Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên gà đẻ trứng của chủng vi khuẩn Streptococcus iniae phân lập từ cá chẽm

Công nghệ sản xuất kháng thể IgY ở gà đã được chứng minh có khả năng đáp ứng được các yêu cầu trên do kháng thể IgY từ máu gà mái được chuyển qua và tích tụ trong lòng đỏ trứng của chúng

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG o0o

LỜI CẢM ƠN

Thực tập tốt nghiệp thật sự là cơ hội quan trọng để sinh viên nói chung, sinh viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học nói riêng có thể tiếp cận thực tế nghề nghiệp, rèn luyện phương pháp nghiên cứu khoa học và hoàn thiện những kỹ năng thực hành cần thiết trước khi rời khỏi giảng đường đại học Những kiến thức đúc kết được sẽ là bước đệm vững chắc, hỗ trợ cho công việc thực tế sau này

Trong thời gian hoàn thành đồ án tốt nghiệp, ngoài những cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của nhiều cơ quan và cá nhân Với tất cả sự chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin được gửi lời cảm ơn tới:

Thạc sĩ Nguyễn Thị Kim Cúc và Thạc sĩ Lê Nhã Uyên – giáo viên hướng dẫn, những người đã định hướng và chỉ bảo tận tình trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp Cám ơn cô đã giúp cho em có định hướng tốt về cách tư duy khoa học

và học hỏi được nhiều kinh nghiệm nghiên cứu quý giá

Chị Nguyễn Minh Nhật đã tạo mọi điều kiện cho tôi được học hỏi và thực hiện

đề tài tại Trung tâm Thí nghiệm - Thực hành, Trường Đại học Nha Trang

Quý thầy cô giáo chuyên ngành Công nghệ Sinh học đã trang bị cho em những kiến thức cần thiết để làm khóa luận này

Tôi xin được cảm ơn những người bạn thân yêu của lớp 51CNSH Tôi đã học hỏi được nhiều điều từ các bạn trong suốt những năm qua Tình cảm này tôi sẽ mãi luôn trân trọng

Cuối cùng, con xin được gửi lời tri ân sâu sắc nhất đến gia đình Cám ơn cha

mẹ và anh chị đã luôn bên cạnh động viên con lúc khó khăn và giúp con nên người Tôi xin chân thành cám ơn!

Nha Trang, tháng 07 năm 2013

Sinh viên thực hiện

Ngô Thị Giang

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và Việt Nam 3

1.1.1 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới 3

1.1.2 Tình hình nuôi cá chẽm ở Việt Nam 3

1.2 Các bệnh thường gặp trên cá chẽm 4

1.2.1 Bệnh do vi khuẩn 4

1.2.2 Bệnh do kí sinh trùng 4

1.2.3 Bệnh do virus 5

1.3 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra trong nuôi trồng thủy sản 5

1.3.1 Tình hình dịch bệnh Streptococcus iniae trong nuôi trồng thủy sản 5

1.3.2 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra trên cá chẽm 6

1.4 Dấu hiệu bên ngoài và giải phẫu bệnh lý bên trong cá chẽm bệnh do Streptococcosis iniae gây ra 7

1.5 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus iniae 8

1.6 Biện pháp phòng trị bệnh trên cá chẽm do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra 10

1.7 Tổng quan về đáp ứng miễn dịch ở gà 11

1.7.1 Nguyên lý tạo kháng thể lòng đỏ trứng 11

1.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo miễn dịch ở gà 13

1.7.2.1 Kháng nguyên 13

1.7.2.2 Liều lượng tiêm 15

1.7.2.3 Vị trí tiêm 15

1.7.2.4 Số lần tiêm và khoảng cách giữa các lần tiêm 15

1.7.2.5 Tá dược 16

1.7.2.6 Các nhân tố khác 17

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 19

2.2 Vật liệu nghiên cứu 19

2.2.1 Cá chẽm Lates calcarifer 19

2.2.2 Gà mái đẻ trứng 19

2.2.3 Chủng vi khuẩn……… ……….19

2.3 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 20

2.4 Phương pháp nghiên cứu 20

2.4.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn 20

2.4.2 Định danh vi khuẩn 21

2.4.3 Xác định độ nhạy kháng sinh của chủng Streptococcus iniae phân lập 23

2.4.4 Phương pháp điện di SDS-PAGE 24

2.4.5 Phương pháp gây miễn dịch trên gà bằng vi khuẩn S iniae bất hoạt 29

2.4.6 Tách chiết và tinh sạch IgY lòng đỏ trứng gà bằng phương pháp Polson 31

2.4.7 Phương pháp Bradford 32

2.4.8 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Nghiên cứu đặc điểm của các chủng vi khuẩn Streptococcus iniae phân lập từ cá chẽm 34

3.1.1 Các dấu hiệu bệnh lý 34

3.1.2 Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập 35

3.1.3 Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập 36

3.1.4 Kết quả giải trình tự gen 16S-rDNA của các chủng vi khuẩn phân lập 40

3.1.5 Xác định độ nhạy kháng sinh của chủng Streptococcus iniae 40

3.1.6 Kết quả phân tích protein của S iniae bằng điện di SDS - PAGE 42

3.2 Xác định khả năng sử dụng vi khuẩn S iniae bất hoạt làm kháng nguyên cho việc sản xuất kháng thể lòng đỏ trứng 43

3.2.1 Tính vô khuẩn của kháng nguyên bất hoạt 43

3.2.2 Đường cong đáp ứng miễn dịch ở gà (kết quả nồng độ IgY qua các tuần đáp ứng miễn dịch) 43

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 47

Kết luận 47

Kiến nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ANOVA Analysis Of Variance

API 20 Strep Kit định danh các loài streptococci và enterococci

APS Ammonium Persulfate

BSA Bovine Serum Albumin

FCA Freund’s Complete Adjuvant

FIA Freund’s Incomplete Adjuvant

h Giờ

IgY Egg - Yolk Immunoglobulin

OD Optical Density

PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis

PBS Phosphate Buffered Saline

PEG Polyethylene Glycol

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

TEMED N,N,N,N’– Tetramethylethylenediamine

TSA Trypticase Soy Agar

TSB Trypticase Soy Broth

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus iniae 9

Bảng 2.1 Thành phần và các dung dịch điện di protein 28

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm gây tạo miễn dịch trên gà đẻ trứng 30

Bảng 2.3 Phương pháp pha dung dịch BSA dựng đường chuẩn 32

Bảng 3.1 Một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm 38

Bảng 3.2 Độ nhạy cảm kháng sinh của chủng vi khuẩn S iniae phân lập từ các chẽm nuôi tại Cam Ranh – Khánh Hòa 41

Bảng 3.3 Nồng độ IgY tinh sạch từ lòng đỏ trứng ở các tuần sau khi gây miễn dịch 44

Bảng 3.4 ANOVA kiểm định kết quả đáp ứng miễn dịch giữa nhóm gà miễn dịch và nhóm gà đối chứng 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Quá trình hình thành kháng thể sau khi tiêm kháng nguyên 12

Hình 1.2 Tóm tắt kháng thể lòng đỏ trứng được tạo ra bởi miễn dịch thụ động trong gia cầm 13

Hình 2.1 Gà mái đẻ trứng ISA-Brown 19

Hình 2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 20

Hình 2.3 Cá chẽm Lates calcarifer 21

Hình 2.4 Bộ điện di SDS – PAGE (Bio-Rad)……… ………24

Hình 2.5 Sự hình thành polymer hóa của acrylamide 26

Hình 2.6 Mô hình gel điện di (SDS-PAGE) 27

Hình 3.1 Cá chẽm nhiễm Streptococcus iniae 34

Hình 3.2 Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên cá chẽm 35

Hình 3.3 Hình thái vi khuẩn nhuộm Gram 36

Hình 3.4 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn Streptococcus iniae phân lập được trên cá chẽm 37

