2.10.3.1. Ứng dụng công nghệ RNAi trong nghiên cứu chức năng gene ở thực vật
Một thử thách chắnh trong thời ựại hậu genome của sinh học cây trồng là xác ựịnh chức năng của tất cả các gene trong hệ gene thực vật. Trước khi khám phá ra RNAi, các nhà nghiên cứu thường thay ựổi sự biểu hiện và các chức năng của gene bằng cách thêm các ựột biến di truyền sử dụng transposons hoặc T-DNAs, ựột biến
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32
di truyền sử dụng tác nhân hóa hoạc ehthyl methane sulphonate (EMS), ựột biến phóng xạ và một công nghệ RNA ựối bản ựể phỏng ựoán chức năng của các gene ở thực vật từ sự thay ựổi về kiểu hình (Bevan, 2002). Những những công nghệ này bị giới hạn bởi tắnh gây ghết, các ựột biến vô hướng.
RNAi ựã ựược sử dụng cho nghiên cứu genomics chức năng bằng cách làm gián ựoạn sự biểu hiện gene mục tiêu của nó. RNAi có một số ưu ựiểm so với các chiến lược truyền thống cho nghiên cứu chức năng gene. Ưu ựiểm ựầu tiên là khả năng nhắm tới gene mục tiêu một cách ựặc hiệu. Sự lựa chọn vùng ựơn nhất của trình tự mục tiêu có thể chắc chắn rằng một thành viên của họ gene ựặc thù bị làm câm, hoặc nhiều thành viên của họ gene có thể bị làm câm nhờ những vùng trình tự có mức ựộ bảo thủ cao. Các mức ựộ làm câm gene khác nhau có thể mang ựến những dòng chuyển gene khác nhau sử dụng cùng cấu trúc RNAi. Hơn thế, sự biểu hiện của RNAi từ các promoter cảm ứng có thể ựiều khiển và kéo dài thời gian làm câm gen (Chen và cs, 2003), các gene mong muốn chỉ bị câm vào các giai ựoạn sinh trưởng hoặc ở những cơ quan thực vật có lựa chọn. đồng thời, hiện tượng câm gene do RNAi là trội, do ựó có thể quan sát ngay ựược kiểu hình. Trong những năm gần ựây, công nghệ amiRNA mang nhiều ưu ựiểm hơn so với siRNA ựã trở thành công cụ hữu ắch trong nghiên cứu chức năng gene ở thực vật.
2.10.3.2. Ứng dụng RNAi trong tăng cường khả năng chống chịu sâu bệnh
Hiệu quả của câm gene ở thực vật ựầu tiên ựược sử dụng nhằm tăng cường khả năng chống chịu ựối với bệnh cũng như các tác ựộng của yếu tố môi trường.
Khả năng ứng dụng của RNAi trong phòng chống sâu, bệnh hại ựầu tiên ựược biết ựến liên quan ựến khả năng kháng virus của cây. Phần lớn các virus có bộ genome là RNA và tái bản thông qua trung gian là RNA mạch kép (dsRNA). dsRNA ựóng vai trò như là một chất kắch hoạt RNAi ở giai ựoạn sớm của quá trình tái bản và là mục tiêu của cơ chế câm gene ở giai ựoạn lây nhiễm sau. Bệnh gây ra bởi Rice Yellow Mottle Virus (RYMV) gây ảnh hưởng nghiêm trọng ựến việc sản xuất lúa nước ở châu Phi. Do có rất ắt nguồn tự nhiên có tắnh kháng RYMV, Pinto và cộng sự (1999) ựã chuyển gene mã hóa RNA polymerase phụ thuộc RNA vào cây mẫn cảm với RYMV. Cây chuyển gene biểu hiện tắnh kháng với nhiều chủng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
RYMV có nguồn vùng từ nhiều vùng khác nhau của châu Phi. Tắnh kháng này ổn ựịnh ắt nhất là ba thế hệ. Tắnh kháng virus nhờ RNAi không chỉ ựược áp dụng ựối với những virus có bộ genome là RNA mà còn có thể ựược sử dụng ựối với virus có genome là DNA. Hiệu quả ựiều khiển các virus có genome là DNA mạch ựơn, ựặc biệt là các geminivirus bởi RNAi ựã ựược công bố. Vùng không mã hóa nằm giữa 2 gene của geminivirus Mungbean yellow mosaic India virus (MYMIV) ựược ựưa vào cấu trúc hpRNA ựược ựiều khiển bởi 35S promoter (Pooggin và cs, 2003). Cấu trúc này ựược chuyển vào cây ựã bị nhiễm bệnh. Sau khi ựược chuyển gene, cây hoàn toàn phục hồi và khỏe mạnh. đã có nhiều báo cáo công bố về tiềm năng của RNAi trong phòng chống bệnh virus, với mỗi ựối tượng lại nhằm vào các mục tiêu gene khác nhau và cấu trúc chuyển gene cũng khác nhau. Cây ựu ựủ chống lại bệnh virus ựốm vòng (Fushs và Gonsalves) và giống khoai tây kháng bệnh virus cuốn lá của Monsanto (www.research.cip.cgiar.org/) là những công bố thương mại ựầu tiên về cây chuyển gene ứng dụng RNAi trong phòng chống bệnh virus.
