Thiết kế vector amirna đặc hiệu nhằm ức chế sự tái bản của begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá ở cà chua

MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mụ hình viii 1 MỞ ðẦU 1 1.1 Tính cấp thiết của ñề tài 1 1.2 Mục ñích: 3 1.3 Yêu cầu 3 1.4. Ý nghĩa khoa học: 4 1.5. Ý nghĩa thực tiễn: 4 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 2.1 Tình hình nghiên cứu về Tomato yellow leaf curl disease TYLCD 5 2.1.1 Trên thế giới 5 2.1.2. Ở Việt Nam 6 2.2. Bệnh xoăn vàng lá cà chua 7 2.2.1 Triệu chứng bệnh 7 2.2.2 Tác nhân gây bệnh 7 2.3 ðặc ñiểm tác nhân gây bệnh 8 2.3.1 ðặc ñiểm genome của begomovirus 8 2.3.2 Tương tác giữa tác nhân gây bệnh và ký chủ 12 2.4 Phân loại TYLCV 13 2.5 Lan truyền 15 2.6 Biện pháp phòng trừ 15 2.7 ðặc ñiểm và con ñường truyền bệnh 17 2.7.1 Tái sinh của begomovirus 18 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv 2.7.2 Cơ chế gây bệnh của begomovirus 19 2.8 Phòng trừ begomovirus 19 2.9 Bệnh do Begomovirus: 20 2.9.1 Bệnh khảm lá sắn 20 2.9.2 Bệnh cuốn lá bông 21 2.10 RNAi 22 2.10.1 Lịch sử phát hiện 22 2.10.2 Các phân tử RNA kích thước nhỏ (sRNA) 24 2.10.3 Ứng dụng công nghệ RNAi ở thực vật 31 2.10.4 Ứng dụng RNAi trong nghiên cứu trên cà chua 36 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 3.1 Vật liệu 39 3.1.1 Trình tự virus: 39 3.1.2 Plasmid 42 3.1.3 Vi khuẩn 42 3.2 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu: 42 3.2.1 ðịa ñiểm nghiên cứu 42 3.2.2 Thời gian nghiên cứu: 32011 – 820123.3. Phương pháp nghiên cứu 43 3.3.1 Phương pháp tìm kiếm và so sánh trình tự gen 43 3.3.2 Thiết kế amiRNA 43 c. Nhân dòng cấu trúc preamiRNA 45 3.3.3 Thiết kế vector biểu hiện ở thực vật mang amiRNA 47 3.3.4 Biến nạp vector pPS1 + pre – amiRNA vào Agrobacterium tumefaciens. 48 3.4 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu: 49 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 4.1 Thiết kế amiRNA 50 4.1.1 Lựa chọn vùng gen mục tiêu 50 4.1.2 Thiết kế cấu trúc amiRNA 58 4.2 Thiết kế vector chuyển gen vào cà chua trên thực nghiệm 61 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… v 4.2.1 Thay thế cấu trúc amiRNA tự nhiên bằng amiRNA nhân tạo 61 4.2.2 Kết quả PCR 61 4.2.2 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào trong tế bào khả biến E.coli chủng TOP10 64 4.2.3 Xác ñịnh trình tự của cấu trúc premiRNA có mang miRNA nhân tạo trong plasmid tái tổ hợp. 65 4.2.4 Cắt pJET 1.2 blunt chứa premiRNA và pPS1 bằng enzyme Xho và XbaI 67 4.2.5. Tạo vector pPS1 mang amiRNA1 precursor 69 4.2.6 Tạo vector pPS1 mang pre miRNA 73 4.2.7 Biến nạp vector pPS1 – TomiRNA vào tế bào khả biến A. tumefaciens chủng LBA4404. 73 4.2.8 Kiểm tra khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp 74 5 KẾT LUẬN 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO: 82 PHỤ LỤC 91