Hình 3.5 Kết quả SDS-PAGE protein của vi khuẩn Streptococcus iniae 42

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn tương quan giữa nồng độ IgY qua các tuần đáp ứng miễn dịch 44

LỜI MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, khi nghề nuôi tôm sú đi vào giai đoạn thoái trào, thật sự đã tạo một bước ngoặt lớn đối với nghề nuôi cá đặc biệt là cá chẽm Với nhiều ưu điểm như tốc độ sinh trưởng khá nhanh, dễ nuôi, năng suất nuôi cao và có giá trị kinh tế, cá chẽm đã dần là đối tượng nuôi quan trọng ở nhiều vùng của nước

ta Sự phát triển nghề nuôi cá chẽm gia tăng nhanh chóng cả về quy mô và diện tích nhưng lại thiếu sự quản lý, quy hoạch cũng như không chú ý đảm bảo yếu tố môi trường là những điều kiện để dịch bệnh bùng phát, gây thiệt hại lớn đến sản lượng thu hoạch và nguồn thu kinh tế thủy sản trong thời gian qua

Trong số các bệnh thường gặp ở cá chẽm (Lates calcarifer) có thể kể đến bệnh Streptococcosis do các chủng vi khuẩn Streptococcus gây ra Chúng là những vi

khuẩn hình cầu, có đường kính lên đến 1,5 µm, các tế bào thường ghép với nhau tạo thành chuỗi liên cầu khuẩn Những liên cầu khuẩn này thuộc vi khuẩn Gram (+), không sinh bào tử, không di động và tác động của chúng gây ra thiệt hại rất lớn đến nghề nuôi cá biển trên thế giới, cũng như tại Việt Nam Vì vậy, việc nghiên cứu các

chủng vi khuẩn Streptococcus để điều trị bệnh cho cá là điều cần thiết

Cho đến nay, các biện pháp phòng và chữa bệnh chủ yếu vẫn là sử dụng thuốc sát trùng, kháng sinh và gần đây là vaccine Tuy nhiên, thuốc sát trùng thường để lại hậu quả nghiêm trọng về môi trường Bên cạnh đó, thuốc kháng sinh cũng có nguy

cơ dẫn đến phá vỡ hệ vi khuẩn chính trong môi trường và có thể để lại dư lượng trong cá, tạo ra những tác động tiềm ẩn gây nguy hại cho môi trường và con người Việc sử dụng vaccine tuy an toàn với con người và môi trường nhưng nó chỉ mang tính phòng bệnh mà không mang tính chữa bệnh Trước tình hình đó, cần có các chế phẩm sinh học không độc, chứa những thành phần có tác dụng ức chế và tiêu diệt đặc hiệu mầm bệnh gây bệnh Công nghệ sản xuất kháng thể IgY ở gà đã được chứng minh có khả năng đáp ứng được các yêu cầu trên do kháng thể IgY từ máu gà mái được chuyển qua và tích tụ trong lòng đỏ trứng của chúng, nên chỉ cần gây miễn dịch cho gà mái và thu hoạch trứng có kháng thể Hơn thế, việc sử dụng kháng thể trứng gà (IgY) còn cho rất nhiều ưu điểm như dễ dàng thu nhận dựa trên việc

thu nhận trứng gà, việc sản xuất IgY rất thuận lợi và kinh tế vì chi phí cho nuôi gà thấp mà năng suất sản sinh kháng thể rất cao

Trên thế giới, đã có các nghiên cứu công bố ứng dụng của kháng thể lòng đỏ trứng (IgY) trong việc phòng và trị bệnh Streptococcosis, nhưng ở Việt Nam việc ứng dụng kháng thể trứng gà (IgY) trong trị bệnh Streptococcosis vẫn còn rất mới

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và khả

năng gây đáp ứng miễn dịch trên gà đẻ trứng của chủng vi khuẩn Streptococcus

iniae phân lập từ cá chẽm”

Mục tiêu của đề tài:

Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn Streptococcus iniae gây bệnh ở cá chẽm

nuôi và xác định khả năng sản sinh kháng thể lòng đỏ trứng IgY của gà được miễn

dịch với vi khuẩn S iniae bất hoạt

Các nội dung chính của đề tài:

1 Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn S iniae từ cá

chẽm

2 Phân tích protein của chủng vi khuẩn S iniae phân lập được

3 Xác định khả năng sử dụng vi khuẩn S iniae bất hoạt làm kháng nguyên cho

việc sản xuất kháng thể lòng đỏ trứng

Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn, kiến thức còn hạn chế và bước đầu làm quen với phương pháp nghiên cứu khoa học nên đồ án khó tránh khỏi những sai sót Kính mong các thầy cô cùng bạn đọc đóng góp ý kiến để đồ án được hoàn thiện hơn

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.1 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới

Do giá trị dinh dưỡng cao, nhu cầu thị trường ngày càng mở rộng và là loài phân bố rộng lại dễ nuôi đã làm cho cá chẽm trở thành một loài có giá trị kinh tế quan trọng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc Châu Á Thái Bình Dương Kỹ thuật nuôi cá chẽm được phát triển lần đầu tiên ở phòng thí nghiệm Songkhla Marine (Thái Lan) từ những năm đầu của thập niên 1970 Đến năm 1973 họ đã đạt được thành công bằng việc sử dụng đàn cá bố mẹ thành thục được bắt ngoài tự nhiên cho thụ tinh nhân tạo Tiếp đó kỹ thuật sinh sản nhân tạo được cải tiến và đạt được thành công, đến năm 1975 họ đã sử dụng đàn cá bố mẹ thành thục trong điều kiện nuôi cho sinh sản thành công và hoàn thiện các giai đoạn phát triển của vòng đời cá chẽm trong điều kiện sinh sản nhân tạo Sau đó, kỹ thuật này được sử dụng rộng dãi tại các trạm thủy sản và các trạm sản xuất tư nhân khác Năm 1977, Trạm Thủy Sản Rayong sử dụng hormone kích thích sinh sản nhân tạo thành công Sau đó quy trình sản xuất giống cá chẽm được phát triển rộng và là sản phẩm thương phẩm của nhiều nước: Thái Lan, Malaysia, Singapore, Indonesia, Hồng Kông, Đài Loan trong các ao nước lợ, nước ngọt cũng như nuôi trong lồng ở ven biển Gần đây, kỹ thuật nuôi cá chẽm được phát triển ở một số quốc gia như Mỹ, Hà Lan và Anh [21]

1.1.2 Tình hình nuôi cá chẽm ở Việt Nam

Ở nước ta, cá biển được nuôi ở cả 3 vùng biển phía Bắc, vùng Nam Trung

Bộ và vùng phía Nam Các loài nuôi chính là loài cá mú (Epinephelus), cá giò (Rachycentron canadum), cá hồng đỏ (Lutjanus erythropterus), cá tráp đen (Rhabdosargus sarba) và cá chẽm (Lates calcarifer) Trong đó, cá chẽm là loài rộng

muối có khả năng chống chịu tốt với những biến động của môi trường Ở Việt Nam,

cá chẽm được xem như là đối tượng nuôi thay thế cho diện tích nuôi tôm không hiệu quả ở một số địa phương ven biển ở nước ta Tuy nhiên, hiện nay chưa có số liệu thống kê cụ thể về sản lượng cũng như diện tích nuôi cá chẽm ở nước ta, nhưng

qua thông tin từ các báo cáo cho thấy cá chẽm được nuôi ở nhiều nơi như Cam Ranh (Khánh Hòa), Hương Trà (Thừa Thiên Huế), Hà Tĩnh, Bình Định, Cà Mau

Bệnh vi khuẩn nhiễm trùng máu xuất huyết: Gây ra bởi Aeromonas spp.,

Pseudomonas sp Các vi khuẩn này thường nhiễm ở cá nước ngọt, làm cá bị xuất

huyết đỏ ở da, lờ đờ, cá biếng ăn, tích dịch ở bụng, mang nhợt nhạt Bệnh thường xuất hiện khi môi trường xấu, da bị tổn thương [1]

