Nghiên cứu các hợp chất ngoại bào của một số vi sinh vật đáy biển bắc bộ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM KHOA HỌC TỰ NHIÊN VIỆN HÓA HỌC VŨ VĂN NAM NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT NGOẠI BÀO CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐÁY BIỂN BẮC BỘ LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM KHOA HỌC TỰ NHIÊN VIỆN HÓA HỌC VŨ VĂN NAM NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT NGOẠI BÀO CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐÁY BIỂN BẮC BỘ Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 60.44.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TSKH Phạm Văn Cường Hà Nội - 2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn chân thành sâu sắc, xin trân trọng cảm ơn: Trước tiên, xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới TSKH Phạm Văn Cường hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình, động viên giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hóa học, Hội đồng Khoa học, Bộ phận đào tạo phòng chức giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hoá Sinh biển cổ vũ, động viên, tạo điều kiện cho học tập làm việc để tơi thực tốt cơng việc luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn TS Đoàn Thị Mai Hương TS Trịnh Thị Thanh Vân anh chị, bạn đồng nghiệp phòng Tổng hợp Hữu Trung tâm Nghiên cứu Phát triển thuốc – Viện Hóa Sinh biển giúp đỡ, đóng góp nhiều ý kiến quý báu suốt q trình thực luận văn Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè cổ vũ, động viên tơi hồn thành tốt luận văn Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Tác giả Vũ Văn Nam năm 2014 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT………………………… DANH MỤC CÁC BẢNG………………………………………………… DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ………………………………………………… DANH MỤC CÁC HÌNH…………………………………………………… DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC……………………………………………… ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan vi sinh vật biển 1.1.1 Vi sinh vật 1.1.2 Vai trò vi sinh vật tự nhiên 1.1.3 Vai trò vi sinh vật đời sống 1.1.4 Vi sinh vật biển 1.2 Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật biển Việt Nam 1.3 Nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học vi sinh vật biển giới 11 1.3.1 Hoạt tính kháng lao 13 1.3.2 Hoạt tính chống ung thư 14 1.3.3 Hoạt tính khác 16 1.4 Nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học vi sinh vật biển Việt Nam 18 1.5 Tổng quan đối tượng nghiên cứu vi khuẩn Photobacterium 20 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu, xác định tên khoa học 22 2.2 Phương pháp lấy mẫu 22 2.3 Phương pháp phân lập chủng vi sinh vật biển 22 2.4 Phương pháp nuôi cấy 22 2.5 Phương pháp tách chiết hợp chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy vi sinh vật 24 2.6 Các phương pháp phân tích, phân tách hỗn hợp phân lập hợp chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Photobacterium sp 24 2.7 Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học chất phân lập từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật 25 2.8 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 25 2.8.1 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào 25 2.8.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 26 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 28 3.1 Xử lý mẫu tách chiết, phân lập chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp 28 3.2 Hằng số vật lý kiện phổ hợp chất phân lập từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp 31 3.2.1 Các chất phân lập từ dịch chiết MeOH 31 3.2.2 Các chất phân lập từ dịch chiết Etyl axetat 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ dịch chiết MeOH 37 4.1.1 Hợp chất 1-(pyrrolidine-2’-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamide (FM8.4) 37 4.1.2 Hợp chất Uracil (FM7.3) 42 4.1.3 Hợp chất Cyclo-(Pro-Gly) (FM4.2) 42 4.2 Các chất phân lập từ cặn Etyl acetat 43 4.2.1 N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide (F5.5) 44 4.2.2 Hợp chất Cyclo-(Pro-Ala) (F5.4) 48 4.2.3 Hợp chất Cyclo-(Leu-Pro) (F5.1) 49 4.2.4 Hợp chất indole-3-carbonitrile (F3.3.1) 50 4.2.5 Hợp chất Thymine (F7.2) 51 4.2.6 Hợp chất 3-metyl pipererazine-2,5 dion (F8.2) 52 4.2.7 Hợp chất Axit benzoic (F2.2) 53 4.2.8 Hợp chất 4-(2-hydroxyethyl) phenol (F3.3.2) 53 4.3 Hoạt tính sinh học hợp chất phân lập 54 4.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào chất phân lập 54 4.3.