AL 4404, sử dụng cho chuyển gen.
Các chủng vi khuẩn ựược giữ trong glycerol 40% ở -80oC.
3.2 địa ựiểm và thời gian nghiên cứu:
3.2.1 địa ựiểm nghiên cứu
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 43
3.2.2 Thời gian nghiên cứu: 3/2011 Ờ 8/20123.3. 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp tìm kiếm và so sánh trình tự gen
- Khai thác cơ sở dữ liệu genbank (NCBI) tìm trình tự gen của các begomovirus gây bệnh TLCV, tập trung chủ yếu vào các chủng gây bệnh ở Việt Nam
- Sử dụng công cụ ClustalW nhằm xác ựịnh vị trắ vùng bảo thủ giữa các trình tự
3.3.2 Thiết kế amiRNA
a. Sử dụng phần mềm WMD3 (http://wmd3.weigelworld.org/cgi-
bin/webapp.cgi) thiết kế amiRNA
Ớ Các thông tin về trình tự gene, lựa chọn thư viện genome, số mục tiêu cần
làm câm ựược ựưa vào WMD3. WMD3 sẽ ựưa ra các trình tự amiRNA ứng viên.
Ớ Dựa vào các tiêu chắ (Schwab và cộng sự, 2003; Warthmann và cộng sự,
2008) dưới ựây ựể lựa chọn ra amiRNA tốt nhất:
- Không có lỗi trong vị trắ 2-12 của amiRNA ựối với tất cả các mục tiêu. - Vị trắ số 1 là Uridine (U), vị trắ số 10 là Adenine (A) hoặc Uridine (U).
- Có 1 (hoặc 2) lỗi ở ựầu 3Ỗ của amiRNA ( vị trắ 18-21)
- Năng lượng liên kết nằm trong khoảng -35 ựến -38 kcal/ mole. - Vị trắ mục tiêu nằm ở ựầu 3Ỗ của vùng mã hóa.
- Làm câm gene ựặc hiệu (chỉ làm câm gene mục tiêu mà không làm câm các
gene khác). Sử dụng công cụ Oligo trong WMD3
(http://wmd3.weigelworld.org/cgi-bin/webapp.cgi?page=Oligo;project=stdwmd) ựể thiết kế mồi nhân dòng cấu trúc pre-amiRNA ựặc hiệu.
- Sử dụng overlapping PCR tạo trình tự pre-amiRNA (Rebecca Schwab, 2005)
Plasmid pRS300 chứa trình tự ath-mi319a precursor trong pBSK ựược sử dụng làm khuôn cho các phản ứng PCR. Pre-amiRNA ựược tạo thành nhờ thay thế miRNA tự nhiên bằng amiRNA sử dụng overlapping PCR với các mồi ựược thiết kế overlap (I, II, III, IV).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 44