Chủng vi khuẩn Photobacterium sp. được hoạt hóa từ -800C bằng cách để rã đông từ từ trong đá trong 30 phút. Sau đó được hút 0,2 ml vào trong ống nghiệm
23
10ml chứa 2 ml môi trường lỏng HKTS. Nuôi ở 28oC trong 24h lắc ở 200 vòng/phút. Hút 0,01 ml lên đĩa peptri chứa môi trường đặc và chải đều lên bề mặt thạch cho đến khô, nuôi ở 28oC trong 24h. Chọn khuẩn lạc mọc tốt cấy chuyển vào ống nghiệm 15ml có chứa 6ml môi trường lỏng HKTS, nuôi ở trên máy lắc rung ở 28°C trong 24h lắc ở 200 vòng/phút, ta được giống cấp 1 để chuẩn bị cho việc nuôi giống cấp 2.
Hình 2.1.Một số hình ảnh trong quá trình phân lập chủng vi sinh vật
Hút 6 ml dịch nuôi giống cấp 1 vào bình tam giác 100 ml có chứa 60 ml môi trường lỏng HKTS 28oC trong 24h, lắc ở 200 vòng/phút. Kết quả thu được 60 ml giống cấp 2. Từ đây chuyển 50 ml giống cấp 2 vào bình tam giác 1000 ml có chứa 500 ml môi trường lỏng HKTS ở 37oC trong 5 ngày, lắc ở 200 vòng/phút. Kết quả thu được 5 lít dịch tế bào, tiến hành ly tâm thu dịch ngoại bào để chuẩn bị cho nghiên cứu thành phần hóa học chủng vi sinh vật nghiên cứu.
24
+ Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: HKTS (Hiếu Khí Tổng Số):
Thành phần môi trường HKTS (g/lít) Peptone 5 Cao thịt 3 Cao men 0,2 NH4NO3 2 KH2PO4 1 NaCl 10 MgSO4 1,2 Agar 20 Glucose 1 pH 7
2.5.Phương pháp tách chiết các hợp chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy vi sinh vật
Chủng vi khuẩn Photobacterium sp. được nuôi cấy thu được 5 lít dịch, dịch nuôi cấy của chủng vi khuẩn sau 5 ngày nuôi cấy được ly tâm 12000 vòng trong 10 phút, thu dịch bỏ cặn tế bào. Sau đó cô dịch nước dưới áp suất giảm thu được 105 g cặn thô, ngâm chiết bằng Etyl axetat 5 lần (3h/lần), sau đó ngâm chiết bằng MeOH 5 lần (5h/lần), loại dung môi thu được cặn chiết EtOAc và MeOH tương ứng. Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Photobacterium sp.
Để phân tích và phân tách dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật, chúng tôi đã sử dụng các phương pháp sắc ký như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát), sắc ký cột thường (CC), sắc ký cột nhanh với pha tĩnh là silicagel (Merck), sắc ký cột pha đảo với chất hấp phụ là RP-18 và sắc ký rây phân tử sephadex LH-20.
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn silica gel 60 F254 của hãng Merck có độ dày 0,25 mm. Dung môi triển khai sắc ký là hỗn hợp của một trong số các dung môi thường dùng như: n-hexan, diclorometan, etylaxetat, axeton, metanol, cồn….
Sắc ký cột chỉ dùng cột thường với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,063-0,200 mm (70-230 Mesh) của hãng Merck, rửa giải chủ yếu bằng các hệ dung môi n- hexan/diclorometan, n-hexan/etylaxetat, n-hexan/axeton, diclorometan/metanol, diclorometan/etyl axetat… với các tỷ lệ khác nhau.
25
Sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh là RP-18 và hệ dung môi rửa giải là MeOH/H2O.
Sắc ký cột sử dụng LH-20 làm pha tĩnh thường được rửa giải bằng metanol hoặc hệ metanol/diclorometan (9/1 hoặc 8/2).
2.6.Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật.
Việc phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất sạch từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp. nhờ sự phối hợp các dữ kiện thu được từ các phương pháp phổ như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (COSY, HSQC, HMBC, NOESY).
