những tác nhân ức chế vi sinh vật trong bảo quản thực phẩm, giữ

vệ sinh môi trường làm việc và hoạt động sống

Vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn – mô hình lý tưởng trong công nghệ di truyền và công nghệ sinh học Một số vi sinh vật là tác nhân gây bệnh trên người, động vật và cây trồng Hiện có khoảng 1000 loài virút gây bệnh trên thực vật, gần 90% các bệnh đường hô hấp ở người là do virút, trong đó có bệnh viên đường hô hấp cấp (bệnh SARS), HIV/AIDS vẫn là đại dịch chưa có thuốc chữa khỏi, các

bệnh vi khuẩn trên người cũng rất nhiều như viên xoang mũi (Staphylococcus sp), bạch hầu (Corynebacteriumdiphtheria), ho gà (Bordetella pertusis), lao phổi (Mycobacterrium tuberculosis) [7]

1.1.4 Vi sinh vật biển

Biển là môi trường sống rất đặc biệt, vì ở đó nghèo chất dinh dưỡng và độ mặn cao Biển là một hệ sinh thái tự nhiên lớn nhất địa cầu vì hơn 70% bề mặt trái đất được bao phủ bởi nước Vi sinh vật biển có khả năng thích nghi với các điều kiện môi trường biển luôn bị thay đổi, điều này mở ra các triển vọng phát triển các hợp chất hữu cơ thứ cấp duy nhất Số lượng vi sinh vật biển không cao như trên

6 cạn Vi sinh vật biển có thể phân lập được từ trầm tích biển, nước biển, từ các đối tượng mà hoạt động hoặc bất động mà vi sinh vật có thể cộng sinh Hiểu được qui luật phân bố của vi sinh vật biển sẽ làm dễ dàng và tạo điều kiện thuận lợi để thu thập chúng từ các vật mẫu thích hợp cho việc phân lập định hướng các nhóm vi sinh vật có hoạt tính sinh học đã được phân loại [1,2,10]

Với mức đa dạng sinh học cao thì các vi sinh vật biển đóng vai trò quan trọng đối với vòng tuần hoàn sinh địa hóa các nguyên tố cơ bản Những vi sinh vật này có thể tìm thấy ở bất kỳ ngõ ngách nào ở đại dương từ trên bề mặt đến dưới thềm đáy biển, trên các cơ thể sinh vật biển hay cả giữa những dòng hải lưu Dưới 5% số tế bào vi khuẩn quan sát được ở các mẫu sinh vật lấy từ biển là có thể phát triển trong các môi trường nuôi cấy nhân tạo Và người ta ước tính rằng số vi khuẩn biển hiện giờ đã có thể nuôi cấy và phân lập chỉ chiếm dưới 1% số loài trong thực

tế Vi sinh vật biển từ lâu đã được biết đến như một trong số các nguồn tài nguyên quan trọng sản sinh các chất với cấu trúc hóa học đa dạng và có hoạt tính sinh học mới Ngoài ra, vi sinh vật biển cũng đã được nghiên cứu ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống nhờ các tính chất đặc hiệu của chúng [1,2]

1.2 Nghiên cứu về đa dạng vi sinh vật biển Việt Nam

Việt Nam có tiềm năng to lớn về tài nguyên biển, với hệ sinh vật biển đa dạng và phong phú Đất nước ta nằm trong khu vực biển Thái Bình Dương, sở hữu hơn 1 triệu km2 vùng biển Kết quả thống kê đến nay đã thông báo 12000 loài động thực vật biển ở Việt Nam, trong đó có rất nhiều loài có độc tính sinh học tiềm tàng Tuy nhiên, việc điều tra nghiên cứu để khai thác tiềm năng đó vẫn còn hạn chế Nghiên cứu, phát triển, khai thác những nguồn tài nguyên sinh vật biển đang là vấn

đề cấp bách không chỉ nước ta mà trên toàn thế giới [1]

Để có thể đánh giá và nghiên cứu sử dụng các vi sinh vật biển, trong nghiên

cứu về đa dạng sinh học vi sinh vật biển thuộc vùng biển Cát Bà, Hải Phòng, tác giả Lại Thúy Hiền và cộng sự (Viện Công nghệ sinh học, Viện HLKHCNVN) đã khảo

7 sát, phân tích và thống kê sự có mặt của vi sinh vật từ các mẫu nước biển Cát Bà [4] Kết quả cho thấy khu hệ vi sinh vật ở vịnh Lan Hạ - Cát Bà rất đa dạng và phong phú bao gồm cả vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc, nấm men, xạ khuẩn, vi khuẩn lên men, vi khuẩn chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ, vi khuẩn sử dụng các hyđrocacbon và vi khuẩn khử sulphat

Bảng 1.1 Số lượng một số nhóm vi sinh vật trong các mẫu nước biển và trầm tích tại Cát Bà