Những nghiên cứu gần ựây còn cung cấp những bằng chứng rằng sự làm câm gene bởi RNAi cũng ựóng vai trò trong phản ứng phòng thủ của thực vật chống lại tác nhân gây bệnh là vi khuẩn, tuyến trùng và côn trùng. Một peptide có nguồn gốc từ lông roi của vi khuẩn Pseudomonas ựược chứng minh là cảm ứng sự tắch lũy miR393 ở Arabidopsis. MiR393 ựiều hòa âm tắnh các mRNA của các F-box auxin receptor, dẫn ựến tắnh kháng với vi khuẩn P. syringae ựược tăng lên (Navarro và cs, 2006). Hiện tượng RNAi ựầu tiên ựược chứng minh trên tuyến trùng C. elegans, bởi vậy, việc sử dụng RNAi trong phòng chống bệnh gây ra bởi tuyển trùng là một chiến lược tiềm năng. RNAi có thể ựược khởi ựộng trong C. elegans bằng cách cho nó ăn dsRNA. Sự biểu hiện của các trình tự mang cấu trúc hpRNA của gene cần thiết cho tuyến trùng trong cây ký chủ có thể hình thành các dsRNA, các dsRNA này ựược tuyến trùng ăn vào, dẫn ựến nó bị mất khả năng gây hại hoặc bị giết chết. Cụ thể, các cây thuốc lá ựược chuyển cấy trúc hpRNA chống lại 2 gene của tuyến trùng nốt sưng cho thấy lượng mRNA của tuyến trùng trong cây giảm rõ rệt và cây biểu hiện tắnh kháng hiệu quả chống lại ký sinh (Faibairn và cs, 2007). Côn trùng cũng là một tác nhân gây hại lớn trên thực vật. Thắ nghiệm làm câm gene quy ựịnh
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
tổng hợp protein RDR1 ở Nicotiana attenuate là tăng tắnh mẫn cảm của cây ựối với sự tấn công bởi các côn trùng gặm nhai (Pandey và Baldwin, 2007). Do các protein RDR ựóng vai trò quan trọng trong sự hình thành siRNA, ựiều ựó chứng tỏ rằng siRNA có thể ựóng vai trò nào ựó trong cơ chế phòng thủ của cây ựối với côn trùng gây hại.
Các tiềm năng ứng dụng amiRNA như các tác nhân chống virus tymovirus (Turnip yellow mosaic virus), và potyvirus (Turnip mosaic virus) cũng ựã ựược Niu và cs (2006) công bố.
Ngày càng nhiều các nghiên cứu công bố vai trò của RNAi trong cơ chế phòng thủ của cây ựối với sâu bệnh hại. Bởi vậy, việc ứng dụng RNAi nói chung và miRNA nói riêng vào chiến lược phòng chống sâu bệnh sẽ mở ra nhiều tiềm năng mới.
2.10.3.3. Ứng dụng RNAi trong tăng cường khả năng chống chịu với stress môi trường
Các stress môi trường, chẳng hạn như hạn, mặn, nhiệt ựộ cao, ựược ựiều hòa bởi sự biểu hiện của hàng nghìn gene trong thực vật ở cả mức ựộ phiên mã và sau phiên mã. Hiện nay, rất nhiều miRNA thực vật ựã ựược dự ựoán và một trong số ựó ựã ựược chứng minh bằng thực nghiệm là liên quan ựến các phản ứng chống lại các stress môi trường khác nhau.