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI PHẠM THỊ THU HẰNG THIẾT KẾ VECTOR AMIRNA ðẶC HIỆU NHẰM ỨC CHẾ SỰ TÁI BẢN CỦA Begomovirus GÂY BỆNH XOĂN VÀNG LÁ Ở CÀ CHUA” LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số : 60 42 80 Người hướng dẫn khoa học : TS. NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO HÀ NỘI - 2012 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng: Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng ñược sử dụng hoặc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược ghi rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Phạm Thị Thu Hằng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ii LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn ñến các thầy cô giáo trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Viện ðào tạo sau ñại học và các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học, bộ môn CNSH Thực vật ñã trang bị cho tôi những kiến thức cơ bản và có ñịnh hướng ñúng ñắn trong quá trình học tập. ðặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến T.S Nguyễn Thị Phương Thảo ñã dành nhiều thời gian trực tiếp chỉ bảo, hướng dẫn tôi hoàn thành tốt luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ñến toàn thể các cán bộ trong bộ môn CNSH Thực vật - khoa Công nghệ sinh học ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi giúp ñỡ tôi trong quá trình thực tập. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia ñình, bạn bè ñã giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực tập tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2012 Học viên Phạm Thị Thu Hằng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mụ hình viii 1 MỞ ðẦU 1 1.1 Tính cấp thiết của ñề tài 1 1.2 Mục ñích: 3 1.3 Yêu cầu 3 1.4. Ý nghĩa khoa học: 4 1.5. Ý nghĩa thực tiễn: 4 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 2.1 Tình hình nghiên cứu về Tomato yellow leaf curl disease - TYLCD 5 2.1.1 Trên thế giới 5 2.1.2. Ở Việt Nam 6 2.2. Bệnh xoăn vàng lá cà chua 7 2.2.1 Triệu chứng bệnh 7 2.2.2 Tác nhân gây bệnh 7 2.3 ðặc ñiểm tác nhân gây bệnh 8 2.3.1 ðặc ñiểm genome của begomovirus 8 2.3.2 Tương tác giữa tác nhân gây bệnh và ký chủ 12 2.4 Phân loại TYLCV 13 2.5 Lan truyền 15 2.6 Biện pháp phòng trừ 15 2.7 ðặc ñiểm và con ñường truyền bệnh 17 2.7.1 Tái sinh của begomovirus 18 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv 2.7.2 Cơ chế gây bệnh của begomovirus 19 2.8 Phòng trừ begomovirus 19 2.9 Bệnh do Begomovirus: 20 2.9.1 Bệnh khảm lá sắn 20 2.9.2 Bệnh cuốn lá bông 21 2.10 RNAi 22 2.10.1 Lịch sử phát hiện 22 2.10.2 Các phân tử RNA kích thước nhỏ (sRNA) 24 2.10.3 Ứng dụng công nghệ RNAi ở thực vật 31 2.10.4 Ứng dụng RNAi trong nghiên cứu trên cà chua 36 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 3.1 Vật liệu 39 3.1.1 Trình tự virus: 39 3.1.2 Plasmid 42 3.1.3 Vi khuẩn 42 3.2 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu: 42 3.2.1 ðịa ñiểm nghiên cứu 42 3.2.2 Thời gian nghiên cứu: 3/2011 – 8/20123.3. Phương pháp nghiên cứu 43 3.3.1 Phương pháp tìm kiếm và so sánh trình tự gen 43 3.3.2 Thiết kế amiRNA 43 c. Nhân dòng cấu trúc pre-amiRNA 45 3.3.3 Thiết kế vector biểu hiện ở thực vật mang amiRNA 47 3.3.4 Biến nạp vector pPS1 + pre – amiRNA vào Agrobacterium tumefaciens. 