Tọa độ

Hiếu khí

Nấm mốc

Nấm Men

Xạ khuẩn Lên men

Sử dụng hyđrocacbon

Nitrit hóa Nitrat hóa Khử nitrat

Khử sulphat

20°43’820” 10 5 4 x 10 1 0 0 10 4 10 4 10 2 10 5x 10 1 5 x 10 1

107°4’480” 2 x 10 7 8 x 10 4 0 0 10 5 10 5 10 5 10 2 10 2 10 5

20°45’263” 105 0 0 0 105 104 10l 103 103 10 107°04’02” 1,7 x 107 0 0 0 106 5 x 105 103 103 104 10420°45’915” 10 6 2 x 10 2 0 0 10 4 5 x 10 4 10 2 10 4 10 4 10 107°03’519” 1,8 x 107 104 0 0 5 x 105 105 104 104 104 10520°46’175” 106 2 x 102 0 10 105 5 x 104 102 102 5x102 10 107°04’906” 1,6 x 107 4 x 104 0 0 106 5 x 105 104 106 106 10520°46’886” 106 0 0 0 105 5 x I04 102 103 103 102

107o06’001 1,7 x 107 2 x 102 0 0 107 5 x 105 104 106 106 5 x 10520°47’563” 106 6x 101 0 10 105 5 x 104 102 102 102 10l

107o06’584” 3,4 x 107 4 x 102 0 0 106 105 104 106 5x105 5 x 105

20°45’702” 106 2 x 101 2 x 101 0 104 5 x 104 102 102 5x102 102107°07’625” 1,7 X 107 0 0 0 105 105 104 104 104 5 x105

20°45’356” 105 4 x101 0 0 105 5 x104 102 102 102 10 107°07’758” 1,8 X 107 0 0 0 106 105 103 103 103 5 x 10 5

20°44’161” 106 0 2 x101 0 5 x 104 5 x104 102 104 104 102107°03’853” 1,7 x 107 8 x10 2 0 0 10 7 5 x 105 10 3 10 6 10 6 5 x 105

20°44’496” 106 0 0 10 104 5 x 104 104 102 103 10 107°03’513 1,9 x 107 0 0 0 5 x 105 5 x 105 104 106 106 104

Đánh giá phân loại vi khuẩn từ một số mẫu nước và trầm tích chọn lọc cho thấy các chủng vi khuẩn Gram âm chiếm ưu thế hơn các chủng Gram dương Các

8

chủng Gram âm phân loại được thuộc các chi: Acinobacter, Pseudomonas, Flavobacterium, Sphingomonas, Ochrobactrum còn vi khuẩn Gram dương chỉ có Bacius, Janibacier Các loài vi khuẩn phân lập đều có tỷ lệ tương đồng rất cao 93 -

100% so với các chủng trong ngân hàng dữ liệu Trong khi đó, đối với các loại nấm

men, nấm mốc, xạ khuẩn tại Cát Bà chủ yếu bao gồm Candida, Rhodotorula,

Cladosporium, Penicillium và Steptomyces (bảng 1.2)

Bảng 1.2 Kết quả phân loại một số chủng vi khuẩn thuộc Cát Bà

Bảng 1.3 Kết quả phân loại một số chủng nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn tại Cát Bà

1 Nước tầng giữa Penicillium duclauxe

9 Cũng trong một nghiên cứu tương tự, Tống Kim Thuần và cộng sự (Viện Công nghệ sinh học) đã công bố nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trên các mẫu nước biển, động, thực vật và trầm tích ở các vùng biển khác nhau của Việt Nam, như Quảng Bình, Bình Định, Phú Yên, Nha Trang, đảo Trường Sa, Hải Phòng và Nam Định [11] Từ 10 mẫu nước, 12 mẫu trầm tích, 2 mẫu san hô và 1 mẫu rong ở các địa điểm và các vị trí lấy mẫu khác nhau của biển Việt Nam, tác giả đã phân lập và

xác định số lượng các nhóm vi sinh vật biển (bảng 1.4)

Bảng 1.4 Số lượng và số chủng vi sinh vật tách được trong các mẫu nước biển Việt Nam

Địa điểm

lấy mẫu Đặc điểm mẫu

10

Bảng 5 Số lượng và vi sinh vật tách được trong các mẫu trầm tích biển Việt Nam

Địa điểm

Ghi chú: CFU: đơn vị hình thành khuẩn lạc; SCTĐ: sổ chủng tách được

Nhóm xạ khuẩn từ lâu đã được biết đến như là nguồn sản sinh các hợp

chất có hoạt tính sinh học cao và luôn là đối tượng được quan tâm nghiên cứu nhiều Từ các mẫu đất và lá cây mục thu tại Cát Bà đã phân lập được 424 chủng xạ khuẩn [2,6] Trong số các chủng này, 353 chủng (83,25%) phân lập được từ đất và

71 chủng (16,75%) từ mẫu lá cây mục Các chủng xạ khuẩn phân lập đã được xác

định tên và phân thành 2 nhóm Streptomyces và non-Streptomyces (xạ khuẩn

11

hiếm) Nhóm Streptomyces bao gồm 296 chủng (chiếm khoảng 69,81%) và 128 chủng thuộc nhóm xạ khuẩn hiếm non-Streptomyces (chiếm khoảng 30,19%) Như vậy, có thể thấy các chủng thuộc nhóm Streptomyces chiếm số lượng đông đảo hơn Mặt khác, xét về mức độ đa dạng, có thể thấy các chi Micromonospora, Nonomureae và Nocardia là các chi chiếm ưu thế trong các chi xạ khuẩn hiếm (non-Streptomyces) thu thập tại Cát Bà Các loài thuộc ba chi này cũng thường

