Để tiến tới việc định danh vi khuẩn phân lập ngoài các đặc điểm hình thái
đã thu được chúng tôi tiến hành kiểm tra các đặc điểm sinh hóa của các chủng.
Đầu tiên hai phản ứng catalase và oxidase được tiến hành kiểm tra trên
các đĩa khuẩn lạc thuần. Theo hệ thống phân loại của Bergey vi khuẩn S. iniae
cho phản ứng âm tính với cả hai phản ứng này. Vì vậy, chỉ những chủng phân
lập cho kết quả âm tính với cả hai phản ứng catalase và oxidase sẽ được chọn để kiểm tra tiếp khả năng dung giải máu. Theo hệ thống phân loại của Bergey
S. iniae có khả năng dung huyết α/β. Ngoài ra khi tham khảo các nghiên cứu trước đó cho thấy phản ứng dung huyết α của vi khuẩn Streptococcus iniae
được nói đến trong báo cáo của Bromage và các cộng sự (1999) và Foo và các cộng sự (1985), và phản ứng dung huyết β của S. iniaeđược nhắc đến trong báo
cáo của Perera và các cộng sự (1994) và Pier & Madin (1976) [12], [20]. Như
vậy khả năng dung giải máu của các chủng vi khuẩn trên môi trường thạch máu
BA (Blood agar base) có bổ sung 5% máu cừu sẽ cho phép sàng lọc tiếp các
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang
Hình 3.4 Hình dạng khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn Streptococcus iniae phân lập được trên cá chẽm (bên trái – kiểu dung huyết β, bên phải- kiểu dung huyết α)
Sau khi kiểm tra, sàng lọc bằng các phản ứng catalase, oxidase và dung huyết chúng tôi thu được hai chủng vi khuẩn nghi ngờ là CR06 và CR11. Hai chủng này sẽ tiếp tục được kiểm tra các đặc điểm sinh hóa bằng bộ Kit API 20 STREP
(BioMerieux, France). Kết quả kiểm tra các đặc điểm sinh hóa của hai chủng vi
khuẩn được thể hiện trong Bảng 3.1 và Phụ lục 4.
Qua Bảng 3.1 chúng tôi thấy rằng những đặc điểm đặc trưng của hai chủng vi
khuẩn phân lập gồm: vi khuẩn có dạng liên cầu khuẩn, khuẩn lạc nhỏ hơn 2 mm sau 24h nuôi cấy, Gram (+), không có khả năng di động, không sinh trưởng ở điều kiện độ mặn NaCl 6,5%, cho phản ứng catalase và oxidase âm tính, có khả năng dung
huyết α/β. Các đặc điểm này rất giống với đặc điểm sinh hóa của chủng chuẩn S. iniae ATCC 29178 và phù hợp với mô tả của Pier & Madin (1976) về S. iniae [9].
Khi so sánh đặc điểm sinh hóa theo kết quả của bộ kit API 20 STREP của hai
chủng thu được và chủng chuẩn Streptococcus iniae ATCC 29178 cho thấy có sự tương đồng rất cao được thể hiện ở Bảng 3.1. Tất cả các chủng đều âm tính với các
phản ứng Voges Proskauer (VP), Hippurate (HIP), α–Galactosidase (α-GAL), β-
Glucuronidase (β-GUL), β–Galactosidase (β-GAL), Alkalin Phosphatase (PAL), L- arabinose (ARA), D-sorbitol (SOR), D-raffinose, Glycogen (GLYG) và dương tính
với các phản ứng Pyrrolidonyl acrylamidase, Leucine Aminopeptidase (LAP), D- ribose (RIB), D-manitol (MAN), Starch (AMD).