Bệnh vi khuẩn ở da: Do Aeromonas sorbia, Aeromonas hydorphila, Vibrio

harveyi, Vibrio alginolyticus gây nên, làm cá bị lở loét không đều, mất vảy Bệnh

thường xảy ra khi môi trường xấu, da bị tổn thương

Bệnh hoại tử viêm ruột và mưng mủ: Hội chứng hoại tử viêm ruột mưng mủ, xuất hiện một cách định kỳ ở các trại nuôi cá chẽm Hội chứng này ảnh hưởng đến

cá cỡ nhỏ tới các cá thể thành thục, gặp ở cá nước ngọt và nước mặn Người ta phân

lập được Vibrio harveyi và Photobacterium damselae subsp damselae trên cá bị

bệnh này Cá bị bệnh thường bụng phình, hôn mê và chết Điểm đặc trưng của bệnh

là mùi của cá sắp chết hoặc mới chết giống mùi của cá đã chết một ngày, khoang bụng bị xưng phồng bởi một lượng lớn dịch thủy phân [1]

Bệnh streptococcosis: Streptococcosis là bệnh rất nghiêm trọng, tác nhân

chính của bệnh là Streptococcus iniae Bệnh có thể xảy ra ở cả cá chẽm nuôi nước

ngọt lẫn nước mặn và kết quả làm cho cá chết với tỷ lệ cao [1], [23]

1.2.2 Bệnh do kí sinh trùng

Bệnh trypanosomosis: là bệnh gây ra bởi Trypanosoma sp Dấu hiệu bệnh là

cá bị hôn mê, mất tập trung, mù mắt và chết Mắt cũng có thể bị lồi và bị xuất huyết

bên trong, đồng thời xuất hiện vùng lở loét xuất huyết và vùng ăn mòn trên da Bên trong, thận căng to và tình trạng thiếu máu xảy ra, kết quả làm cho cá chết với tỷ lệ cao [1]

Bệnh Piscinoodiniasis: Tác nhân gây bệnh là Piscinoodiniasis sp bệnh thường

gặp ở cá chẽm nuôi nước ngọt Bệnh xảy ra ở cá nhỏ thì có các vết mờ hoặc màu xanh bạc, ở cá lớn hơn thì có các mảng nổi trên bề mặt da và có các vết lở loét, nắp mang hoạt động mạnh, mang tiết dịch và có màu xanh đen [23]

Bệnh Amyloodiniasis: Tác nhân chính là do Amyloodinium ocellatum thường

gặp ở cá chẽm nuôi biển Bệnh thường xuất hiện khi nhiệt độ thấp và nhiệt độ giảm đột ngột [23]

Bệnh sán lá da: Gây ra bởi Neobenedinia melleni, Gyrodactylus spp Dấu hiệu

chính của bệnh là mắt mờ, xuất hiện các mảng trắng trên da, lở loét trên da Bệnh thường xảy ra ở điều kiện độ mặn cao và nhiệt độ nước thấp [1]

1.2.3 Bệnh do virus

Ở cá chẽm, đã phát hiện được hai virus gây bệnh chính là:

Bệnh virus gây hoại tử thần kinh VNN (Viral Nervous Necrosis): Tác nhân

gây bệnh là nhóm Nodavirus cá Đặc điểm của bệnh là virus làm thoái hóa các nơron thần kinh trong hệ thần kinh trung ương và võng mạc Vì vậy, khi bị nhiễm virus, cá ở trạng thái mất cân bằng, cơ không kiểm soát được và loạn chức năng thị giác [1]

Bệnh lymphocytis: Do Iridovirus gây nên Bệnh làm cho cá xuất hiện các mụn

cóc trên da, vây, thông thường chỉ gây chết nếu xâm nhiễm nhiều và kết hợp với điều kiện môi trường xấu, giai đoạn cá ấu niên thường dễ mắc bệnh hơn cá trưởng thành [23]

1.3 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra trong nuôi trồng thủy sản 1.3.1 Tình hình dịch bệnh Streptococcus iniae trong nuôi trồng thủy sản

Streptococcosis là một bệnh truyền nhiễm xảy ra không chỉ ở cá nước ngọt, cá nước mặn, trong các trại nuôi mà còn thấy ở ngoài tự nhiên Các chủng Streptococci

gây ra bệnh ở động vật thủy sản là: Lactococcus garvieae, Streptococcus parauberis

và Streptococcus iniae Trong đó, Streptococcus iniae được coi là tác nhân chính

gây bệnh ở động vật thủy sản

Streptococcus iniae được phân lập đầu tiên vào năm 1976 trên cá heo nước ngọt

vùng Amazon Inia geoffrensis, đến năm 1979 thì phát hiện đầu tiên trên cá nuôi, loài cá

nhiễm bệnh là cá Yellowtail seriola spp ở Nhật Bản Streptococcus iniae được xem là

tác nhân gây bệnh trên nhiều ký chủ khác nhau, theo thống kê đến năm 2007 trên thế giới đã có trên 27 loài cá nước ngọt và nước mặn nhiễm bệnh do vi khuẩn này gây ra

Các đối tượng nuôi nước mặn được báo cáo thấy xuất hiện như: Yellowtail seriola spp.,

cá bơn ở Nhật Bản Paralichthys olivaceus, cá đù đỏ Sciaenops ocellatus ở Israel, gần đây là cá chẽm Lates calcarifer ở Australia và cá giò Rachycentron canadum Bệnh cũng xảy ra ở một số loài cá nước ngọt như: cá rô phi Oreochromis niloticus x O

aureus, cá hồi Oncorhynchus mykis Các quốc gia được thông báo chịu ảnh hưởng

nặng nề bệnh do Streptococcus iniae gây ra như Nhật Bản, Irasel, Mỹ, Australia [9], [13], [17] Ở Việt Nam các nghiên cứu về bệnh do Streptococcus iniae gây ra trên đối

tượng thủy sản chưa nhiều, có thấy báo cáo nghiên cứu của Hich và Duzng (2011) về

phân lập được vi khuẩn này trên cá chẽm nuôi ở Khánh Hòa và báo cáo Streptococcus

iniae gây bệnh xuất huyết ở cá rô phi [3], [12]

1.3.2 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae gây ra trên cá chẽm

Bệnh do Streptococcus iniae gây ra trên cá chẽm Lates calcarifer được thông

báo xảy ra từ rất sớm vào giữa những năm 1980, Singapore là quốc gia đầu tiên báo cáo sự xuất hiện bệnh trên cá chẽm, bệnh cũng được thông báo đồng thời trên cá dìa

(Singanus canaliculatus) Tuy nhiên, dịch bệnh gây chết trên cá dìa rất cao nhưng

với cá chẽm tỉ lệ gây chết rất thấp [9], [21]

Trung quốc là nước thứ hai thông báo về bệnh Streptococcosis trên cá chẽm

với tỷ lệ chết từ 16,7 – 32,6 %, tuy nhiên chưa xác định được loài Streptococcus gây

bệnh [9]

Từ năm 1992, Australia thông báo S iniae gây bệnh vào mỗi mùa hè với thiệt

hại khoảng 8-15% sản lượng cá chẽm nuôi lồng trên biển hàng năm, có thể lên đến 70% khi bệnh bùng phát dữ dội [9], [21]

Vào năm 2003 và 2004, Streptococcus iniae cũng được thông báo gây tác

động nghiêm trọng đến nghề nuôi cá chẽm ở khu vực phía Nam Thái Lan [19] Năm 1992, Úc thông báo về tác nhân gây bệnh liên cầu khuẩn trên cá chẽm nuôi, trong thời gian rất ngắn số lượng cá chết tăng lên và tác nhân này được xem như loài vi khuẩn quan trọng nhất ảnh hưởng đến chất lượng nuôi cá chẽm ở Queensland [9]