được phân lập ở các địa điểm khác ở Việt Nam [20]

Tuy đây mới chỉ là những nghiên cứu bước đầu, nhưng đã cho thấy bức tranh

sơ bộ về đa dạng sinh học các chủng xạ khuẩn có tại đảo Cát Bà, một vườn quốc gia có đa dạng sinh học cao ở Việt Nam

1.3 Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của vi sinh vật biển trên thế giới

Vi sinh vật biển bao gồm vi khuẩn và nấm được xem là nguồn mới nhiều tiềm năng cho việc cung cấp các hợp chất có hoạt tính sinh học cao Nhiều loại vi sinh vật biển sinh sống trong các điều kiện khắc nghiệt, chính bởi vậy chúng thường

12 sản sinh các hợp chất có hoạt tính sinh học lý thú [1,2,10,11] Từ dòng vi khuẩn

dưới biển sâu, người ta tách được một hợp chất Macrolid (1) mới gây độc tế bào

Khi nuôi cấy chúng, sản sinh ra một loại chất mới mà trên cạn chưa từng có như

Macrolactin A (2), có tác dụng ức chế tế bào ung thư, bảo vệ tế bào limpho T,

chống virút HIV [40] Tuy nhiên, nuôi cấy và phân lập các vi sinh vật biển là công việc rất khó khăn Nguyên nhân việc khó nuôi cấy là do ở biển khơi nghèo chất dinh dưỡng, có độ muối khác nhau, vi sinh vật biển đã thích nghi với việc đói và môi trường nghèo nên không phát triển trên môi trường giầu chất dinh dưỡng hơn Người ta đã sử dụng các môi trường và các phương pháp khác nhau để tách các nhóm vi sinh vật biển khác nhau [10]

Vi sinh vật cộng sinh với thực vật và động vật không xương sống có ý nghĩa rất lớn trong việc tách chiết các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học Một trong những

loài vi khuẩn cộng sinh với bọt biển là Rhopaloeides odorabile Ngoài ra rất nhiều loài

vi khuẩn lạ thường và chưa được mô tả thường cộng sinh với tảo biển Khoảng 30% vi

khuẩn cộng sinh với tảo xanh (Hamimeda sp.) và tảo nâu (Lopophora sp.) có thể nuôi

cấy được là vi khuẩn Gram dương (+) Các vi khuẩn Gram (+) thường gặp ở trầm tích biển và chúng có khả năng sinh các chất thứ cấp có hoạt tính diệt côn trùng, các

enzyme gây độc cho tế bào [37] Từ nấm sợi cộng sinh với tảo nâu biển Roseuvuigea

cũng tách được chất kháng sinh mới Pestanlone ức chế sinh trưởng vi khuẩn [35] Các chất chống oxy hóa Superoxidase glutathione (SOD) và một số dẫn suất mới Hydroquinone, Oxepinamides A-C, Fumiquinazolines H-1 cũng được tách chiết từ vi

13

khuẩn biển và nấm sợi biển Acremonium sp [12] Xạ khuẩn biển cũng là nguồn tách

chiết các chất có hoạt tính sinh học mới mà các nguồn trên cạn không có Ngoài các

hợp chất kháng sinh được tách từ nhóm xạ khuẩn Streptomyces Diazepinomicin- một

hợp chất alkaloid mới kháng khuẩn cũng được tách ra từ xạ khuẩn biển

Micromonospora [10]

Do đó, các loài sống dưới đáy biển thường rất đặc biệt và có chứa các hợp chất

có khung cacbon rất khác biệt, đồng thời các hợp chất này thể hiện nhiều hoạt tính sinh học đa dạng

1.3.1 Hoạt tính kháng lao

Một trong những hợp chất chống lao đầu tiên được phát hiện từ loài vi khuẩn

biển là hợp chất streptomycin (3) được phân lập từ loài xạ khuẩn Streptomyces griseus vào năm 1944 [22] Tiếp theo phải kể đến là rifampicin (4) (một kháng sinh

chủ yếu dùng để điều trị lao hiện nay) là một kháng sinh bán tổng hợp từ rifamycin,

một hợp chất được phân lập lần đầu tiên từ Streptomyces mediterranei vào năm

1959 [43] Trong một nghiên cứu gần đây, Zhang và cộng sự đã phân lập hai hợp chất có hoạt tính chống lao rất đáng quan tâm là actinomycin X2 (5) và actinomycin

D (6) từ loài Streptomyces sp MS449 có trong bùn biển [17]

14 Trong một nghiên cứu khác, khi nghiên cứu về một số loài vi sinh vật biển

Pseudomonas, hai dipeptide vòng là massetolide A (7) và viscosin (8) đã được phân

lập và xác định cấu trúc hóa học Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng lao trên