Phổ hồng ngoại được đo trên máy FTIR-Impact-410 (tại Viện Hóa học)bằng phương pháp viên nén KBr. Phổ khối được đo trên máy Quardrupole LC/MS- Agilent Technologes theo kiểu phun mù điện tử (ESI) tại Viện Hóa Sinh biển-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều được đo trên máy Brucker Avance 500 (500 MHz), sử dụng TMS làm chất chuẩn nội tại Viện Hóa học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Độ quay cực được đo bằng máy Tasco P-2000 của hãng Jassco - Mỹ, điểm nóng chảy được đo trên máy Mel Temp 3.0 của hãng Thermo Scientific - Mỹ tại Viện Hóa Sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.7.Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
2.7.1.Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào
Các chất được phân lập từ dịch ngoại bào chủng vi khuẩn Photobacterium sp.
được thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử
26
độc chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư KB-ung thư biểu mô (CCL-17TM) ở điều kiện in vitro. Sử dụng phương pháp MTT assay: Tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung 10% huyết thanh ở điều kiện 37oC, 5% CO2, độ ẩm 95%. Nồng độ tế bào dùng cho thử độc tính là 3x104/ mL. Chất thử được pha loãng thành một dãy nồng độ thích hợp và được ủ cùng tế bào nuôi ở 37oC, 5% CO2/ 3 ngày. Sau 72 giờ nuôi cấy ủ với MTT 0,2 mg/mL trong 4 giờ. Dừng phản ứng với DMSO. Đọc OD trên máy quang phổ bước sóng 540 nm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự tăng trưởng của tế bào) được tính toán dựa trên số liệu phần trăm kìm hãm phát triển của tế bào bằng phần mền máy tính table curve [37].
2.7.2.Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thử theo phương pháp pha loãng đa nồng độ F. Hadacek và H. Greger [29]. Vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người được sử dụng trong phép thử gồm:
- Bacillus subtilis: là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử không gây bệnh. - Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (-), gây mủ các vết thương, vết
bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng. - Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột
lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hóa của người và động vật. - Escherichia coli: vi khuẩn gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu hóa (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
như viên dạ dầy, viên đại tràng, viên ruột, viên lỵ trực khuẩn.
- Pseudomonas aeruginosa: vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm trùng đường huyết gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột.
- Salmonella enteric: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng đường ruột ở người và động vật.
- Candida albicans: là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và các bệnh phụ khoa.
27
Môi trường nuôi cấy: MHB (Mueller- Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud - 2% dextrose broth) và SA (Sabouraud - 4% dextrose agar) cho nấm men. Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành 1 dãy 5 nồng độ theo yêu cầu và mục đích thử. Nồng độ thử cao nhất đối với dịch chiết 256 µg/ml và với chất sạch là 128 µg/ml. Lấy 10 µl dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào 96 giếng, thêm 200 µl dung dịch vi sinh vật kiểm định có nồng độ 5.105 CFU/ ml, ủ ở 37oC/24h. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mền raw data.
28
CHƯƠNG 3.THỰC NGHIỆM
3.1.Xử lý mẫu và tách chiết, phân lập các chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp. chủng vi khuẩn Photobacterium sp.
Chủng vi khuẩn Photobacterium sp. được nuôi cấy sau 5 ngày thu được 5 lít dịch, sau đó ly tâm 12000 vòng trong 10 phút, thu dịch bỏ cặn tế bào sau đó cô dịch nước dưới áp suất giảm thu được 105 g cặn thô. Cặn chiết thô được tiến hành ngâm chiết với etyl axetat và MeOH như được trình bày ở sơ đồ dưới đây (hình 3.1).
Hình 3.1.Sơ đồ chiết mẫu nuôi cấy chủng vi khuẩnPhotobacterium sp.
Quá trình phân lập các chất từ cặn MeOH được trình bày trong hình 3.2.
Cặn chiết MeOH (23,5g) được tách thô trên cột silica gel sử dụng hệ dung môi etyl acetat/MeOH gradient thu được 9 phân đoạn ký hiệu từ FM1-FM9. Từ phân đoạn FM4, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH gradient thu được 8 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F4.1- F4.8. Tinh chế phân đoạn F4.2 bằng cột sephadex với hệ dung môi MeOH/ CH2Cl2= 90/10 thu được 11 mg chất FM4.2.
29
Từ phân đoạn FM7, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH/H2O gradient thu được 6 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F7.1- F7.6. Tinh chế FM7.3 bằng cột sephadex với hệ dung môi MeOH/CH2Cl2= 80/20, sau đó tinh chế tiếp phân đoạn này bằng bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/MeOH gradient thu được 8 mg chất FM7.3.
