Các sRNA ựược chia thành 2 nhóm chắnh dựa trên mô hình sinh tổng hợp của chúng bao gồm các siRNA và microRNA.
2.10.2.1. SiRNA
siRNAs là các phân tử RNA sợi kép nhỏ, kắch thước khoảng 21-25 nts, ựược tạo ra bởi Dicer, một RNA endonuclease nhóm III, là thành phần quan trọng của phức hợp RISC gọi là siRISC có chức năng phân hủy mRNA mục tiêu của nó.
siRNAs ựã ựược khám phá bởi Hamilton và Baulcombe năm 1999. Các tác giả ựã chuyển gen aco, gus vào cây cà chua và thuốc lá. Trên các cây biểu hiện hiện tượng PTGS, các tác giả ựã phát hiện ựược các phân tử RNA nhỏ, kắch thước khoảng 25 nts, ựặc hiệu nhưng ngược chiều với gen chuyển (chứng tỏ không phải là sản phẩm phân hủy của mRNA của các gen trên). Ngoài ra các tác giả cũng phát phát hiện thấy sau khi lây nhiễm potato virus X (PVX) 4 ngày, trên cây cũng hình thành các phân tử kắch thước khoảng 25 nts, ựặc hiệu nhưng ngược nghĩa với PVX.
Phần lớn siRNA có nguồn gốc từ mRNAs, các yếu tố di ựộng (transposons), virus hoặc DNA dị nhiễm sắc thể (heterochromatic DNA). Như vậy siRNA có cùng nguồn gốc với gen mục tiêu. Các siRNA bình thường có thể ựược hình thành từ các
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 25
RNA mạch kép (dsRNA), sợi dài nội sinh cũng như ngoại sinh (VD: thông qua chuyển gen) thông qua sự phân cắt bởi Dicer RNase, giải phóng một phài phân tử trung gian dạng mạch kép, có kắch thước khoảng 21 nts, với 2 nts nhô ra ở ựầu 3Ỗ (Elbashir và cộng sự, 2001). Từ những phân tử trung gian này, các mạch với tắnh bền nhiệt ựộng thấp ở ựầu 5Ỗ của chúng sẽ hoạt ựộng trong RISC (Khvorova và cs, 2003). Các siRNA sau ựó ựóng vai trò như là thành phần của RISC, ựưa nó ựi phân cắt các mRNA mục tiêu bổ sung với các nucleotide 10 ựến 11 của siRNA, dẫn ựến sự phân giải mRNA.
2.10.2.2. MicroRNA
Những công bố ựầu tiên về microRNA (miRNA) ựã ựược Lee và cộng sự ựưa ra vào năm 1993 khi ông tìm ra cơ chế ựiều hòa của lin-4 ựối với lin-14. Tuy nhiên, cho ựến nhưng năm gần ựây, miRNA mới thực sự ựược quan tâm. MiRNAs là các trình tự RNA ựiều hòa nhỏ, nội sinh, không mã hóa, có kắch thước 21-24 (nts). Chúng ựóng vai trò quan trọng trong ựiều hòa âm tắnh sự biểu hiện của gene ở hầu hết các sinh vật nhân chuẩn (Bartel và Bartel, 2003; Mallory và cs, 2004). Ở thực vật, miRNAs liên quan ựến một số các quá trình sinh học, chẳng hạn như sự sinh trưởng, phát triển, phản ứng phòng thủ chống lại các stress vô sinh. Các nghiên cứu ựã chỉ ra rằng miRNAs ựiều hòa sự biểu hiện của gene ở mức ựộ hậu phiên mã trên những sinh vật khác nhau (Mallory và cs, 2004; Grishok và cs, 2001; Reinhart và cs, 2002; Chapman và cs, 2004). Những nghiên cứu sâu hơn cũng ựã chỉ ra rằng các trình tự miRNA ở thực vật rất bảo thủ (Reinhart và cs, 2002), và có tắnh bổ sung gần như hoàn hảo với các mục tiêu RNA thông tin (mRNA) ựặc thù của chúng. Do tắnh bổ sung này, một miRNA thực vật có thể gây ra sự phân cắt, phân hủy hoặc ức chế sự dịch mã của mRNA mục tiêu của nó và do ựó ảnh hưởng ựến sự biểu hiện của gene.