Tubercle bacillus và Mycobacterium avium-intracellulare cho thấy massetolide A

thể hiện hoạt tính ức chế với giá trị MIC là 5–10 và 10–20 mg/mL Trong khi viscosin thể hiện giá trị MIC 2,5–5 và 5–10 mg/mL tương ứng đối với Tubercle

bacillus và Mycobacterium avium-intracellulare [21] Các chủng thuộc Streptomyces luôn là đối tượng quan tâm nghiên cứu của nhiều nhóm trên thế giới

do có thể sản sinh nhiều các hợp chất có cấu trúc lý thú và hoạt tính sinh học đa dạng Hai hợp chất peptide vòng là cyclo-D-Pro-D-Leu và cyclo-D-Pro-D-Val được

phân lập từ loài vi khuẩn biển LS247 tương đồng với chủng Streptomyces puniceus thể hiện hoạt tính kháng lao đối với chủng Tubercle bacillus với giá trị MIC lần lượt

là 7,1 và 18,5 mg/mL [48] Cũng trong một nghiên cứu của chương trình sàng lọc

về loài vi khuẩn biển Streptomyces platensis, hợp chất tự nhiên có cấu trúc hóa học

rất lý thú là platensimycin (9) đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học Các

khảo sát về hoạt tính sinh học cho thấy hợp chất này rất có tiềm năng trong nghiên cứu ứng dụng trong y dược do có hoạt tính rất mạnh với việc kháng các chủng vi khuẩn gram (+) với phổ rất rộng [14]

1.3.2 Hoạt tính chống ung thư

Hoạt tính chống ung thư của các hợp chất thứ cấp được các loài vi sinh vật biển sản sinh cũng cho thấy vi sinh vật biển là nguồn quan trọng trong nghiên cứu tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học Trong số các hợp chất này, nhiều hợp chất có chứa khung cấu trúc hóa học đặc biệt, chưa từng phát hiện từ các nguồn khác Các

hợp chất lagunapyrones A-C (10-12), được phân lập từ xạ khuẩn (actinomycete,

CNB-984) từ bùn biển cho thấy khả năng chống ung thư rất đáng quan tâm [51]

15

Bisucaberin (13) là một dimer vòng của 2 phân tử

l-hydroxy-l,6-diazaundecane-2,5-dione đã được phân lập từ loài khuẩn đáy biển Alteromonas haloplanktis

SB-112 Cấu trúc hóa học của hợp chất này đã được khẳng định bằng phương pháp nhiễu xạ tia X Hoạt tính chống ung thư của bisucaberin được biết đến nhờ khả năng

ức chế quá trình sinh tổng hợp DNA của tế bào ung thư [32]

Nghiên cứu về loài khuẩn biển Alteromonas sp., Kobayashi và cộng sự đã phân

lập và xác định cấu trúc của hợp chất alkaloid là alteramide A (14) Các kết quả

khảo sát hoạt tính chống ung thư cho thấy alteramide A có khả năng ức chế sự phát

triển của các dòng tế bào ung thư P-388, L-1210 và KB [30] Halobacillin (15) là

một acylpeptide vòng mới thuộc lớp chất iturin được phân lập từ loài khuẩn

Bacillus lấy từ mẫu bùn biển Hợp chất này cũng cho thấy khả năng ức chế sự phát

triển của một số dòng tế bào ung thư [31]

16 Một hợp chất có hoạt tính chống ung thư khác đã được biết đến là dolastatin

10 (16) Hợp chất này được phân lập từ loài khuẩn lam có nguồn gốc biển ở Palau,

Symploca sp VP642 Nghiên cứu hoạt tính sinh học cho thấy dolastatin 10 (16) là

tác nhân ức chế microtubule và đây chính là cơ chế chống ung thư của hợp chất này

[29] Ngoài ra, salinosporamide A (17), cũng được phân lập từ loài khuẩn lam

Salinispora tropica Hợp chất này cũng có khả năng ức chế sự phát triển của một số

tế bào ung thư Hoạt tính chống ung thư của hợp chất này được cho là nhờ khả năng

ức chế proteasome 20S Hiện tại hợp chất này đang được thử nghiệm lâm sàng trong điều trị bệnh ung thư [24]

1.3.3 Hoạt tính khác

Trong các công trình nghiên cứu về các hợp chất có tác dụng kháng sinh từ các

chủng của chi Streptomyces, rất nhiều các hợp chất với cấu trúc đa dạng đã được phát hiện Chẳng hạn từ chủng thuộc chi Streptomyces, được phân lập từ mẫu bùn

biển ở San Diego, dãy lớp chất quinone mà điển hình là marinone (18) đã được xác

định Cấu trúc hóa học của lớp chất này cho thấy chúng được sinh tổng hợp từ các

phần polyketide và terpenoid Cũng từ một số chủng khác của chi Streptomyces,

người ta còn phân lập được napyradiomycin (19) và azamerone (20) là những hợp

chất có thể hiện hoạt tính kháng sinh tốt [54]

17

Cũng có nguồn gốc từ loài khuẩn từ bùn biển, hợp chất maduralide (21)

được phân lập từ loài vi khuẩn biển Maduromycete Kết quả khảo sát hoạt tính cho

thấy hợp chất này thể hiện hoạt tính đối với chủng Bacillus subtilis [39]