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang
Bảng 3.1 Một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm
Đặc điểm Các chủng phân lập so sánh với chủng chuẩn ATCC 29178 Bergey CR06 CR11 ATCC 29178 Nhuộm Gram + + + + Hình dạng tế bào Cầu, liên cầu Cầu, liên cầu Cầu, liên cầu Cầu, liên cầu Sinh Catalase - - - - Sinh Oxidase - - - - Voges Proskauer (VP) - - - ND
Dung huyết (5% máu cừu) α/β α/β Β α/β
Môi trường BHIA + + +
TSA + + + TSB + + + BA + + + Nhiệt độ sinh trưởng 100C - - - - 270C + + + + 350C + + + + NaCl 6,5% - - - - Hippurate (HIP) - - - - Esculin (ESC) + + + + Pyrrolidonyl acrylamidase + + + ND α–Galactosidase (α-GAL) - - - ND β-Glucuronidase (β-GUL) - - - ND β – Galactosidase (β-GAL) - - -
Alkalin Phosphatase (PAL) - - - ND
Leucine Aminopeptidase (LAP) + + + +
L-arginie (ADH) - - + ND D-ribose (RIB) + + + ND L-arabibose (ARA) - - - D-manitol (MAN) + + + + D-sorbitol (SOR) - - - - D-lactase - - - - D-trehalose + - + + Inulin - - - - D-raffinose - - - - Starch (AMD) + + + Glycogen (GLYG) - - -
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang Sự khác nhau giữa các chủng được thể hiện ở 2 phản ứng L-arginine dihydrolase (ADH) và D-trehalose. Đối với phản ứng L-arginine dihydrolase, hai chủng phân lập CR06 và CR11 cho kết quả âm tính trong khi đó chủng chuẩn cho
kết quả dương tính. Trong hệ thống phân loại của Bergey, thì phản ứng ADH không
được kiểm tra tuy nhiên khi tham khảo nghiên cứu của Barnes & Ellis (2003) có báo cáo rằngS. iniae phân lập từ các địa điểm khác nhau ở Mỹ có thể cho phản ứng dương tính hoặc âm tính với ADH hoặc cũng có thể cho phản ứng trung tính với
ADH không nhất thiết phải là một dạng phản ứng, và phản ứng âm tính với ADH
được coi là một dạng biến thể của S. iniae. Dựa vào phản ứng với ADH thì Barnes & Ellis (2003) đưa ra phân loại S. iniae theo phản ứng huyết thanh thành 2 nhóm serotype I và serotype II, với serotype I là S. iniae cho phản ứng dương tính với L- arginine dihydrolase và serotype II là S. iniae cho phản ứng âm tính với L-arginine dihydrolase [5]. Hai phản ứng huyết thanh học của S. iniae cũng được Pier và các cộng sự (1978) nói đến [9]. Phản ứng âm tính của S. iniae với L-arginine dihydrolase cũng đã được Susanna và các cộng sự (2002) báo cáo [18].
Như vậy, dựa vào phản ứng L-arginine dihydrolase các chủng vi khuẩn phân lập được chia thành 2 nhóm: Chủng CR06 và chủng CR11 được xếp vào nhóm vi khuẩn S. iniae serotype II trong khi chủng chuẩn ATCC 29178 được xếp vào nhóm vi khuẩn S. iniae serotype I.
Với phản ứng D - trehalose, chủng CR06 và chủng chuẩn cho phản ứng dương tính với D - trehalose, kết quả này tương tự trong hệ thống phân loại của
Bergey. Tuy nhiên, chủng CR11 cho phản ứng âm tính với D - trehalose, kết quả
này cũng đã được thông báo trước đó bởi Kusuda và các cộng sự (1976) [9].
Chúng tôi cũng đã tiến hành định danh vi khuẩn bằng phần mềm định danh vi
khuẩn API dựa trên các kết quả của test sinh hóa. Tuy nhiên, việc định danh hai
chủng vi khuẩn bằng phần mềm định danh này không thành công (unceptable profile). Khi tham khảo các tài liệu khác, chúng tôi thấy rằng Suanyuk và các cộng sự
(2010) và Lau và các cộng sự (2002) cũng thông báo rằng, không thành công trong việc định danh vi khuẩn Streptococcus iniae bằng phần mềm định danh vi khuẩn API
GVHD: ThS. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Ngô Thị Giang 20 STREP, nguyên nhân có thể do cơ sở dữ liệu của phần mềm này chưa được cập
nhật [14], [19].
Kết quả định danh các chủng vi khuẩn phân lập bằng phần mềm ABIS trực
tuyến cho thấy chủng vi khuẩn CR06 tương đồng với S. iniae (79%) và CR11 tương đồng với S. iniae (75%). Ngoài ra, khi đối chiếu các đặc điểm sinh hóa của chủng
chuẩn S. iniae ATCC 29178 và hệ thống phân loại Bergey thì cả hai chủng CR06 và CR11 đều mang những đặc điểm của S. iniae. Để khẳng định kết quả định danh
chúng tôi tiếp tục định danh các chủng CR06 và CR11 bằng phương pháp giải trình tự gen 16S - rDNA.