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chất phân lập 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN TỚI LUẬN VĂN 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT NMR: Nuclear Magnetic Resonance (phổ cộng hưởng từ hạt nhân) Phổ cộng hưởng từ proton H-NMR: 13 C-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C DEPT: Distortionles Enhancement by Polarization Transfer (phổ DEPT) COSY: Homonuclear Correlated Spectroscopy HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation (phổ HMBC) HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence (phổ HMQC) HSQC: Heteronuclear Single Quantum Coherence (phổ HSQC) NOE: Nuclear Overhauser Effect (hiệu ứng NOE) NOESY: Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy (phổ NOESY) s: singlet qui: quintet b: broad d: doublet sxt: sextet dd: doublet of doublets t: triplet sep: septet dt: doublet of triplets q: quartet o: overlapping dq: doublet of quartets δH, δC: Độ chuyển dịch hóa học proton cacbon ppm: part per million (phần triệu) EIMS: Electron Inoniziation Mass Spectroscopy (phổ khối phun mù điện tử) HRMS: High Resolution Mass Spectroscopy (phổ khối phân giải cao) DMSO: Dimethylsulfoxide đnc: Điểm nóng chảy TLC: Thin Layer Chromatography (sắc ký lớp mỏng) CC: Column Chromatography (sắc ký cột) RP: Reverse Phase (sắc ký pha đảo) IC50 Nồng độ tác dụng ức chế 50% tế bào thử nghiệm MIC Nồng độ ức chế tối thiểu HKTS Hiếu khí tổng số Tên riêng hợp chất tự nhiên phân lập được viết theo nguyên tiếng Anh DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Số lượng số nhóm vi sinh vật mẫu nước biển trầm tích Cát Bà Bảng 1.2 Kết phân loại số chủng vi khuẩn thuộc Cát Bà Bảng 1.3 Kết phân loại số chủng nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn Cát Bà8 Bảng 1.4 Số lượng số chủng vi sinh vật tách mẫu nước biển Việt Nam Bảng 1.5.Xạ khuẩn từ đảo Cát Bà 11 Bảng 4.1 Dữ kiện phổ 1H-NMR (CD3OD; 500 MHz) 13 C-NMR (CD3OD; 125 MHz) FM8.4 39 Bảng 4.2 Dữ kiện phổ 1H-NMR (CD3OD; 500 MHz) 13 C-NMR (CD3OD; 125 MHz) F5.5 45 Bảng 4.3 Hoạt tính gây độc tế bào chất phân lập 54 Bảng 4.4.Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chất phân lập 55 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1.Hình ảnh số vi sinh vật Hình 2.1 Một số hình ảnh trình phân lập chủng vi sinh vật 23 Hình 3.1.Sơ đồ chiết mẫu nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp 28 Hình 3.2 Sơ đồ phân lập cặn chiết MeOH 29 Hình 3.3.Sơ đồ phân lập cặn chiết EtOAc 30 Hình 4.1 Cấu trúc hợp chất phân lập từ cặn MeOH 37 Hình 4.2 Phổ khối FM8.4 38 Hình 4.3 Phổ 1H-NMR giãn rộng FM8.4 39 Hình 4.4 Phổ 13C-NMR giãn rộng chất FM8.4 40 Hình 4.5 Phổ COSY chất FM8.4 40 Hình 4.6 Phổ HMBC chất FM8.4 41 Hình 4.7 Một số tương tác phổ HMBC COSY chất FM8.4 41 Hình 4.8 Một số tương tác phổ HMBC ( ) chất FM4.2 43 Hình 4.9 Cấu trúc hợp chất phân lập từ cặn Etyl acetat 44 Hình 4.10 Phổ khối chất F5.5 45 Hình 4.11 Phổ 1H-NMR chất F5.5 46 Hình 4.12 Phổ 13C-NMR chất F5.5 47 Hình 4.13 Phổ COSY chất F5.5 47 Hình 4.14 Phổ HMBC chất F5.5 47 Hình 4.15 Tương tác phổ COSY ( ) , HMBC ( ) chất F5.5 48 Hình 4.16 Tương tác phổ HMBC ( ) chất F5.4 49 Hình 4.17 Tương tác phổ HMBC ( ) chất F5.1 50 Hình 4.18 Tương tác phổ HMBC ( ) chất F3.3.1 51 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục Phổ hợp chất 1-(pyrrolidine-2’-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamide (FM8.4) PL1 Phụ lục Phổ hợp chất Uracil (FM7.3) PL5 Phụ lục Phổ hợp chất Cyclo-(Pro-Gly) (FM4.2) PL7 Phụ lục Phổ hợp chất N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide (F5.5) PL11 Phụ lục Phổ hợp chất Cyclo-(Pro-Ala) (F5.4) PL15 Phụ lục Phổ hợp chất Cyclo-(Leu-Pro) (F5.1) PL19 Phụ lục Phổ hợp chất Indole-3-carbonitrile (F3.3.1) PL23 Phụ lục Phổ hợp chất Thymine (F7.2) PL27 Phụ lục Phổ hợp chất 3-methylpiperazine-2,5-dione (F8.2) PL29 Phụ lục 10 Phổ hợp chất Axit benzoic (F2.2) PL31 Phụ lục 11 Phổ hợp chất 4-(2-hydroxyethyl)phenol (F3.3.2) PL34 PL-21 PL-22 Phụ lục 7: Phổ hợp chất Indole-3-carbonitrile (F3.3.1) PL-23 PL-24 PL-25 PL-26 Phụ lục 8: Phổ hợp chất Thymine (F7.2) PL-27 PL-28 Phụ lục 9: Phổ hợp chất 3-methylpiperazine-2,5-dione (F8.2) PL-29 PL-30 Phụ lục 10: Phổ hợp chất Axit benzoic (F2.2) PL-31 PL-32 PL-33 Phụ lục 11: Phổ hợp chất 4-(2-hydroxyethyl)phenol (F3.3.2) PL-34 PL-35 ... HỌC VI? ??N HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI? ??T NAM KHOA HỌC TỰ NHIÊN VI? ??N HÓA HỌC VŨ VĂN NAM NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT NGOẠI BÀO CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐÁY BIỂN BẮC BỘ Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: ... 1.1.1 Vi sinh vật 1.1.2 Vai trò vi sinh vật tự nhiên 1.1.3 Vai trò vi sinh vật đời sống 1.1.4 Vi sinh vật biển 1.2 Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật biển Vi? ??t... chống ung thư hợp chất thứ cấp loài vi sinh vật biển sản sinh cho thấy vi sinh vật biển nguồn quan trọng nghiên cứu tìm kiếm chất có hoạt tính sinh học Trong số hợp chất này, nhiều hợp chất có chứa