Các hợp chất thuộc lớp chất phenazine với hoạt tính kháng khuẩn cũng được

phát hiện từ chủng vi khuẩn Streptomyces sp của bùn biển Đây là các hợp chất có

chứa khung cacbon rất hiếm trong tự nhiên với phần L-quinovose ester (22;23)

[16] Các hợp chất này thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với nhiều chủng vi khuẩn Cũng cần nhấn mạnh rằng, hiện nay một số sản phẩm là các dẫn chất của phenazine đang được nghiên cứu sử dụng khai thác hoạt tính kháng khuẩn của chúng trong các lĩnh vực y dược và nông nghiệp

18

1.4 Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học vi sinh vật biển Việt Nam

Như đã trình bày phần trên, đa dạng vi sinh vật nước ta rất dồi dào, tuy nhiên cho tới nay, ở nước ta chưa có nhiều công trình nghiên cứu các hợp chất thứ cấp được sinh tổng hợp từ các vi sinh vật biển Một trong các nghiên cứu điển hình về lĩnh vực này có thể kể đến công bố của tác giả Nguyễn Văn Hùng, Jimmy Orjala và

cộng sự Nghiên cứu đã được tiến hành trên đối tượng khuẩn lam Lyngbya majuscula tại vịnh Nha Trang Khảo sát các hoạt chất thứ cấp của loài vi khuẩn này,

các tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của bốn hợp chất (24 – 27) Trong đó hợp chất 24 và 25 là các hợp chất mới và được đặt tên tương ứng là

Nhatranggin A và B [25] Các hợp chất này có cấu trúc hóa học tương đồng với lớp chất aplysiatoxins đã được phân lập từ nhiều loài khuẩn lam biển Nhiều hợp chất thuộc lớp aplysiatoxins thể hiện hoạt tính chống ung thư thông qua sự hoạt hóa protein kinase C Như vậy, có thể nói đây là những nghiên cứu đầu tiên về các hợp chất thứ cấp từ nguồn vi sinh vật biển của Việt Nam [2]

Trong một nghiên cứu về loài vi tảo biển dị dưỡng mới của Việt Nam,

Labyrinthula sp ND50, các tác giả Hoàng Minh Hiền và Đặng Diễm Hồng đã

nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa của enzyme elongase tham gia vào quá trình

sinh tổng hợp các axit béo như DHA (axit docosahexaenoic) (28), DPA (axit docosapenatenoic) (29) và EPA (axit eicosapentaenoic) (30) [3] Đây là các

hợp chất axit béo Omega-3 đã được nghiên cứu và cho thấy chúng có chứa nhiều hoạt tính sinh học quý giá đã được ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm

19 Cũng trong cùng hướng quan tâm về nhóm vi sinh vật biển có khả năng sản sinh DHA, Phạm Thị Miền và cộng sự (Viện Hải dương học, Nha Trang) đã tiến hành nghiên cứu đánh giá tỷ lệ cacbon (C) và nitơ (N) trong thành phần môi trường

nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Schizochytrium mangrovei lên sự sinh trưởng và sản

sinh DHA Kết quả cho thấy, trong môi trường đường cao nấm men bổ sung MnCl2,

Schizochytrium mangrovei có khả năng tạo được 4,92 g/l DHA Trong môi trường

dùng nguồn natri (Na2SO4) thay thế cho muối biển nhân tạo, sau 5 ngày nuôi cấy

Schizochytrium mangrovei sinh được 0,52 g/l DHA Trong khi ở môi trường dùng thành phần muối biển thay thế cho muối biển nhân tạo, Schizochytrium mangrovei

sinh được 3,12 g/1 DHA Như vậy, MnCl2 có ảnh hưởng lên sự sinh trưởng và sinh

DHA từ Schizochytrium mangrovei [8]

Nhóm tác giả Quyền Đình Thi đã tiến hành nghiên cứu chủng vi sinh vật

biển Acinetobacter sp QN6 có khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào Protease

là một nhóm enzyme thủy phân protein được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, như công nghiệp thực phẩm và thức ăn gia súc [9]

Gần đây, các nhà khoa học Nga đã phát hiện một loài vi sinh vật biển

Pseudomonas aeruginosa 1242 phân lập tại vùng biển Nha Trang có khả năng

chống gỉ Việc sử dụng các tổ hợp enzyme và các hợp chất thứ cấp của chủng

Pseudomonas aeruginosa 1242 đã cho phép nghiên cứu chế tạo lớp sơn phủ

chống gỉ thân thiện với môi trường Đây là hướng nghiên cứu đang được quan tâm hiện nay [53]

Như vậy, các công bố đã cho thấy vi sinh vật biển Việt Nam rất đa dạng về chủng loại Trong số các loài đã được phát hiện là những loài mới, chưa được nhận