1.4 Dấu hiệu bên ngoài và giải phẫu bệnh lý bên trong cá chẽm bệnh do

Streptococcus iniae gây ra

Dấu hiệu điển hình do Streptococcus iniae gây ra trên cá chẽm, gồm có: Màu

sắc đen tối, cá có biểu hiện bơi lội không bình thường, mắt cá lồi và đục, xuất huyết

ở các vây và xương nắp mang Các vết xuất huyết lan rộng thành lở loét, nhưng các vết loét thường nông hơn các bệnh có lở loét khác Cá bị bệnh vận động khó khăn, bơi không định hướng hay có hình thức bơi xoắn [1]

Bên trong cơ thể cá bệnh có sự tổn thương nội quan, như: Ở thận, vi khuẩn được tìm thấy trong mô và trong các tế bào máu ở tiền thận, trong cầu thận và những tế bào biểu mô ống thận Ở lách, vi khuẩn xuất hiện thành từng đám ở màng ngoài lách và trong những tế bào máu ở khu vực của lách Đó là lý do dẫn đến sự tăng lên về thể tích tại hai cơ quan thận và lách Tại một số cơ quan khác: vi khuẩn xuất hiện nhiều tại các mao mạch ở mô gan, cấu trúc gan xuất hiện nhiều không bào, xung huyết và thoái hóa một số khu vực Ở ruột, vi khuẩn xuất hiện trong thành ruột, trong mạch máu dưới biểu mô và lớp nhầy trên bề mặt biểu mô ruột Tại não, vi khuẩn xuất hiện ở khu vực màng não, hốc não và một số tế bào máu trong não; mô não có hiện tượng xung huyết nghiêm trọng Tại mắt, vi khuẩn xuất hiện trên lớp nhân ngoài của võng mạc mắt; dẫn đến mắt cá bị đục và lồi Thường thì sự tổn thương nội quan này là lý do gây chết ở cá, với tỷ lệ gây chết rất cao Trường hợp này gọi bệnh ở dạng cấp tính Tuy nhiên, bệnh có thể xảy ra ở thể nhẹ (mãn tính), chỉ có một vài nốt xuất huyết trên thân mà không có hiện tượng thương tổn nội tạng, ở dạng này tỷ lệ chết cá rất thấp, chỉ chiếm 1% [3], [22]

1.5 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn

Lactococcus piscium và Vagococcus salmoninarum Tất cả chúng gây ra hội

chứng bệnh có tên là bệnh do liên cầu khuẩn (Streptococcosis) [9]

Streptococcus iniae cùng với vi khuẩn Lactococcus garvieae là những

tác nhân gây bệnh chủ yếu của bệnh Streptococcosis ở cá, theo ước tính nó

là nguyên nhân gây ra 50% số cá chết trong tháng đầu của vụ nuôi và tới 80% số cá nuôi bị tổn thất khi kết thúc vụ nuôi, đặc biệt nghiêm trọng nếu bệnh xảy ra vào những tháng mùa lạnh

Streptococcus iniae có dạng hình cầu, có thể đứng riêng lẻ, thành từng cặp

hoặc tạo thành chuỗi dài Vi khuẩn S iniae bắt màu Gram dương, phát triển

tốt trên môi trường thạch TSA, BHI, Muller - Hinton và thạch máu cừu Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp từ 25 - 280C Sau 24 - 48h nuôi cấy, vi khuẩn tạo thành khuẩn lạc nhỏ, màu trắng đục Một số chủng cho khuẩn lạc trong suốt có tính nhầy sau 24h nuôi cấy Trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc tạo vòng dung huyết beta nhỏ, trong suốt Vi khuẩn không phát triển ở điều kiện pH 9,6; NaCl 6,5%; nhiệt độ 100C và 450C [9], [10], [20]

S iniae lên men đường mannitol, ribose và không lên men lactose,

raffinose, arabinose Về đặc điểm sinh hóa S iniae cho phản ứng catalase,

Oxydase, VP Và Indol âm tính [9] Dựa theo các nghiên cứu trước đó, các

đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus iniae được thể hiện trong

Bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus iniae [9], [20]

Đặc điểm

Perera

và các cộng sự (1994)

Pier

và các cộng sự (1976)

Carson

và các cộng sự (1993)

Stoffregen

và các cộng sự (1995)

Hình dạng tế bào Cầu, liên

cầu

Cầu, liên cầu

Cầu, liên cầu

Cầu, liên cầu

1.6 Biện pháp phòng trị bệnh trên cá chẽm do vi khuẩn Streptococcus iniae

gây ra

Trong quá trình nuôi thì việc phòng bệnh rất quan trọng vì tránh được rủi ro lớn cho người nuôi Việc phòng bệnh được thực hiện như sau:

- Luôn giữ môi trường ao nuôi sạch, tránh ô nhiễm làm cá dễ bị nhiễm bệnh

- Sử dụng thức ăn tươi hoặc thức ăn hỗn hợp qua chế biến, không cho ăn thức ăn

ôi thiu, ươn

- Định kỳ thay nước ao nuôi, khoảng 10 – 15 ngày/lần hoặc 2 tháng dùng thuốc tím (K2MnO4) với nồng độ 1 – 5 ppm phun xuống ao với thời gian 20 -30 phút

- Khi phát hiện cá có dấu hiệu bệnh, cần vớt cá nuôi cách ly để có biện pháp xử lý phù hợp

- Tất cả cá bị bệnh, bị chết đều phải vớt lên và xử lý tiệt trùng, không vứt bừa bãi trách tạo sự lây lan nguồn bệnh cho ao khác

Việc phòng bệnh chỉ giúp giảm nguy cơ mắc bệnh, nhưng khi trong môi trường nuôi có tác nhân gây bệnh và gặp điều kiện thuận lợi cho nó thì tác nhân gây bệnh sẽ phát triển rất mạnh và làm gia nguy cơ mắc bệnh cho vật nuôi Hiện nay biện pháp chủ yếu vẫn đang được dùng để tiêu diệt vi khuẩn trong môi trường nuôi

là sử dụng thuốc kháng sinh Một số loại kháng sinh được dùng để tiêu diệt vi

khuẩn Streptococcus iniae gây bệnh trên cá như:

 Dùng Erythromycine: trộn vào thức ăn từ 3 - 7 ngày, dùng 2-5 g/100 kg cá/ngày

Có thể phun xuống ao với nồng độ 1 - 2 ppm sau đó qua ngày thứ 2 trộn vào thức

ăn 4 g/100 kg cá, từ ngày thứ 3 - 5 giảm bớt 1/2

 Dùng Minoxin - FH: là dung dịch kháng sinh thế hệ mới, với phổ kháng khuẩn rộng chuyên dùng để phòng ngừa và điều trị các bệnh xuất huyết, phù mắt, hoại

tử gan do Streptococcus sp

Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc kháng sinh gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe người sử dụng, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm do dư lượng hóa chất vẫn còn trong sản phẩm Hơn thế, sử dụng kháng sinh còn ảnh hưởng đến chất lượng nước và bùn đáy ao, tác động đến cấu trúc và tính đa dạng sinh học Tồn lưu trong

môi trường tác động đến hệ vi sinh vật trong môi trường và đưa đến các dòng vi khuẩn kháng thuốc

Ngoài thuốc kháng sinh, hiện nay trên thị trường cũng đã có Vaccine để phòng

bệnh Streptococcosis do Streptococcus iniae gây bệnh Tuy nhiên, việc sử dụng

Vaccine gây ảnh hưởng lớn đến tính kinh tế, hơn nữa nó chỉ có tác dụng phòng bệnh và khi trong ao nuôi có sự xuất hiện bệnh thì việc sử dụng vaccine không còn hiệu quả