Từ phân đoạn FM8, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH/ H2O gradient thu được 6 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F8.1- F8.6. Tinh chế phân đoạn F8.4 bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH/ H2O gradient thu được 15 mg chất FM8.4.
Các phân đoạn FM1, FM2, FM3 được gom vào cặn etyl acetat.
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập cặn chiết MeOH
Quá trình phân lập các chất cặn EtOAc được trình bày trong hình 3.3. Tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH gradient thu được 9 phân đoạn ký hiệu từ F1-F9. Từ phân đoạn F2, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/ diclometan gradient thu được 5 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F2.1- F2.5. Tinh chế phân đoạn F2.2 bằng cột sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/ diclometan gradient thu được 4,5 mg chất F2.2.
30
Từ phân đoạn F3, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi
n-hexan/ aceton gradient thu được 5 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F3.1- F3.5. Tinh chế phân đoạn F3.3 bằng cột sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/ diclometan gradient thu được 4 mg chất F3.3.1 và 3 mg chất F3.3.2.
Hình 3.3.Sơ đồ phân lập cặn chiết EtOAc
Gộp 2 phân đoạn F4 và F5 (ký hiệu lại là F4-5), từ phân đoạn F4-5, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/ aceton gradient thu được 7 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F5.1- F5.7. Tinh chế phân đoạn F5.1 bằng cột sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexan/ aceton gradient thu được 6 mg chất
F5.1.Tinh chế phân đoạn F5.4 bằng cột sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ EtOAc gradient thu được chất F5.4, chất này được kết tinh lại bằng hệ n- hexan/ Aceton: 85/15 thu được 4 mg chất F5.4. Tinh chế phân đoạn F5.5 bằng cột sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ EtOAc gradient thu được chất F5.5,
31
Từ phân đoạn F7, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH gradient thu được 3 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F7.1- F7.3. Tinh chế phân đoạn F7.2 bằng cột sephadex với hệ dung môi MeOH/ CH2Cl2: 85/15 thu được 4 mg chất F7.2.
Từ phân đoạn F8, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ MeOH gradient thu được 4 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F8.1- F8.4. Tinh chế phân đoạn F8.2 bằng bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2/ EtOAc gradient thu được thu được 7 mg chất F8.2.
3.2.Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp. ngoại bào nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp.
3.2.1.Các chất phân lập được từ dịch chiết MeOH (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
1-(pyrrolidine-2’-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamide (FM8.4)
Chất dầu màu vàng; Rf= 0,35 (CH2Cl2/ MeOH: 80/20); Độ quay cực [α]D25-97,5o (c 0,52; MeOH). ESI-MS: m/z 212 [M+H]+ (C10H17N3O2). IR (KBr) νmax (cm-1) 3461; 3297; 1645; 1586; 1388; 583; 493. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH (ppm) 2,05 (4H, m, CH2-4 + H-3’α + H- 4’α); 2,20 (1H, m; H-4’β); 2,37 (1H, m, H-3’β); 2,39 (2H, m, CH2-3); 3,68 (2H, m; CH2-5); 4,35 (1H, m, H-5’α); 4,43 (1H, m, H-5’β); 4,47 (1H, dd, J= 2,5; 9,0 Hz; H- 2’); 5,12 (1H, dd, J= 3,0; 8,5 Hz; H-2). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC (ppm) 22,2 (C-4); 24,0 (C-4’); 29,3 (C- 3’); 30,3 (C-3); 47,1 (C-5); 51,6 (C-5’); 61,7 (C-2’); 65,7 (C-2); 175,0 (C-6’); 177,1 (C-6).