20 biết ở khu vực biển khác Chính vì vậy, đây là đối tượng có nhiều tiềm năng khai thác do các vi sinh vật biển đóng vai trò rất quan trọng trong môi trường sinh thái biển Các nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật biển của Việt Nam cho tới nay hết sức khiêm tốn Cho tới nay, các loài vi sinh vật biển của nước ta chưa được khai thác về mặt hoạt tính sinh học, mặc dù đây là nguồn sản sinh các hợp chất thứ cấp quan trọng đối với các sinh vật biển cộng sinh Tuy nhiên, việc thu lượng lớn các đối tượng sinh vật biển này cho nghiên cứu hóa học là rất khó khăn, đòi hỏi nhiều công sức và kinh phí Do vậy, việc tiến hành nghiên cứu các hợp chất từ vi sinh vật sẽ là hướng tiếp cận độc đáo và sáng tạo do chỉ cần thu 1 lượng mẫu nhỏ phục vụ việc phân lập vi sinh vật, sau đó tiến hành sinh khối với lượng lớn trong phòng thí nghiệm phục vụ việc nghiên cứu hóa học

1.5 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu vi khuẩn Photobacterium

Photobacterium là một chi vi khuẩn gram âm, thuộc họ Vibrionaceae, một số

loài có khả năng phát quang Hiện tại có khoảng 20 loài được biết đến trong

chi Photobacterium bao gồm: P.angustum, P aplysiae, P.damselae, P fischeri, P.frigidiphilum, P ganghwensem, P halotolerans, P histaminum, P iliopiscariumal ,

P indicum, P leiognathi, P lipolyticum, P logei, P phosphoreum, P.profundum,

P rosenbergii, P kishitanii ,P lutimaris , P aquimaris , P gaetbulicola Nhiều loài

trong chi này thường sống cộng sinh với sinh vật biển [49]

Một số loài của chi Photobacterium đã phát triển thành tác nhân gây

bệnh của sinh vật biển Một số các bệnh ảnh hưởng đến loài cá và do đó có thể gián tiếp ảnh hưởng đến sức khỏe con người thông qua tiêu thụ cá thể nhiễm bệnh này Năm 2004, nhà khoa học Nhật Bản, Masashi Kanki đã tìm ra nguyên nhân gây bệnh

histamine ở loài cá là do loài Photobacterium phosphoreum [34] Các loài Photobacterium damselae là một trong những loài nguy hiểm nhất và được chia thành hai phân loài: piscicida và damsel Loài P damselae gây bệnh tụ huyết

trùng trên loài cá Chúng phát triển trên lá lách và thận cá, gây bệnh,cuối cùng gây

tử vong [56]

21 Năm 2010, Toshiki Mine đã nghiên cứu phản ứng enzym để chuyển N-acetylneuraminic axit thành inositols (là chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình

phản ứng sinh hóa) sử dụng chất nền mang chủng vi khuẩn Photobacterium [52]

Chủng vi khuẩn Photobacterium sp được phân lập từ đất bùn Vịnh Hạ Long

(năm 2012) thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đối với chủng

Staphylococcus aureus, Echerichia coli và nấm Fusarium oxysporum [50] Trên thế

giới chưa có công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học và nghiên cứu các hợp chất

ngoại bào từ các loài thuộc chi Photobacterium

22

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu, xác định tên khoa học

Chủng vi khuẩn Photobacterium sp được phân lập từ đất bùn Vịnh Hạ Long

(năm 2012) thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định đối với chủng

Staphylococcus aureus, Echerichia coli và nấm Fusarium oxysporum Chủng vi

khuẩn này được PGS.TS Quyền Đình Thi (Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam) định tên

2.2 Phương pháp lấy mẫu

Các mẫu bùn biển sẽ được lấy tại các địa điểm và độ sâu khác nhau tại vùng Vịnh Hạ Long được lưu giữ trong các túi vô trùng Sau đó, các mẫu này được bảo quản trong đá lạnh trong thời gian vận chuyển về phòng thí nghiệm và được tiến hành phân lập để thu các chủng vi sinh vật

2.3 Phương pháp phân lập chủng vi sinh vật biển

+ Mẫu bùn biển nhận về sau khi để rã đông được cân 1g vào ống Fancol 50 ml

+ Bổ xung 9 ml nước muối sinh lý, votex đều và lắc trên máy lắc trong 60 phút sau đó mẫu được pha loãng ở các nồng độ cần thiết

+ Hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa petri có môi trường thích hợp + Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch

+ Tiếp tục sử dụng que gạt này gạt mẫu cho đều khắp mặt thạch đĩa petri tiếp theo từ nồng độ pha loãng thấp đến nồng độ pha loãng cao

+ Đặt các đĩa petri trên vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp sau một thời gian nhất định tuỳ giống vi sinh vật ta sẽ nhận được các khuẩn lạc riêng rẽ từ các đĩa thứ + Lựa chọn các khuẩn lạc vi khuẩn riêng rẽ đặc trưng cho các mẫu sau đó cấy ria các khuẩn lạc đó ra đĩa môi trường để làm thuần

+ Các chủng vi sinh vật sau khi được làm thuần được giữ giống trong thạch nghiêng và trong glycerol bảo quản -80°C

2.4 Phương pháp nuôi cấy

Chủng vi khuẩn Photobacterium sp được hoạt hóa từ -800C bằng cách để rã đông từ từ trong đá trong 30 phút Sau đó được hút 0,2 ml vào trong ống nghiệm