Do đó, việc sử dụng chế phẩm sinh học nhằm hạn chế tối đa sử dụng kháng sinh trong việc phòng và trị bệnh thủy sản là khuynh hướng đúng nhằm tránh tạo ra các dòng vi khuẩn kháng thuốc ảnh hưởng đến sức khỏe vật nuôi và con người Trên thế giới, ứng dụng của công nghệ sản xuất kháng thể IgY ở gà đang được rất nhiều các nhà nghiên cứu quan tâm và đã có báo cáo công bố về ứng dụng kháng thể lòng đỏ trứng IgY trong việc phòng và trị bệnh Streptococoosis [18]

1.7 Tổng quan về đáp ứng miễn dịch ở gà

1.7.1 Nguyên lý tạo kháng thể lòng đỏ trứng

Gà mái bảo vệ thế hệ con bằng cách truyền kháng thể sang thông qua giai đoạn sớm của trứng Như vậy, gà mới nở được bảo vệ bởi cơ chế miễn dịch thụ

động cho đến khi hệ thống miễn dịch của chính chúng phát triển một cách đầy đủ

Tương tự như động vật hữu nhũ, ở gà khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, kháng thể chưa được sinh ra ngay lập tức mà phải sau một thời gian tiềm tàng (thời gian ngắn hay dài phụ thuộc nhiều vào kháng nguyên, lần kháng nguyên xâm nhập lần đầu hay lần 2, lần 3…) Sau đó kháng thể mới được sinh ra, lượng kháng thể tăng dần đạt mức cao nhất sau 2 – 3 tuần, rồi lượng kháng thể có thể giảm hoặc mất

đi (Hình 1.1)

Kháng nguyên vào cơ thể lần đầu gây đáp ứng miễn dịch gọi là đáp ứng miễn dịch thứ cấp hay miễn dịch tiên phát Kháng nguyên vào cơ thể lần hai, đáp ứng miễn dịch gọi là đáp ứng miễn dịch thứ cấp hay miễn dịch thứ phát

Hình 1.1 Quá trình hình thành kháng thể sau khi tiêm kháng nguyên [3]

Khi kháng nguyên vào lần 2 thời gian tiềm tàng ngắn hơn, lượng kháng thể sản xuất ra nhiều hơn và thời gian xuất hiện kháng thể sớm hơn Sự khác biệt của đáp ứng miễn dịch sơ cấp và thứ cấp là do vai trò của các tế bào nhớ miễn dịch lympho bào T “nhớ”, lympho B “nhớ” Ở miễn dịch thứ phát các tể bào “nhớ” miễn dịch phát triển nhanh và mạnh tạo ra một lớp tế bào sản xuất kháng thể đặc hiệu vì thế kháng thể xuất hiện sớm hơn, cường độ đáp ứng miễn dịch dài hơn, mạnh hơn

Kháng thể ở gà gồm có ba loại: IgA, IgM và IgY Khi trứng gà vẫn còn trong buồng trứng, gà mái tiến hành chuyển kháng thể vào trứng theo cơ chế sau: IgA và IgM (nồng độ khoảng 0,15 và 0,7 mg/mL) được tiết ra cùng với những protein khác là thành phần của lòng trắng trứng gà tại vòi trứng Trong khi đó, IgY trong huyết thanh ở nồng độ khoảng 25 mg/ml được chuyển một cách đặc hiệu sang màng lòng đỏ vào trong lòng đỏ trong suốt quá trình phát triển Vì receptor đặc hiệu cho việc chuyển IgY xuất hiện trên bề mặt của màng lòng đỏ

Ở gà con mới nở, IgY được tìm thấy trong máu, còn IgA và IgM trong đường tiêu hóa

Hình 1.2 Tóm tắt kháng thể lòng đỏ trứng được tạo ra bởi miễn dịch thụ động trong

gia cầm [11]

Dựa trên các nguyên lý này, muốn thu kháng thể đặc hiệu thì tiến hành gây miễn dịch trên gà mái Sau khi bị tiêm kháng nguyên thì gà mái sẽ tự động tạo ra IgY đặc hiệu cho kháng nguyên quan tâm IgY đặc hiệu này sẽ được chuyển vào trong lòng đỏ trứng gà Tiến hành thu nhận lòng đỏ trứng của gà miễn dịch sẽ thu được kháng thể đặc hiệu mong muốn (Hình 1.2)

1.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo miễn dịch ở gà

Để là một chất sinh miễn dịch bắt buộc phải thỏa mãn ba yếu tố sau đây:

 Tính lạ: Chất được gọi là kháng nguyên trước hết phải là một chất lạ với cơ thể, bởi vì bình thường cơ thể không đáp ứng bảo vệ với các chất của bản thân Chất càng lạ với cơ thể bao nhiêu, khả năng kích thích tạo kháng thể càng mạnh bấy nhiêu

 Khối lượng phân tử lớn: Nhìn chung kháng nguyên có khối lượng phân tử lớn hơn 10000 Da Nếu < 1000 Da (penicilin, progesteron, aspirin…) thì không có tính sinh miễn dịch Từ 1000 đến 6000 Da (insulin) có thể có hoặc không có khả năng đáp ứng miễn dịch

 Cấu trúc phân tử phức tạp: Một chất có tính sinh miễn dịch phải là chất có cấu trúc hóa – lí tương đối phức tạp Các chất có cấu trúc càng phức tạp thì tính sinh miễn dịch càng cao

Kháng nguyên có thể hiện diện với hệ thống miễn dịch là phức hợp kháng nguyên (ví dụ: vi khuẩn, virus và kí sinh vật) hay là kháng nguyên đơn giản (ví dụ: protein hay polysaccharide) Proteins được nhận diện là kháng nguyên hiệu quả bởi

vì cấu trúc và sự khác biệt xuất hiện giữa các loài và các cá thể Peptide (khối lượng phân tử thấp dưới 10 kDa) có thể được sử dụng là kháng nguyên, nhưng nó nên được kết hợp với chất mang (ví dụ bovine serum albumin hay keyhole limpet haemocyanin) Kháng nguyên polysaccharide cũng hiệu quả Tuy nhiên, lipid và nucleic acid không thể là kháng nguyên nếu chúng không được bắt cặp với protein hay polysaccharide [11]

Sự liên kết giữa kháng nguyên với kháng thể hay giữa kháng nguyên với tế bào lympho luôn mang tính đặc hiệu cao Kháng thể hay tế bào lympho không phải liên kết với toàn bộ phân tử kháng nguyên mà chỉ với những phần nhất định của kháng nguyên, gọi là quyết định kháng nguyên hay epitope Phần tương ứng với nó trên mỗi kháng thể gọi là vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratope Phần tương ứng với quyết định kháng nguyên nằm trên tế bào lympho gọi là thụ thể Kích thước của epitope khoảng 7 x 12 x 35 Ao gồm 5 - 7 axit amin Một kháng nguyên có nhiều epitope khác nhau sẽ tạo thành nhiều dòng kháng thể khác nhau tương ứng với từng epitope

1.7.2.2 Liều lượng tiêm [11]

Liều lượng của kháng nguyên ảnh hưởng rất nhiều đến đáp ứng miễn dịch Quá nhiều hay quá ít kháng nguyên có thể dẫn đến sự giảm bớt, độ nhạy, sức chịu

và những đáp ứng không mong muốn khác Behn và cộng sự (1996) đạt được những kết quả tốt hơn khi tiêm vào gà với 0,1 mg của IgG chuột, thay vì 1,0 mg Schwarzkof và cộng sự (2000) thấy rằng việc tiêm nồng độ kháng nguyên trong khoảng giữa 10 µg và 1 mg tạo ra đáp ứng miễn dịch tốt, và điều này cũng được báo cáo bởi các nhà khoa học khác

Liều lượng tiêm phù hợp phụ thuộc rất nhiều vào loại kháng nguyên Nếu kháng nguyên là protein thì lượng protein khoảng 10 - 100 µg protein nên được sử dụng