Không giống như siRNA, thường có nguồn gốc ngoại sinh, miRNA ựược hình thành bởi các gene trong genome, những gene này ựược gọi là MIR gene. Nếu như các MIR gene ở nguyên sinh ựộng vật thường nằm ở trong các intron hoặc exon thì hầu hết các MIR gene thực vật lại nằm ở trong vùng nối giữa 2 gene. Cấu trúc và chiều dài của chúng cũng biến ựộng hơn. Các MIR gene ở ựộng vật thường phân cụm và ựược ựồng phiên mã dưới dạng các RNA polycistron (Kim, 2005). Ngược
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 26
lại, các MIR gene thực vật hiếm khi sắp xếp nối tiếp nhau. Các MIR gene có tắnh bảo thủ cao ở các loài, tạo thành các họ MIR gene. Có thể kể ra một số họ MIR gene như MIR156, MIR159, MIR160, MIR172,Ầ Trong số họ gene này, họ gene MIR159
có 94 trình tự tương ựồng, trình tự miR319 cũng thuộc họ gene này và trình tự này có mặt trên cả Arabidopsis, lúa, ngô, ựậu tươngẦ MiR319a trên Arabidopsis thaliana (ath-miR319) ựã ựược áp dụng thành công trong chiến lược tạo miRNA nhân tạo (amiRNA) nhằm nghiên cứu chức năng gene trên Arabidopsis thaliana
(Schwab và cs, 2003).
Quá trình hình thành miRNA nói chung và ở thực vật nói riêng xảy ra nhiều giai ựoạn. đầu tiên, các MIR gene ựược phiên mã ựể hình thành các miRNA primary (pri-miRNA) nhờ RNA polymerase II. Sau quá trình phiên mã, ựầu 5Ỗ của pri-miRNA ựược gắn mũ (cap-binding complex Ờ CBC) và ựầu 3Ỗ ựược gắn chuỗi polyadenin. Do trong cấu trúc có chứa trình tự ựảo ngược không hoàn hảo, cấu trúc thân và thòng lọng ựược hình thành (stem and loop structure). Tiếp ựó, pri-miRNA ựược xử lý bởi một phức hệ enzyme gọi là microprocessor. Phức hệ này bao gồm các Dicer like-1 nuclease (DCL1) (các thành viên thuộc họ RNase III endonuclease), một protein bám vào RNA mạch kép (dsRNA) HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1) và SE, một C2H2-type zinc finger. Ở Arabidopsis thaliana, tất cả các bước hình thành miRNA ựều có sự tham gia của một trong bốn Dicer-like RNase III endonuclease (Filipowicz và cs, 2008). Trong số ựó, DCL1 có vai trò quan trọng trong quá trình xử lý hình thành miRNA, trong khi các DCL khác liên quan ựến quá trình hình thành và tắch lũy siRNAs (Meyers và cs, 2008). Tuy nhiên, sự phụ thuộc vào DCL4 ựối với sự tắch lũy của một số miRNA thực vật cũng ựã ựược phát hiện (Rajagopalan và cs, 2006). Sau khi ựược xử lý bởi phức hệ microprocessor, cấu trúc miRNA precursor (pre-miRNA) ựược hình thành. Cấu trúc này cũng có dạng thân - thòng lọng nhưng có kắch thước ngắn hơn và dao ựộng trong khoảng từ 64 ựến 303 nts trong khi ở ựộng vật thường là 60-70 nts (Bartel và Bartel, 2003). Phức hệ
microprocessor tiếp tục phân giải cấu trúc thòng lọng ở pre-miRNA và hình thành nên cấu trúc miRNA/miRNA* duplex, ở 2 ựầu nhô ra 2-3 nts, dài khoảng 20-22 nts. Cấu trúc này sau ựó ựược methyl hóa bởi enzyme HEN1 và ựược chuyển ra ngoài tế
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 27
bào chất với sự hỗ trợ của HASTY - một chất vận chuyển miRNA. Việc methyl hóa cấu trúc miRNA/miRNA* duplex bởi HEN1 nhằm bảo vệ cấu trúc khỏi sự phân hủy của SMALL RNA DEGRADING NUCLEASE (SDN). Nhờ helicase, cấu trúc miRNA/miRNA* duplex ựược phân tách thành 2 sợi ựơn, một sợi sẽ trở thành miRNA thành thục còn sợi kia (miRNA*) sẽ bị phân hủy.
MiRNA thành thục tiếp ựó sẽ tham gia vào quá trình ựiều hòa sự biểu hiện của gene theo các ựường hướng khác nhau. Con ựường ựiều hòa chủ yếu là sự tham gia của miRNA vào quá trình phân cắt các mRNA mục tiêu của chúng. Cấu trúc miRNA thành thục ựược ựưa vào trong một phức hệ làm câm gene ribonucleoprotein cảm ứng bởi RNA (RISC) ựể phân cắt mRNA mục tiêu ựặc thù hoặc ựể ức chế sự dịch mã của mRNA (Hammond và cs, 2000). Protein Arganoute (AGO1) ựóng vai trò quan trọng nhất và là thành phần chắnh của phức hệ miRNA- RISC (Filipowicz và cs, 2008). Khả năng của nó trong việc ức chế sự tổng hợp protein và sự liên kết với miRNA ựã ựược chứng minh trên người ( Pillai và cs, 2004). Việc lựa chọn mạch nào ựược ựi vào phức hệ RISC ựược quyết ựịnh bởi AGO. Ở Arabidopsis, AGO1 có xu hướng lựa chọn mạch miRNA có ựầu 5Ỗ bắt ựầu bằng uridine (U). MiRNA sợi ựơn trong phức hệ RISC có thể nhắm tới mRNA mục tiêu ựặc hiệu nhờ tắnh tương ựồng của nó với mục tiêu. Thành phần AGO sau ựó có thể phân cắt miRNA-mRNA duplex (Filipowicz và cs, 2008) tại vị trắ 10-11 (Lingel và cs, 2003; Song và cs, 2004), do ựó làm ức chế sự biểu hiện của gene.