23 10ml chứa 2 ml môi trường lỏng HKTS Nuôi ở 28oC trong 24h lắc ở 200 vòng/phút Hút 0,01 ml lên đĩa peptri chứa môi trường đặc và chải đều lên bề mặt thạch cho đến khô, nuôi ở 28oC trong 24h Chọn khuẩn lạc mọc tốt cấy chuyển vào ống nghiệm 15ml có chứa 6ml môi trường lỏng HKTS, nuôi ở trên máy lắc rung ở 28°C trong 24h lắc ở 200 vòng/phút, ta được giống cấp 1 để chuẩn bị cho việc nuôi giống cấp 2

Hình 2.1.Một số hình ảnh trong quá trình phân lập chủng vi sinh vật

Hút 6 ml dịch nuôi giống cấp 1 vào bình tam giác 100 ml có chứa 60 ml môi trường lỏng HKTS 28oC trong 24h, lắc ở 200 vòng/phút Kết quả thu được 60 ml giống cấp 2 Từ đây chuyển 50 ml giống cấp 2 vào bình tam giác 1000 ml có chứa

500 ml môi trường lỏng HKTS ở 37oC trong 5 ngày, lắc ở 200 vòng/phút Kết quả thu được 5 lít dịch tế bào, tiến hành ly tâm thu dịch ngoại bào để chuẩn bị cho nghiên cứu thành phần hóa học chủng vi sinh vật nghiên cứu

24 + Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: HKTS (Hiếu Khí Tổng Số):

2.5 Phương pháp tách chiết các hợp chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy vi sinh vật

Chủng vi khuẩn Photobacterium sp được nuôi cấy thu được 5 lít dịch, dịch

nuôi cấy của chủng vi khuẩn sau 5 ngày nuôi cấy được ly tâm 12000 vòng trong 10 phút, thu dịch bỏ cặn tế bào Sau đó cô dịch nước dưới áp suất giảm thu được 105 g cặn thô, ngâm chiết bằng Etyl axetat 5 lần (3h/lần), sau đó ngâm chiết bằng MeOH

5 lần (5h/lần), loại dung môi thu được cặn chiết EtOAc và MeOH tương ứng Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất từ dịch

ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Photobacterium sp

Để phân tích và phân tách dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật, chúng tôi

đã sử dụng các phương pháp sắc ký như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát), sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột nhanh với pha tĩnh là silicagel (Merck), sắc ký cột pha đảo với chất hấp phụ là RP-18 và sắc ký rây phân tử sephadex LH-20

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn silica gel

60 F254 của hãng Merck có độ dày 0,25 mm Dung môi triển khai sắc ký là hỗn hợp

của một trong số các dung môi thường dùng như: n-hexan, diclorometan, etylaxetat,

axeton, metanol, cồn…

Sắc ký cột chỉ dùng cột thường với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,063-0,200

mm (70-230 Mesh) của hãng Merck, rửa giải chủ yếu bằng các hệ dung môi hexan/diclorometan, n-hexan/etylaxetat, n-hexan/axeton, diclorometan/metanol,

n-diclorometan/etyl axetat… với các tỷ lệ khác nhau

25 Sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh là RP-18 và hệ dung môi rửa giải là MeOH/H2O

Sắc ký cột sử dụng LH-20 làm pha tĩnh thường được rửa giải bằng metanol hoặc hệ metanol/diclorometan (9/1 hoặc 8/2)

2.6 Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật

Việc phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất sạch từ dịch

ngoại bào nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp nhờ sự phối hợp các dữ kiện

thu được từ các phương pháp phổ như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (COSY, HSQC, HMBC, NOESY)

Phổ hồng ngoại được đo trên máy FTIR-Impact-410 (tại Viện Hóa học)bằng phương pháp viên nén KBr Phổ khối được đo trên máy Quardrupole LC/MS- Agilent Technologes theo kiểu phun mù điện tử (ESI) tại Viện Hóa Sinh biển-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều

và hai chiều được đo trên máy Brucker Avance 500 (500 MHz), sử dụng TMS làm chất chuẩn nội tại Viện Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Độ quay cực được đo bằng máy Tasco P-2000 của hãng Jassco - Mỹ, điểm nóng chảy được đo trên máy Mel Temp 3.0 của hãng Thermo Scientific - Mỹ tại Viện Hóa Sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.7 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

2.7.1 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào

Các chất được phân lập từ dịch ngoại bào chủng vi khuẩn Photobacterium sp

được thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Phương pháp thử độ

độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử

26 độc chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng ức chế sự phát triển của tế

bào ung thư KB-ung thư biểu mô (CCL-17TM) ở điều kiện in vitro Sử dụng phương

pháp MTT assay: Tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung 10% huyết thanh ở điều kiện 37oC, 5% CO2, độ ẩm 95% Nồng độ tế bào dùng cho thử độc tính là 3x104/ mL Chất thử được pha loãng thành một dãy nồng độ thích hợp và được ủ cùng tế bào nuôi ở 37oC, 5% CO2/ 3 ngày Sau 72 giờ nuôi cấy ủ với MTT 0,2 mg/mL trong 4 giờ Dừng phản ứng với DMSO Đọc OD trên máy quang phổ bước sóng 540 nm Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự tăng trưởng của tế bào) được tính toán dựa trên số liệu phần trăm kìm hãm phát triển của tế bào bằng phần mền máy tính table curve [37]