1.7.2.3 Vị trí tiêm

Có nhiều cách tiến hành thực hiện miễn dịch như là tiêm trong tĩnh mạch; tiêm

ở bụng; tiêm dưới da Tiến trình tiêm trong tĩnh mạch không được khuyến khích dùng và không thể sử dụng cho kháng nguyên đặc biệt hay tá dược đặc biệt Vì mục đích thực nghiệm và lý do kinh tế, gà thường được tiêm vào trong cơ ngực Trong phòng thí nghiệm, gà có thể tiêm vào dưới da cổ, dưới da cánh Với động vật còn non, thích hợp cho việc tiêm vào trong cơ của cơ ngực, bởi vì tiêm dưới da thường khó thực hiện hơn và có thể gây ra stress Việc tiêm vào trong cơ dưới chân cần tránh, vì chúng có thể dẫn đến việc đi khập khiễng [4]

Gần đây, phương pháp miễn dịch bằng đường miệng cũng thu hút nhiều sự chú ý Mặc dù khả năng kích thích theo miễn dịch theo đường miệng là thấp hơn nhiều so với phương pháp tiêm Tuy nhiên, miễn dịch bằng đường miệng thường được xem là bớt gây đau hơn cho động vật, và được xem là sự tiến bộ trong các phương thức miễn dịch tạo kháng thể Phương pháp này được thực hiện bằng cách đưa hỗn hợp kháng nguyên và tá dược qua đường miệng và qua đường mũi họng

1.7.2.4 Số lần tiêm và khoảng cách giữa các lần tiêm

Tổng số lần tiêm phụ thuộc vào loại và liều lượng kháng nguyên, cũng như tá dược được sử dụng Trong mọi trường hợp, phải có ít nhất hai lần miễn dịch Nếu

lượng kháng thể bắt đầu giảm thì nên gây tạo miễn dịch để duy trì kháng thể đặc hiệu luôn ở mức độ cao Kháng thể lòng đỏ nên được kiểm tra sau 14 ngày của lần miễn dịch sau cùng Nếu lượng kháng thể quá thấp, sẽ tiếp tục thực hiện lại việc tiêm Thường những kết quả báo cáo cho thấy khoảng cách lần tiêm thứ nhất và thứ hai và những lần tiêm tiếp theo nên tiến hành sau 2 đến 4 tuần sẽ cho hiệu quả cao [11]

1.7.2.5 Tá dược

Tác dụng của tá dược

Khái niệm tá dược được nghĩ ra bởi Ramon năm 1925 Những chất được sử dụng đầu tiên là tinh bột, agar và saponin là tá dược cơ bản Tá dược là chất kích hoạt miễn dịch có tác dụng củng cố việc sản xuất của kháng thể đa dòng Mặc dù sự kích hoạt này diễn ra độc lập với loại kháng nguyên và vì vậy không đặc hiệu, nhưng nó làm tăng chất lượng và tính đặc hiệu của đáp ứng miễn dịch Con đường chính xác trong đó thể hiện hoạt động của chúng chưa được hiểu rõ toàn bộ Chúng làm tăng cả đáp ứng miễn dịch dịch thể và tế bào và tạo ra nhớ miễn dịch Tá dược kéo dài sự giải phóng của kháng nguyên vì vậy tạo nên hiệu quả cũng như tạo nên kích thích nội bộ sau khi miễn dịch

Tá dược có thể ảnh hưởng toàn bộ hay một phần lên thành phần trong suốt đáp ứng miễn dịch Tế bào T bị kích hoạt muramyldipeptide (MDP) là một thành phần của thành tế bào của mycobacteria có tiềm năng tạo miễn dịch mạnh Mặt khác tế bào B được kích hoạt mạnh bằng lipopolysaccharide [4]

Điểm bất lợi của việc sử dụng tá dược được chứng minh là có tác dụng phụ, nên những nghiên cứu mở rộng tìm kiếm chất thay thế bắt đầu Những tác dụng phụ sau đây có thể ít hoặc không có: Sự đau u hạt dẫn đến sưng viêm có thể dẫn đến sự

di căn; Tác động gây ung thư ngẫu nhiên; Nguy cơ gây ra dị ứng trong trường hợp

sử dụng lặp lại; Tác động ngược lên chất lượng thịt nếu sử dụng động vật trang trại

Tá dược Freund (Freund adjuvant)

Ngày nay, có rất nhiều loại tá dược được sản xuất Tuy nhiên, trong số này tá dược Freund vẫn được sử dụng nhiều nhất Tá dược Freund có hai dạng là hoàn toàn (FCA) và không hoàn toàn (FIA) Tuy FCA làm tăng hiệu quả miễn dịch tốt

hơn FIA nhưng cũng dễ gây ra phản ứng phụ hơn ví dụ gây viêm tại vùng mô tiêm

Vì vậy, một số nghiên cứu thích sử dụng kết hợp hai loại tá dược: FCA cho lần miễn dịch nguyên phát và FIA cho lần miễn dịch thứ phát [11]

Tá dược Freund dạng hoàn toàn (FCA) là hệ nhũ hóa dầu trong nước, bao

gồm: dầu khoáng, mannide mono-oleate, và Mycobacterium tuberculosis đã giết chết bởi nhiệt (hay M butycium) hay một số thành phần của vi sinh vật này FCA là

tá dược kích hoạt cả miễn dịch thể dịch và miễn dịch tương tác tế bào FCA thường phản ứng mạnh vì dầu khoáng không thể chuyển hóa và thành phần vi nấm có thể tạo ra một vài phản ứng viêm Nồng độ của vi nấm thay đổi lớn trong FCA thương mại Về phần này, cần chú ý rằng nếu nồng độ của vi nấm mà ít hơn 0,5 mg/ml thì kết quả phản ứng xưng viêm sẽ ít nghiêm trọng hơn

Tá dược Freund dạng không hoàn toàn (FIA) có thành phần giống như FCA nhưng không có tế bào vi nấm hay thành phần tế bào FIA thì ít hiệu quả hơn so với FCA trong việc tạo ra kháng thể cao hơn và tạo giữ miễn dịch tương tác tế bào FIA thường được dùng cho các lần miễn dịch thứ phát

1.7.2.6 Các nhân tố khác

Barua (2000) xác định hiệu quả của tuổi và việc xử lý estrogen lên nồng độ

IgY trong lòng đỏ trứng gà Gallus domesticus Nồng độ IgY trong gà mới đẻ trứng

cao hơn gà đẻ trứng già Do cá thể trưởng thành hệ thống cơ quan, tế bào miễn dịch hoàn thiện cho đáp ứng miễn dịch mạnh và lượng kháng thể sinh ra nhiều hơn Khi

cá thể già cơ quan miễn dịch suy giảm làm giảm đáp ứng miễn dịch tế bào nên lượng kháng thể tạo ra giảm [2]

Li (1998) so sánh trọng lượng của lòng đỏ và lòng trắng với phần trăm gà sản xuất hằng ngày và kháng thể lòng đỏ (IgY) sản xuất ở Single-Comb White Leghorn (SCWL) và Rhode Island Red (RIR) được miễn dịch với huyết thanh albumin của

bò (BSA) Phần trăm của tổng IgY cũng như kháng thể đặc hiệu cho BSA được sản xuất ra trong trứng là tương đương nhau Tuy nhiên, gà SCWL sản xuất ra trứng có khối lượng lòng đỏ cao hơn và phần trăm gà đẻ trong ngày cao hơn [4]

Tokarzewski (2002) nghiên cứa ảnh hưởng của kháng sinh như là enrofloxacin

và chloramphenicol lên mức độ IgY trong huyết thanh và lòng đỏ sau khi kích hoạt

miễn dịch trên gà với kháng nguyên Samonella enteritidis Cả hai kháng sinh thử

nghiệm đều làm giảm mức độ đặc hiệu của IgY trong gà đẻ trứng được miễn dịch với vi khuẩn sống và lypopolysaccharide, thể hiện rằng kháng sinh có tác động mạnh lên hệ thống miễn dịch [4]