Bên cạnh ựó, sự ức chế dịch mã và sự phân hủy mRNA cũng là sự ựiều hòa sự biểu hiện của gene khác nhờ vai trò của miRNA. điều này có thể xảy ra nhờ việc cắt bỏ ựuôi poly (A) ở ựầu 3Ỗ và mũ ở ựầu 5Ỗ của các mRNA, từ ựó, dẫn ựến việc phân hủy mRNA nhanh chóng (Parker và Song, 2004). Quá trình này ựã ựược chứng minh trên các tế bào S2 của Drosophyla melanogaster (Behm-Ansmant và cs, 2006).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 28
Hình 2-8 Cơ chế hình thành miRNA ở thực vật (Voinnet, 2009)
2.10.2.3. So sánh siRNA và miRNA
Giống nhau
Các sRNA trưởng thành ựều ựược hình thành từ các cấu trúc RNA mạch kép có kắch thước nhỏ (21-25 bp). Các RNA mạch kép này ựều ựược tạo ra bởi Dicer (một endonuclease nhóm III), do vậy chúng ựều có ựặc ựiểm là có 2-3 nts nhô ra ở ựầu 5Ỗ và 3Ỗ (Hutvágner và Zamore, 2002).
Hoạt ựộng của siRNA và miRNA sau khi ựã lắp ráp thành phức hợp siRISC và miRISC là giống nhau: ựều nhằm ựể cắt các RNA sợi ựơn mục tiêu.
Khác nhau
Mặc dù giống nhau về tắnh chất hóa học, sinh hóa và cơ chế hoạt ựộng thì miRNA và siRNA vẫn có các ựặc ựiểm khác nhau cơ bản về nguồn gốc, ựường hướng hình thành, vai trò sinh học và mức ựộ bảo thủ về mặt tiến hóa (Bartel and Bartel, 2003).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 29
MiRNA có nguồn gốc nội sinh, ựược mã hóa tại các vị trắ genome khác biệt với gene mục tiêu của nó. Trái lại, siRNA có nguồn gốc từ mRNA, transposon, virus, tức là có cùng nguồn gốc với gene mục tiêu.
MiRNA ựược xử lý từ các phân tử pri-miRNA, hình thành cấu trúc pre- miRNA có cấu trúc kẹp tóc bắt cặp không hoàn hảo. Trái lại, siRNA ựược xử lý từ các phân tử dsRNA dài hoặc các cấu trúc kẹp tóc có trình tự bắt cặp hoàn hảo và kắch thước khá dài.
Từ một phân tử pre-miRNA sẽ chỉ tạo một loại phân tử miRNA. Trái lại, một phân tử dsRNA hoặc một cấu trúc kẹp tóc dsRNA sẽ tạo nhiều phân tử siRNA khác nhau. Dựa vào tắnh ổn ựịnh nhiệt ựộng ở 2 ựầu, siRNA có thể ựược chia thành 2 nhóm: (1) nhóm ựối xứng với 2 ựầu ựều có tắnh ổn ựịnh tương ựương nên cả 2 sợi ựơn sau khi tách ra ựều lắp ráp hiệu quả thành siRISC và (2) nhóm không ựối xứng, do chỉ có một ựầu ổn ựịnh nên chỉ có 1 sợi lắp ráp hiệu quả thành RISC. Phần lớn các miRNA thuộc nhóm không ựối xứng, do vậy, chỉ tạo một loại miRNA. Bởi vậy sự làm câm gene bởi miRNA mang tắnh ựặc thù hơn so với siRNA.
Trình tự miRNA gần như luôn bảo thủ ở các sinh vật có quan hệ với nhau; trái lại, trình tự chuỗi siRNA hiếm khi bảo thủ giữa các sinh vật có quan hệ.
Mục tiêu tác ựộng của miRNA có thể là một gene hoặc một số gene có liên quan; ngược lại, siRNA chỉ nhằm tới trình tự bổ sung hoàn hảo với trình tự của nó. đặc ựiểm này khiến công nghệ siRNA gặp hạn chế khi sử dụng ựể nghiên cứu chức năng của một nhóm gene liên quan.