2.7.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thử theo phương pháp pha loãng

đa nồng độ F Hadacek và H Greger [29] Vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người được sử dụng trong phép thử gồm:

- Bacillus subtilis: là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử không gây bệnh

- Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (-), gây mủ các vết thương, vết

bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng

- Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột

lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hóa của người và động vật

- Escherichia coli: vi khuẩn gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu hóa

như viên dạ dầy, viên đại tràng, viên ruột, viên lỵ trực khuẩn

- Pseudomonas aeruginosa: vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gây

nhiễm trùng đường huyết gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột

- Salmonella enteric: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gây bệnh thương hàn,

nhiễm trùng đường ruột ở người và động vật

- Candida albicans: là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và các

bệnh phụ khoa

27 Môi trường nuôi cấy: MHB (Mueller- Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud - 2% dextrose broth) và SA (Sabouraud - 4% dextrose agar) cho nấm men Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành 1 dãy

5 nồng độ theo yêu cầu và mục đích thử Nồng độ thử cao nhất đối với dịch chiết

256 µg/ml và với chất sạch là 128 µg/ml Lấy 10 µl dung dịch mẫu thử ở các nồng

độ vào 96 giếng, thêm 200 µl dung dịch vi sinh vật kiểm định có nồng độ 5.105CFU/ ml, ủ ở 37oC/24h Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế sự phát triển của vi sinh vật Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mền raw data

28

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM

3.1 Xử lý mẫu và tách chiết, phân lập các chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy

chủng vi khuẩn Photobacterium sp

Chủng vi khuẩn Photobacterium sp được nuôi cấy sau 5 ngày thu được 5 lít

dịch, sau đó ly tâm 12000 vòng trong 10 phút, thu dịch bỏ cặn tế bào sau đó cô dịch nước dưới áp suất giảm thu được 105 g cặn thô Cặn chiết thô được tiến hành ngâm

chiết với etyl axetat và MeOH như được trình bày ở sơ đồ dưới đây (hình 3.1)

Hình 3.1.Sơ đồ chiết mẫu nuôi cấy chủng vi khuẩnPhotobacterium sp.

Quá trình phân lập các chất từ cặn MeOH được trình bày trong hình 3.2

Cặn chiết MeOH (23,5g) được tách thô trên cột silica gel sử dụng hệ dung môi etyl acetat/MeOH gradient thu được 9 phân đoạn ký hiệu từ FM1-FM9 Từ phân đoạn FM4, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH gradient thu được 8 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F4.1- F4.8 Tinh chế phân đoạn F4.2 bằng cột sephadex với hệ dung môi MeOH/ CH2Cl2= 90/10 thu được

11 mg chất FM4.2

29

Từ phân đoạn FM7, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH/H2O gradient thu được 6 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F7.1- F7.6 Tinh chế FM7.3 bằng cột sephadex với hệ dung môi MeOH/CH2Cl2= 80/20, sau đó tinh chế tiếp phân đoạn này bằng bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi

CH2Cl2/MeOH gradient thu được 8 mg chất FM7.3

Từ phân đoạn FM8, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH/ H2O gradient thu được 6 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F8.1- F8.6 Tinh chế phân đoạn F8.4 bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH/ H2O gradient thu được 15 mg chất FM8.4

Các phân đoạn FM1, FM2, FM3 được gom vào cặn etyl acetat

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập cặn chiết MeOH

Quá trình phân lập các chất cặn EtOAc được trình bày trong hình 3.3 Tiến

hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH gradient thu được 9 phân đoạn ký hiệu từ F1-F9 Từ phân đoạn F2, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel

với hệ dung môi n-hexan/ diclometan gradient thu được 5 phân đoạn nhỏ, ký hiệu

từ F2.1- F2.5 Tinh chế phân đoạn F2.2 bằng cột sắc ký cột silica gel với hệ dung

môi n-hexan/ diclometan gradient thu được 4,5 mg chất F2.2

30

Từ phân đoạn F3, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi

n-hexan/ aceton gradient thu được 5 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F3.1- F3.5 Tinh chế phân đoạn F3.3 bằng cột sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/ diclometan

gradient thu được 4 mg chất F3.3.1 và 3 mg chất F3.3.2

Hình 3.3.Sơ đồ phân lập cặn chiết EtOAc

Gộp 2 phân đoạn F4 và F5 (ký hiệu lại là F4-5), từ phân đoạn F4-5, sau khi

tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/ aceton gradient thu

được 7 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F5.1- F5.7 Tinh chế phân đoạn F5.1 bằng cột sắc

ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/ aceton gradient thu được 6 mg chất

F5.1.Tinh chế phân đoạn F5.4 bằng cột sắc ký cột silica gel với hệ dung môi

CH2Cl2/ EtOAc gradient thu được chất F5.4, chất này được kết tinh lại bằng hệ

n-hexan/ Aceton: 85/15 thu được 4 mg chất F5.4 Tinh chế phân đoạn F5.5 bằng cột

sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ EtOAc gradient thu được chất F5.5,

chất này được kết tinh lại bằng hệ n-hexan/ Aceton: 85/15 thu được 4 mg chất F5.5