Theo Wang (2000), chế độ ăn uống acid béo không bão hòa tác động mạnh lên

sự phân chia của tế bào bạch huyết gà đẻ trứng và nồng độ IgG trong huyết thanh và trong lòng đỏ trứng gà Dầu hạt lanh trong khẩu phần tăng nồng độ IgG trong huyết thanh gà đẻ trứng trong khi đó dầu hướng dương trong khẩu phần ăn làm giảm nồng

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

 Thời gian thực hiện đề tài: Từ ngày 25/02/2013 đến 30/06/2013

 Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Thí nghiệm – Thực hành, Viện Công nghệ sinh học & Môi trường, Trường Đại học Nha Trang

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Cá chẽm Lates calcarifer

Cá chẽm Lates calcarifer (Bolch, 1790) có những biểu hiện bệnh lí đặc trưng:

bơi không định hướng, mắt lồi, xuất huyết ở các gốc vây, bụng trướng to…

2.2.2 Gà mái đẻ trứng

4 con gà mái đẻ 25 tuần tuổi thuộc giống gà ISA – Brown, cho năng suất trứng rất cao (300-310 trứng/năm)

Gà được nuôi trong chuồng có mái che, đặt nơi thoáng mát, che chắn cẩn thận

và được nuôi bằng thức ăn dạng viên dành cho gà đẻ trứng Hàng ngày chuồng được

vệ sinh và thay nước để giữ điều kiện chuồng luôn sạch sẽ

Hình 2.1 Gà mái đẻ trứng ISA-Brown 2.2.3 Chủng vi khuẩn

Chủng chuẩn S iniae ATCC 29178 được cung cấp bởi trung tâm nghiên cứu

giống và dịch bệnh Thủy Sản, Trường Đại học Nha Trang

2.3 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

Hình 2.2 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 phương pháp phân lập vi khuẩn

a Dụng cụ và hóa chất

 Thiết bị và dụng cụ: Tủ ấm, nồi hấp, que cấy đầu tròn, bông, kéo, panh, túi nylon

 Hóa chất và môi trường: TSA (Merk, Germany) bổ sung 1,5% NaCl và KF Streptococcus agar (Merk, Germany), alcool 700

Phân lập vi khuẩn S iniae từ cá chẽm

chẽm

Nghiên cứu đặc điểm của các chủng vi khuẩn phân lập

(đặc điểm hình thái, test sinh hóa, định danh di truyền)

Xác định độ nhạy

kháng sinh của S iniae

Nghiên cứu khả năng sản sinh IgY lòng đỏ trứng của gà được miễn dịch

với S iniae bất hoạt

Nghiên cứu phân bố khối lượng

phân tử các protein của S iniae

c Phân lập vi khuẩn

Trước khi phân lập vi khuẩn, tiến hành mổ khám và quan sát các dấu hiệu bệnh lý của cá bệnh Mổ xoang bụng cá: mặt ngoài cơ thể cá được đánh sạch vảy và sát trùng thật kỹ bằng cồn 70o tại vị trí mổ để tránh sự tạp nhiễm vi khuẩn từ bên ngoài Cắt bỏ vây lưng và vây ngực Tiến hành mổ xoang bụng cá bằng dao mổ và kéo tiệt trùng theo 3 đường cắt (Hình 2.3) Dùng kẹp đã khử trùng gắp bỏ phần cơ bụng cá đã cắt Quan sát mô, cơ quan bên trong và ghi lại các dấu hiệu bệnh lí

Hình 2.3 Cá chẽm Lates calcarifer

Sau khi các dấu hiệu lâm sàng của cá bệnh được ghi lại Vi khuẩn sẽ được phân lập

từ 3 bộ phận là thận, gan và não của cá Dùng kẹp vô trùng gạt các phần nội tạng sang một bên, thận cá nằm sâu trong xoang bụng cá, ngay phía dưới xương sống Dùng mũi kéo đã khử trùng cắt một vết nhỏ trên thận Sau đó đưa que cấy vòng nhúng và xoay nhẹ vào chỗ cắt cấy ria trên môi trường TSA (Merk, Germany) bổ sung 1,5% NaCl và KF Streptococcus agar (Merk, Germany) Vi khuẩn được nuôi cấy ở 370C trong 24h Sau đó các khuẩn lạc đơn được chuyển sang môi trường nuôi cấy tương tự để cấy thuần

Mẫu gan và não cá cũng được lấy và nuôi cấy vi khuẩn tương tự như khi lấy ở mẫu

 Hóa chất và môi trường: Test API 20 Strep để thử đặc điểm sinh hóa của các chủng liên cầu khuẩn; giấy tẩm Tetramethyl Phenylenediamine Edihydroclorid

để thử phản ứng Oxidase; H2O2 để thử phản ứng Catalase; hóa chất nhuộm Gram: tím Violet, hồng Fushin, Liugol, dầu soi kính, cồn 70o; môi trường tổng hợp bổ sung 1,5% NaCl: TSA (Tryptic Soy Agar), TSB (Tryptic Soy Broth), BA (Blood Agar) có bổ sung 5% máu cừu; môi trường manitol để kiểm tra khả năng di động

và lên men đường manitol của vi khuẩn

b Phương pháp tiến hành

Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm được xác định bằng phương pháp nhuộm Gram Các chủng cầu khuẩn Gram dương sẽ tiếp tục được kiểm tra bằng hai phản ứng catalase và oxidase

Để kiểm tra hoạt tính Catalase của vi khuẩn, tiến hành nhỏ một giọt H2O2 30% vào tâm khuẩn lạc được đặt trên lam kính sạch

Để kiểm tra hoạt tính Oxidase của vi khuẩn, dùng đũa thủy tinh lấy khuẩn lạc của vi khuẩn miết lên miếng giấy đã tẩm sẵn thuốc thử oxidase (tetramethyl-p-phenylenediamine hydrochloride)

Các chủng cầu khuẩn Gram dương, âm tính với cả hai phản ứng catalase và oxidase sẽ được phân lập lại trên môi trường TSA bổ sung 1,5% NaCl nhằm thu được chủng vi khuẩn thuần khiết, sau đó các chủng này được lưu giữ ở -80oC trong môi trường TSB bổ sung 1,5% NaCl và có 20% glycerol

Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn lưu giữ được xác định bằng bộ Kit API20 STREP (BioMerieux, Pháp) Khả năng dung giải máu của các chủng vi khuẩn này được xác định bằng cách cấy ria các chủng vi khuẩn lên môi trường thạch máu BA (Blood agar base) có bổ sung 5% máu cừu Việc định danh các chủng vi khuẩn phân lập được dựa theo hệ thống định danh vi khuẩn của Bergey

(1974) so sánh với các phản ứng sinh hóa của chủng vi khuẩn S iniae ATCC 29178

chuẩn và các kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác [8], [9], [20] Đồng thời chúng tôi cũng kết hợp với việc định danh vi khuẩn mục tiêu bằng phần mềm của Kit API20 STREP và phần mềm ABIS trực tuyến [24]

Các chủng được xác định là vi khuẩn S iniae bằng các chỉ tiêu sinh hóa và

hình thái học sẽ được gửi định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử tại Công ty Nam khoa Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy tăng sinh, tách chiết và giải trình tự 16S rDNA và so sánh trình tự này với ngân hàng gene có sẵn bằng công cụ BLAST

2.4.3 Xác định độ nhạy kháng sinh của chủng Streptococcus iniae phân lập

Việc kiểm tra độ nhạy của chủng vi khuẩn phân lập được với các loại kháng sinh được tiến hành theo phương pháp của Bauer, 1996 [7]

a Môi trường và hóa chất

 Đĩa thạch Mueller-Hinton agar (MHA)