Dinh dưỡng khoáng ựóng vai trò quan trọng trong ựời sống thực vật. Pi, K và N là 3 nguyên tố ựa lượng cần thiết cho cây trồng nhưng lại thường bị thiếu ở trong ựất. MiR399 ở Arabidopsis có gene mục tiêu mã hóa ubiquitin-conjugating enzyme (UBC; At2g33770). Fujii và cs (2005) ựã chứng minh rằng sự biểu hiện của miR399 không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường. Mức K và N thấp cũng không cảm ứng sự biểu hiện của miR399. Tuy nhiên khi mục tiêu của nó là mRNA của gene
UBC bị giảm xuống thì miR399 ựược kắch hoạt mạnh.
Hormone thực vật abscisic acid (ABA) liên quan ựến nhiều quá trình phát triển, trao ựổi chất của thực vật. Sunkar và Zhu (2004) ựã công bố rằng sự biểu hiện
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 35
của miR319 tăng mạnh khi ựược cây ựược xử lý ABA, trong khi miR397b và miR402 tăng không ựáng kể. Ngược lại, sự biểu hiện của miR389a giảm khi cây ựược xử lý ABA.
2.10.3.4. Ứng dụng RNAi trong ựiều khiển sự phát triển ở thực vật
MiRNA nội sinh là các yếu tố ựiều hòa sự phát triển thực vật (miR172, biệt hóa cơ quan hoa, và miR166, tắnh phân cực lá), khởi ựộng và phát triển rễ (ath- miR164) (Mallory và cs, 2004). Sự nghiên cứu các miRNA này sẽ làm sáng tỏ các quá trình phát triển ở thực vật.
Sử dụng RNAi Moritoh và cộng sự (2005) ựã chỉ ra rằng OsGEN-L ựóng vai trò quan trọng trong sự trao ựổi DNA cần thiết cho sự phát triển sớm của các tiểu bào tử ở lúa. Từ trình tự cDNA của BcMF4, Liu và cs (2006) ựã thiết kế hệ thống vector kép pBI121 mang các ựoạn antisene và sene, thông qua Agrobacterium tumefaciens dòng LBA4404 chuyển vào cây cải ngọt (Brassiaca chinensis). Sự gián ựoạn chức năng của BcMF4 do RNAi dẫn ựến các hạt phấn bị hỏng ở cây cải ngọt (Brassica integrifolia.), chứng tỏ rằng sản phẩm của gene BcMF4 ựóng vai trò quan trọng trong suốt quá trình phát triển của hạt phấn ở cả cải bẹ (Chinese cabbage-pak- choi, Brassica chinensis var. communis) và cả cây cải ngọt.
2.10.3.5. Ứng dụng RNAi trong biến ựổi các sản phẩm trao ựổi chất và cải tiến chất lượng cây trồng
Thực vật là một nguồn cung cấp một số lượng lớn các sản phẩm cung cấp cho con người, bao gồm, thực phẩm, gỗ, dầu, thuốc nhuộm và dược phẩm. Nhiều hợp chất trao ựổi thứ cấp có giá trị chỉ ựược hình thành với một lượng rất nhỏ và ngược lại, sự hình thành một số sản phẩm khác lại làm cho cây giảm giá trị thương phẩm. Việc can thiệp vào ựường hướng trao ựổi chất, sử dụng công nghệ RNAi sẽ góp phần giải quyết những giới hạn trên.
Dòng lúa ựột biến LGC-1 (Low Glutelin Content-1) là giống thương mại ựầu tiên ựược tạo bởi công nghệ RNAi (Kusaba và cs, 2003). Loại gạo ựột biến với hàm lượng protein thấp rất có lợi cho những bệnh nhân bị bệnh thận. đột biến trội này hình thành cấu trúc RNA kẹp tóc (hpRNA) từ một trình tự lặp ựảo của gene
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 36
glutelin- gene này có vai trò chắnh trong việc dự trữ glutelin, dẫn ựến hàm lượng glutelin giảm nhờ RNAi. Nhờ công nghệ RNAi, Shinjiro và cs (2003) ựã gây ức chế gene theobromine và ựã giảm hàm lượng caffeine 70% so với mức thông thường. Liu và cs (2002) ựã thay ựổi hàm lượng acid béo trong dầu của hạt bông bằng cách sử dụng công nghệ làm câm gene thông qua hpRNA ựể làm giảm sự biểu hiện của 2 gene mã hóa fatty acid desaturase chắnh là ghSAD-1 và shFAD-2.