Cơ chế câm gene thông qua miRNA là một cơ chế ựiều hòa gene, ựảm bảo sự sinh trưởng và phát triển của sinh vật. Trái lại, cơ chế câm gene thông qua siRNA là một cơ chế phòng thủ chống virus, ngăn chặn sự biểu hiện quá mức hoặc không cần thiết của các mRNA và bảo vệ bộ gene khỏi bị gián ựoạn bởi transposon.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 30
Hình 2-9 Mô hình sinh tổng hợp miRNA và siRNA (Bartel và Bartel, 2003)
2.10.2.4. miRNA nhân tạo (amiRNA)
Công nghệ amiRNA sử dụng khung của các miRNA tự nhiên ựể hình thành nên miRNA nhân tạo (amiRNA) có kắch thước 21 nts , có vai trò trong sự làm câm gene trực tiếp ở trên thực vật cũng như ựộng vật (Alvarez và cs, 2006; Niu và cs, 2006; Parizotto và cs, 2004; Schwab và cs, 2006; Zeng và cs, 2002). để hình thành amiRNA, người ta sử dụng khung của miRNA tự nhiên, chỉ thay thế trình tự miRNA/miRNA* bằng trình tự amiRNA/amiRNA* tương ứng. đặc ựiểm thiết kế này cho phép các amiRNA ựược sinh tổng hợp và hoạt ựộng tương tự như các miRNA tự nhiên. Các amiRNA ựầu tiên ựược tạo ra và sử dụng trên các dòng tế bào người (Zeng và cs, 2002) và sau ựó là ở trên Arabidopsis (Parizotto và cs, 2004). Theo các công bố này, amiRNA can thiệp hiệu quả ựến sự biểu hiện của các gene chỉ thị. Sau ựó, nhiều nghiên cứu ựã chứng minh rằng không chỉ các gene chỉ thị mà cả gene nội sinh cũng có thể là mục tiêu của amiRNA và có thể amiRNA cũng hoạt
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
ựộng hiệu quả trên các loài thực vật khác (Alvarez và cs, 2006; Schwab và cs, 2006). Ngoài ra, amiRNA cũng hoạt ựộng hiệu quả dưới sự ựiều khiển của cả promoter toàn năng hay promoter ựặc thù mô. Các thắ nghiệm với cấu trúc vector ựặc thù mô ựã chứng tỏ rằng có rất ắt hoặc hầu như không có các tác ựộng ngoài mô ựặc thù (Alvarez và cs, 2006; Schwab và cs, 2006). Cũng giống như miRNA, từ cấu trúc precursor, chỉ hình thành duy nhất một amiRNA trưởng thành mạch ựơn, do ựó amiRNA có khả năng làm câm gene ựặc thù. Khác với siRNA hay shRNA, từ một cấu trúc precursor có thể hình thành nhiều sRNA, do vậy, việc làm câm gene ắt ựặc hiệu hơn. Ngoài ra, các phân tắch sự biểu hiện của gene cũng chỉ ra rằng các amiRNA có tắnh ựặc hiệu cao tương ựương với các miRNA nội sinh (Zeng và cs, 2002; Schwab và cs, 2005; 2006), do vậy, trình tự của các amiRNA có thể ựược tối ưu hóa ựể làm câm một hoặc một vài gene mục tiêu mà không làm ảnh hưởng ựến sự biểu hiện của các gene khác. Công nghệ siRNA hay shRNA thường chỉ nhằm vào một gene mục tiêu do các sRNA này có ựặc ựiểm bổ sung hoàn hảo với trình tự mục tiêu của nó. Trong khi ựó, sự bắt cặp giữa amiRNA và mRNA mục tiêu của nó là không hoàn hảo, do vậy có thể nhằm tới làm câm một họ các gene có liên quan ựến nhau. Với ựặc ựiểm này, amiRNA có thể là công cụ hữu ắch cho nghiên cứu gene ựa alene. Trên các loài ựa bội như khoai tây, lúa mì, ựa số các gene ở trạng thái ựa alene. Cho ựến nay, nhiều pre-miRNA trên Arabidopsis ựã ựược biến ựổi ựể làm câm các gene mục tiêu nội hoặc ngoại sinh trên các cây hai lá mầm như Arabidopsis, cà chua, thuốc lá (Niu và cộng sự, 2006; Qu và cs, 2007; Schwab và cs, 2006; Alvarez và cs, 2006; Parizotto và cs, 2004) cũng như trên cây một lá mầm như lúa (Warthmann và cs, 2008), và do ựặc ựiểm ựặc thù cũng như linh ựộng của nó mà các vector amiRNA ựược coi như là thế hệ vector RNAi thứ 2.