 Đĩa giấy tẩm kháng sinh: Norfloxacine (10 µg), Ciprofloxacin (5 µg), Sulphamethoxazol/trimethoprim (23,75/1,25 µg), Ampicillin (10 µg), Doxycycline (30 µg), Erythromycin (15 µg), Amoxicyclin (25 µg), Nalidicid acid (30 µg), Oxytetracycline (30 µg), Gentamycin (10 µg), Cephalexin (30 µg)

và streptomycin (10 µg)

b Phương pháp tiến hành

 Vi khuẩn thử nghiệm độ nhạy kháng sinh được lấy từ các khuẩn lạc đã được làm thuần và nuôi cấy trên môi trường TSA bổ sung 1,5% NaCl trong 24-48h Sau đó huyền phù trong nước muối sinh lý vô trùng

 Hút 100 µl dung dịch huyền phù vi khuẩn này, dùng que cấy trang thủy tinh trang đều dịch vi khuẩn lên bề mặt thạch Mueller-Hinton agar, đặt vào tủ ấm khoảng 15 phút

 Đặt các đĩa giấy kháng sinh lên bề mặt thạch để đảm bảo nó được tiếp xúc hoàn toàn với môi trường

 Lật ngược đĩa, đem ủ ở 300C/24h

 Đo đường kính vòng vô khuẩn của các đĩa giấy kháng sinh

 Đường kính vòng vô khuẩn sẽ được ghi lại để xác định độ nhạy của vi khuẩn với các loại kháng sinh

2.4.4 Phương pháp điện di SDS-PAGE [4]

SDS - PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

là phương pháp được Shapiro và cộng sự giới thiệu năm 1967, kể từ đó nó trở thành một phương pháp được sử dụng rộng nhất để phân tích hỗn hợp protein Phương pháp này điện di protein theo phương thẳng đứng và phân tách protein theo trọng lượng phân tử

a Dụng cụ và hóa chất

 Thiết bị và dụng cụ: Thiết bị điện di protein của hãng Bio – Rad (Mini PROTEAN® Tetra Cell) (Hình 2.4); máy ly tâm nhỏ, bể ổn nhiệt, máy đo OD; micropippet, đầu típ, eppendorf, cuvette

 Hóa chất: Monomer solution, 4X running gel buffer, 4x stacking gel buffer, SDS 10%, ammonium persulfate 10%, 2X treatment buffer (loading buffer), tank buffer, TEMED, protein thang chuẩn, staining solution, destaining solution I; đệm TES, Mix mutanolysine

Hình 2.4 Bộ điện di SDS – PAGE (Bio-Rad)

b Nguyên tắc

Các protein có thể được phân tách dựa trên khối lượng phân tử bằng điện di trên acrylamide dưới điều kiện đã bị biến tính Hỗn hợp protein được hòa tan trong dung dịch sodium dodecyl sulfate (SDS) là một chất tẩy mang điện tích âm nó sẽ phá tất cả các nối không cộng hóa trị của protein ban đầu Dithiothreitol (DTT) cũng có thể được thêm vào để làm giảm số nối disulfide Phức hợp SDS - protein đã

bị biến tính có một điện tích thực âm tỉ lệ thuận với khối lượng của protein Phức này sau đó cũng chính là mẫu để chạy điện di Nguyên lý của chạy điện di là khi ở trong điện trường, do tích điện âm nên các phân tử sẽ dịch chuyển về phía anode với tốc độ dịch chuyển của chúng khác nhau phụ thuộc vào khối lượng phân tử Các phân tử càng lớn thì dịch chuyển càng chậm Kết quả từ một điểm chung các phân

tử khác nhau sẽ được phân bố ở các vị trí (các band) khác nhau tương ứng với độ lớn của chúng

Phương pháp SDS - PAGE được tiến hành sử dụng gel polyacrylamide Gel polyacylamide là lưới gel hình thành do các sợi polymer của acylamide (polyacylamide) liên kết lại với nhau bằng các cầu nối đồng hóa trị (Hình 2.5) Gel polyacrylamide được pha từ hai thành phần chính là acrylamide và bisacrylamide Các sợi polyacrylamide được hình thành nhờ tác nhân hóa học hay tác nhân quang học Có hai tác nhân hóa học cần thiết, đó là ammonium persulfate đóng vai trò peroxide khởi động (initiator peroxidase) và quanternary amine N.N.N’.N’-tetramethylene diamine (TEMED) làm vai trò chất xúc tác Tác nhân quang học là ánh sáng UV bước sóng dài phối hợp với riboflavin làm tác nhân khởi động và TEMED làm tác nhân xúc tác Quá trình hình thành gel dẫn đến sinh nhiệt nên việc tối ưu nồng độ tác nhân khởi động và tác nhân xúc tác để quá trình này hoàn tất không quá nhanh

Có hai thông số để xác định kích thước gel: Tỉ lệ toàn bộ thành phần chất rắn (%T) và tỉ lệ kết nối chéo đối với acrylamide monomere (C%):

Chúng ta thấy rằng %T tăng thì kích thước gel sẽ nhỏ đi Trong khi đó %C cho biết

tỉ lệ bisacrylamide trong tổng số thành phần rắn và thông số này cũng ảnh hưởng đến kích thước gel

Có hai hệ thống điện di, một loại là hệ thống đệm liên tục và một là hệ thống đệm không liên tục Hệ thống đệm không liên tục cho độ phân giải tốt hơn nhiều lần

hệ thống đệm liên tục Hiện nay, SDS - PAGE thường dùng hệ thống đệm không liên tục và phổ biến nhất là hệ thống Laemmli (1970) biến thể từ hệ thống của Ornstein (1960) và Davis (1960)

Hình 2.5 Sự hình thành polymer hóa của acrylamide

Trong hệ thống đệm không liên tục thì gel polyacrylamide được đổ thành hai lớp Lớp ở trên có kích thước gel lớn và không hạn chế, được gọi là lớp stacking gel Ở lớp dưới là lớp gel để phân tách các thành phần protein chạy điện di, được gọi là running gel (Hình 2.6) Hai lớp này được pha với hai dung dịch đệm khác nhau về nồng độ muối đệm cũng như pH Dung dịch điện di cũng được pha loãng bằng một dung dịch đệm khác, gọi là tank buffer

Ở hệ thống đệm không liên tục, khi bắt đầu điện di các ion và thành phần protein di chuyển trước hết vào lớp stacking gel Các thành phần protein tập trung thành một lớp mỏng giữa các ion dẫn đầu (leading ion) và các ion đi sau (trailing ion), sau đó lớp mỏng protein này được di chuyển dần đến để tiếp cận lớp running gel Chính nhờ vậy mà các thành phần protein được phân giải rất tốt khi di chuyển trong running gel

Hình 2.6 Mô hình gel điện di (SDS - PAGE)

c Phương pháp tiến hành

Chuẩn bị mẫu điện di

Chủng vi khuẩn Streptococcus iniae được nuôi cấy thuần trong môi trường

TSA bổ sung 1,5% NaCl ở 370C trong 24h Sau đó, lấy khuẩn lạc đơn nuôi tăng sinh trong 10 ml môi trường TSB bổ sung 1,5% NaCl lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 24h Hút 40µl dịch vi khuẩn có OD600 = 2,7 sang 1 ml PBS được đựng sẵn trong eppendorf Tiến hành ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút rồi thu cặn và

bỏ dịch Cặn tiếp tục được hòa lại trong 500 µl Mix mutanolysine Mix đều rồi ủ ở

370C trong 2h Sau 2h tiến hành ly tâm tiếp ở 8000 vòng/phút trong 10 phút để thu dịch Hàm lượng protein trong dịch sau ly tâm sẽ được xác định bằng phương pháp Bradford và dịch protein được bảo quản ở -200C đến khi sử dụng