48 3.4 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu: 49 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 4.1 Thiết kế amiRNA 50 4.1.1 Lựa chọn vùng gen mục tiêu 50 4.1.2 Thiết kế cấu trúc amiRNA 58 4.2 Thiết kế vector chuyển gen vào cà chua trên thực nghiệm 61 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… v 4.2.1 Thay thế cấu trúc amiRNA tự nhiên bằng amiRNA nhân tạo 61 4.2.2 Kết quả PCR 61 4.2.2 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào trong tế bào khả biến E.coli chủng TOP10 64 4.2.3 Xác ñịnh trình tự của cấu trúc pre-miRNA có mang miRNA nhân tạo trong plasmid tái tổ hợp. 65 4.2.4 Cắt pJET 1.2/ blunt chứa pre-miRNA và pPS1 bằng enzyme Xho và XbaI 67 4.2.5. Tạo vector pPS1 mang amiRNA-1 precursor 69 4.2.6 Tạo vector pPS1 mang pre - miRNA 73 4.2.7 Biến nạp vector pPS1 – TomiRNA vào tế bào khả biến A. tumefaciens chủng LBA4404. 73 4.2.8 Kiểm tra khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp 74 5 KẾT LUẬN 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO: 82 PHỤ LỤC 91 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Từ viết vắt 1 amiRNA Artificial miRNA 2 Amp Ampicillin 3 BLAST Basic Local Alignment Search Tool 4 bp Base pair 5 CT Công thức 6 Kan Kanamycin 7 KH Ký hiệu 8 miRNA microRNA 9 NCBI National Center for Biotechnology information 10 Nts Nucleotides 11 RE Restriction Enzyme – Enzyme giới hạn 12 PCR Polymerase Chain Reaction 13 RISC RNA Inducing Silencing Complex 14 RNAi RNA interfering 15 sRNA Small RNA 16 siRNA Small interfering RNA 17 shRNA Short hairpin RNA 18 Strep Streptomycin 19 TYLCD Tomato yellow leaf curl disease – Bệnh xoăn vàng lá cà chua 20 TYLCV Tomato yellow leaf curl virus – Virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua 21 WMD3 Web microRNA designer v.3 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2-1 Các begomovirus hại cây trồng ñược phát hiện cho tới nay tại Việt Nam 6 3-1 Các vật liệu plasmid nghiên cứu 42 3-2 Các mồi sử dụng trong over lapping PCR tạo trình tự pre- amiRNA 44 4-1 Các amiRNA sau lựa chọn 59 4-2 trình tự mồi pre-amiRNA 60 4-3 Các ñoạn oligo ñược sử dụng cho overlapping PCR 61 4-4 Sản phẩm PCR nhân dòng amiRNA 62 4-5 Kết quả kiểm tra căn trình tự TomiR5 ñược nhân dòng 65 4-6 Các sản phẩm có thể ñược hình thành khi xử lý plasmid tái tổ hợp pZET1.2/blunt-(d) với XhoI và XbaI 68 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… viii DANH MỤ HÌNH STT Tên hình Trang 2-1 Hình thái phân tử geminiviruses. 9 2-2 Tổ chức bộ gen của begomovirus 10 2-3 Quá trình nhân lên trong tế bào của begomovirus 13 2-4 DNA vệ tinh của begomovirus 17 2-5 Quá trình tái bản của begomovirus 18 2-6 Bệnh khảm lá sắn tại châu Phi 21 2-7 Bệnh cuốn lá bông: 22 2-8 Cơ chế hình thành miRNA ở thực vật 28 2-9 Mô hình sinh tổng hợp miRNA và siRNA 30 4-1 Vị trí các amiRNA trên genome begomovirus 59 4-3 Kết quả ñiện di phản ứng PCR nhân dòng sản phẩm a,b,c TomiR1, TomiR2, TomiR3 62 4-4 Kết quả ñiện di phản ứng PCR nhân dòng sản phẩm a,b,c TomiR5 62 4-5 