32 Uracil (FM7.3) Chất rắn màu trắng; đnc. 320- 323oC; Rf= 0,45 (CH2Cl2/ MeOH/ H2O: 77/20/3 ). ESI-MS: m/z 111 [M-H]- (C4H4N2O2). IR (KBr) νmax (cm-1) 3484; 1721; 1650; 1416; 1233; 539; 508. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD &CDCl3): δH (ppm) 5,63 (1H, d, J= 8,0 Hz; H- 5); 7,35 (1H, d, J= 8,0 Hz; H-6). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD & CDCl3): δC (ppm) 100,3 (C-5); 142,2 (C-6); 151,6 (C-2); 164,4 (C-4). Cyclo-(Pro-Gly) (FM4.2)
Chất rắn màu trắng; đnc. 213oC; Rf= 0,55 (CH2Cl2/ MeOH: 90/10); Độ quay cực [α]D25 -153,6o (c 0,46; MeOH). ESI-MS: m/z 155 [M+H]+ (C7H10N2O2). IR (KBr) νmax (cm-1) 3406; 2929; 1744; 1650; 1431; 1382; 707; 543. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH (ppm) 1,98 (1H, m, H-4α); 2,01 (1H, m, H-5α); 2,05 (1H, m, H-4β); 2,34 (1H, m, H-5β); 3,56 (2H, m, CH2-3); 3,76 (1H, d, J= 17,0 Hz; H-9α); 4,13 (1H, dt, J= 17,0 Hz; H-9β); 4,25 (1H, td, J= 2,0; 9,0 Hz; H-6). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC (ppm) 23,3 (C-4); 29,4 (C-5); 46,3 (C-3); 46,9 (C-9); 59,8 (C-6); 166,5 (C-1); 172,0 (C-7).
33
3.2.2.Các chất phân lập được từ dịch chiết Etyl axetat
N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide (F5.5) Chất rắn màu trắng; đnc. 155- 156oC; Rf= 0,45 ( CH2Cl2/ MeOH: 9/1); [α]D25 +12o (c 0,20; MeOH). ESI-MS: m/z 193 [M+Na]+ (C8H14N2O2). IR (KBr) νmax (cm-1) 3409; 2939; 1642; 1441; 542; 440; 483. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH (ppm) 1,42 (1H, m, H-6a); 1,49 (1H, m, H-4a); 1,87 (2H, m, H-6b + H-5a); 2,00 (1H, m, H-5b); 2,01 (3H, s, CH3); 2,09 (1H, m, H-4b); 3,27 (2H, m, CH2-7); 4,52 (1H, m, CH-3); 6,92 (1H, s, NH); 7,29 (1H, s, NH). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC (ppm) 23,3 (CH3); 27,9 (C-5); 28,9 (C-6); 31,7 (C-4); 42,2 (C-7); 52,2 (C-3); 169,3 (C-9); 175,7 (C-2). Cyclo-(Pro-Ala) (F5.4) Chất rắn màu trắng; đnc. 140- 141oC; Rf= 0,35 (CH2Cl2/ EtOAc: 80/20); Độ quay cực [α]D25 -78,2o (c 0,32; MeOH). ESI-MS: m/z 207 [M+K]+ (C8H12N2O2). IR (KBr) νmax (cm-1) 3421; 2929;1660; 1558; 1440; 1180; 607. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH (ppm) 1,47 (3H, d, J= 7,0 Hz, CH3-10); 1,91 (1H, m, H-4α); 2,04 (1H, m, H-4β); 2,14 (1H, m, H-5α); 2,35 (1H, m, H-5β); 3,57 (2H, m, CH2-3); 4,12 (2H, m, H-6 + H-9).
34
13
C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC (ppm) 16,0 (CH3-10); 22,8 (C-4); 28,2 (C- 5); 45,5 (C-3); 51,2 (C-9); 59,3 (C-6); 166,3 (C-1); 170,3 (C-7).
Cyclo-(Leu-Pro) (F5.1)
Chất rắn màu trắng; đnc. 147- 148oC; Rf= 0,41 (n-hexan/ Aceton: 70/30); Độ quay cực [α]D25 -83,8o (c 0,18; MeOH). ESI-MS: m/z 249 [M+K]+(C11H18N2O2). IR (KBr) νmax (cm-1) 3475; 2929;1663; 1557; 1180; 607. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH (ppm) 0,95 (3H, d, J= 6,5 Hz, CH3-13); 1,00 (3H, d, J= 6,5 Hz, CH3-12); 1,52 (1H, ddd, J= 5,0; 9,5; 14,5 Hz; H-10α); 1,73 (1H, m, H-11); 1,91 (1H, m, H-4α); 2,05 (1H, m, H-4β); 2,08 (1H, m, H-10β); 2,13 (1H, m, H-5α); 2,34 (1H, m, H-5β); 3,56 (2H, m, CH2-3); 4,02 (1H, dd, J= 3,5; 9,5 Hz; H-9); 4,12 (1H, t, J= 8,0 Hz; H-6). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC (ppm) 21,2 (C-13); 22,7 (C-4); 23,3 (C-12); 24,7 (C-11); 28,1 (C-5); 38,7 (C-10); 45,5 (C-3); 53,4 (C-9); 59,0 (C-6); 166,2 (C- 1); 170,2 (C-7). Indole-3-carbonitrile (F3.3.1) Chất rắn màu trắng; đnc. 178- 179oC; Rf= 0,35 (n-hexan/ CH2Cl2: 3/7)