Kết quả ñiện di phản ứng PCR nhân dòng sản phẩm a, b, c TomiR4, TomiR6 63 4-6 Kết quả ñiện di phản ứng PCR nhân dòng sản phẩm d TomiR1, TomiR2, TomiR3, TomiR4, TomiR5, TomiR6 63 4-7 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm (d) vào tế bào khả biến E.coli TOP 10 64 4-8 Kết quả ñiện di sản phẩm TomiR1-d, TomiR2-d, TomiR3-d, TomiR4-d, TomiR5-d, TomiR6-d sau chiết gel bằng GeneJET™ Gel Extraction Kit 65 4-9 a. Cấu trúc và vị trí cắt RE-XhoI và XbaI trên PPSI 67 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ix 4-9 b. Vị trí cắt RE- XhoI và XbaI trên plasmid tái tổ hợp pZET1.2/blunt-(d) 67 4-10 Kết quả ñiện di sản phẩm xử lý plasmid pJET1.2/ blunt (d) bằng RE 68 4-11. Trình tự của sản phẩm (d) mạch 5’-3’ sau khi ñược xử lý RE XhoI và XbaI 69 4-12 Kết quả giải trình tự sản phẩm TomiR1-pJET, TomiR2-pJET, TomiR3-pJET, TomiR4-pJET, TomiR5-pJET, TomiR6-pJET sau khi cắt enzyme giới hạn X-hoI – XbaI 72 4-13 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của plasmid tái tổ hợp pPS1 – TomiRNA với cặp mồi miR II, và miR III. 73 4-14 A. tumefaciens chủng LBA4404 biến nạp pPS1 – TomiRNA trên môi trường chọn lọc 74 4-15 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR kiểm tra khuẩn A. tumefaciens sau biến nạp với cặp mồi II và III. 74 4-17 Kết quả giải trình tự sản phẩm tái tổ hợp mang vector biểu hiện pPS1. 79 [...]... (TYLCV) Như v y, tác nhân gây b nh xoăn vàng lá cà chua ñư c xem là m t ph c h p nhi u begomovirus khác nhau Hi n nay, có kho ng 60 begomovirus gây b nh xoăn vàng lá cà chua kh p th gi i H u qu là, d a trên tri u ch ng quan sát, b nh không th ñư c gán cho m t loài begomovirus c th tr phi danh tính c a virus ñã ñư c xác ñ nh 2.3 ð c ñi m tác nhân gây b nh 2.3.1 ð c ñi m genome c a begomovirus 2.3.1.1 ð... như trên cà chua 2.2.2 Tác nhân gây b nh B nh xoăn vàng lá cà chua (Tomato yellow leaf curl diseases – TYLCD) hay còn g i là b n virus gây ra b i b ph n tr ng ñư c phát hi n ñ u tiên vào nh ng năm 1964 và 1966 (Cohen và Harpaz, 1964; Cohen và Nitzany, 1966) và ñư c ch ng minh là b nh gây ra b i geminivirus vào năm 1988 (Czosnek và cs, 1988) Trư c nh ng năm 90, tác nhân gây b nh xoăn vàng lá cà chua ñã... ñang gây tranh cãi v an toàn sinh h c c a cây tr ng bi n ñ i gen V n ñ ñ t ra là vi c ng d ng công ngh amiRNA cho cà chua có mang l i hi u qu kháng virus như mong mu n và cơ s khoa h c nào cho vi c l a ch n gen m c tiêu trên v t ch ñ làm câm và có hay không c ch ñư c s tái b n c a virus ð tài nghiên c u: “Thi t k vector amiRNA ñ c hi u nh m c ch s tái b n c a Begomovirus gây b nh xoăn vàng lá cà chua ... c u và t o cây cà chua chuy n gen kháng b nh xoăn vàng lá do begomovirus gây ra Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c sĩ khoa h c nông nghi p …………………… 4 2 T NG QUAN TÀI LI U 2.1 Tình hình nghiên c u v Tomato yellow leaf curl disease - TYLCD 2.1.1 Trên th gi i B nh xoăn vàng lá cà chua (Tomato yellow leaf curl disease) là m t trong nhi u b nh m i có s c tàn phá m nh trên cà chua các nhi t... 2.9 B nh do Begomovirus: Begomovirus gây nhi u b nh quan tr ng trên cây tr ng Các tri u ch ng ñi n hình do begomvirrus gây ra bao g m: Vàng gân, kh m bi n vàng (kèm theo bi n d ng lá) , bi n vàng lá, lùn cây, xoăn lá M t ñ c ñi m quan tr ng là nhi u b nh có th do các begomovirus thu c các loài khác hay gây ra Dư i ñây trình bày m t s b nh quan tr ng trên th gi i và Vi t Nam 2.9.1 B nh kh m lá s n Tri... kháng t tác nhân gây b nh (PRD) Trên cây cà chua, ngư i ta chưa phát hi n th y gen kháng R ch ng l i begomovirus trên cây cà chua tr ng (Lycopersicon esculentum) nhưng m t s gen kháng ch ng l i begomovirus ñã ñư c phát hi n th y trên m t s gi ng cà chua d i Hi n nay, nhi u gi ng cà chua kháng begomovirrus là các gi ng kháng chuy n gen dùng gen kháng t cây G n ñây nhi u gi ng cây (cà chua, bông, s n)... virus ph c v t o gi ng cà chua kháng b nh xoăn vàng lá 1.3 • Yêu c u Xác ñ nh ñư c các trình t miRNA ñ c hi u có kh năng c ch s bi u hi n c a vùng gen rep (Replication protein), vùng CR (Common region) c a các ch ng begomovirus gây b nh xoăn vàng lá trên cà chua phân l p t Vi t Nam • Thi t k thành công các vector nhân dòng ch a c u trúc miRNA ñã xác ñ nh • Thi t k thành công vector bi u hi n mang c u... nhi u khó khăn b i các b nh do vi khu n, n m, virus và ký sinh trùng Trong ñó, b nh xoăn vàng lá cà chua gây nên b i tomato yellow curl leaf virus (TYLCV) là m t trong nh ng b nh nh hư ng nghiêm tr ng ñ n năng su t cà chua vùng nhi t ñ i và c n nhi t ñ i M , thi t h i do virus này gây ra ư c kho ng 20% t ng s n ph m cà chua thu ho ch Trong khi ñó, các nư c C ng hòa Dominica, Cuba, Mexico, Guatemala,... nghi p …………………… 1 2 virus ñư c phân l p trên m u cà chua gây b nh xoăn vàng lá mi n B c là ToLCVV và TYLCVNV Các begomovirus lan truy n ngoài t nhiên nh b ph n (B tabaci) theo ki u b n v ng tu n hoàn TYLCV có ph ký ch r ng nh t trong nhóm begomovirus và có kh năng gây nhi m trên hơn 30 loài trong hơn 12 h th c v t Do ñó vi c phòng ch ng và tiêu di t b nh gây ra b i virus này g p nhi u khó khăn, thách... ñây ngư i ta còn phát hi n begommovirus thư ng tái sinh theo cơ ch g i là tái sinh ph thu c tái t h p” (Recombination dependent replication (RDR)) Cách tái sinh này cho phép virus có th tái t h p d dàng khi nhi m h n h p trên m t cây ký ch 2.7.2 Cơ ch gây b nh c a begomovirus Tương tác v i các y u t ký ch liên quan ñ n b máy tái b n Quá trình tái b n c a begomovirus x y ra trong nhân t bào, k c các . cứu: Thiết kế vector amiRNA ñặc hiệu nhằm ức chế sự tái bản của Begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá ở cà chua ñược thực hiện nhằm khai thác những ưu ñiểm miRNA trong việc tạo giống kháng begomovirus. . NỘI PHẠM THỊ THU HẰNG THIẾT KẾ VECTOR AMIRNA ðẶC HIỆU NHẰM ỨC CHẾ SỰ TÁI BẢN CỦA Begomovirus GÂY BỆNH XOĂN VÀNG LÁ Ở CÀ CHUA LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP . xoăn vàng lá cà chua của Việt Nam” 1.2. Mục ñích: Thiêt kế ñược các vector chứa các trình tự miRNA ñặc hiệu nhằm ức chế sự tái bản của Tomato yellow leaf curl virus phục vụ tạo giống cà chua