35 ESI-MS: m/z 143 [M+H]+ (C9H6N2). IR (KBr) νmax (cm-1) 3413, 3265, 2918, 2219, 1626, 1436 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH (ppm) 7,31 (1H, dt, J= 1,5; 7,5 Hz; H-6); 7,35 (1H, dt, J= 1,0; 7,5 Hz; H-5); 7,47 (1H; d, J= 7,5 Hz; H-7); 7,74 (1H; d, J= 3,0 Hz; H-2); 7,79 (1H; J= 7,5 Hz; H-4). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC (ppm) 87,9 (C-3); 111,9 (C-7); 115,7 (C-8); 119,8 (C-4); 122,5 (C-6); 124,4 (C-5); 127,0 (C-3a); 131,7 (C-2); 134,9 (C-7a). Thymine (F7.2) Chất rắn màu trắng; đnc. 320- 323oC; Rf= 0,35 (CH2Cl2/ MeOH: 90/10). ESI-MS: m/z 127 [M+H]+ (C5H6N2O2). IR (KBr) νmax (cm-1) 3442; 2926; 1731; 1673; 1436; 1206; 854; 547; 483. 1 H-NMR (500 MHz, CD3OD &CDCl3): δH (ppm) 1,87 (3H, s, CH3); 7,15 (1H, s, H-6). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD & CDCl3): δC (ppm) 12,2 (CH3); 110,3 (C-5); 138,6 (C-6); 156,5 (C-2), 168,9 (C-4). 3-methylpiperazine-2,5-dione (F8.2) Chất rắn màu trắng; đnc. 228-229oC; Rf= 0,55 (CH2Cl2/ EtOAc: 20/80); Độ quay cực [α]D25 -68,3o (c 0,36; MeOH).
36 ESI-MS: m/z 129 [M+H]+ (C5H8N2O2). IR (KBr) νmax (cm-1) 3461; 2930; 1662; 1464; 1102; 598; 546; 468. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δH (ppm) 1,25 (3H, d, J=7,0 Hz; CH3); 3,72 (2H, s, CH2-6); 3,84 (1H, quartet, J=7,0 Hz; CH-3); 7,97 (1H, s, NH); 8,15 (1H, s, NH). 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): δC (ppm) 18,7 (CH3); 44,5 (CH2-6); 49,7 (CH-3); 166,3 (C-5); 168,9 (C-2). Axit benzoic (F2.2)
Tinh thể hình kim không màu, đnc. 122-123 oC, Rf = 0,34 (n- hexan/ EtOAc: 70/30). IR (KBr) νmax ( cm-1): 3060- 2565, 1682, 1577, 1423, 1291, 1186, 1054, 935, 803, 714, 652, 543, 466. ESI-MS: m/z 121 [M-H]- (C7H6O2). 1H-NMR (500 MHz, CD3OD & CDCl3): δH (ppm) 7,98 (2H, d, J=7,5 Hz, H- 2+ H6); 7,42 (1H, t, J=7,0 Hz, H-4); 7,35 (2H, t, J=7,5 Hz, H-3+H-5). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD & CDCl3): δC (ppm) 127,30 (C-3 + C-5); 128,78 (C-1); 130,49 (C-2 + C6); 135,1 (C-4); 172,3 (C=O). 4-(2-hydroxyethyl) phenol (F3.3.2) Chất rắn màu trắng; đnc. 91-92oC; Rf= 0,35 ( n-hexan/ CH2Cl2: 70/30). ESI-MS: m/z 139 [M+H]+ (C8H10O2). 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH (ppm) 3,32 (2H, t, J = 7,5 Hz; H-7); 4,57 (2H, t, J = 7,0 Hz; H-8); 6,79 (2H, d, J = 8,5 Hz; H-2+ H-6); 7,07 (2H, d, J = 8,5 Hz; H-3+ H-5).
37
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ dịch chiết MeOH chiết MeOH
Quá trình xử lý mẫu, chiết và phân lập các hợp chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng Photobacterium sp. đã được trình bày chi tiết trong mục 3.1. Từ cặn chiết MeOH, đã có 3 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học gồm 1- (pyrrolidine-2-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamide (FM8.4); Uracil (FM7.3);